质粒DNA纯化从质粒DNA制品中去除RNA
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发布时间：2024-12-20 15:08
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时间：2024-12-20 20:56
为了从质粒DNA制品中去除RNA，确保在使用过程中无RNA污染，需通过特定方法实现这一目标。尤其在使用特定酶如BAL31进行活化或利用T4噬菌体多核苷酸激酶标记质粒DNA切片段的5'端时，纯净的DNA制品至关重要。
在准备质粒DNA后，首先使用等体积的TE(pH8.0)平衡后的酚抽提进行一步提取。接着，将最多1ml的水相铺在经TE(pH8.0)和0.1%SDS平衡的Bio-Gel A-150m或Sepharase CL-4B(1x10cm)柱上，进行层析操作。在此过程中，DNA被装入层柱，并在柱的上部连接上含0.1%SDS的TE(pH8.0)的贮液瓶，开始以0.5ml流出液为1流进行收集。
在收集到15份时，关闭柱底部。为评估质粒DNA的分布情况，可取每份收集物中的10μg样品，通过0.7%琼脂糖凝胶电泳或溴化乙锭荧光进行分析。然后，将含有质粒DNA的组成合并，并加入2倍体积的乙醇在4℃沉淀10min。之后，以4℃大于10 000rpm离心15min，以回收纯净的DNA。
通过上述方法，从质粒制品中有效去除RNA，确保DNA制品的纯净度。这一过程不仅有助于提升后续实验的准确性，还能避免潜在的实验干扰，确保实验结果的可靠性。
综上所述，去除质粒DNA制品中的RNA，是保证实验顺利进行的关键步骤。通过特定的层析技术，结合后续的提取、沉淀和离心操作，能够有效实现这一目标，为后续的科学研究提供纯净的DNA资源。
扩展资料
大量提取的质粒DNA一般需进一步纯化，常用柱层析法和氯化铯梯度离心法。常使用的所有纯化方法都利用了质粒DNA 相对较小及共价闭合环状这样两个性质。例如，用氯化铯－溴化乙锭梯度平衡离心分离质粒和染色体DNA 就取决于溴化乙锭与线状以及与闭环DNA分子的结合量有所不同。
