第二十章 免疫检验自动化仪器分析
第一节 自动化免疫浊度分析系统
免疫浊度分析属液相沉淀试验，其基本原理是抗原、抗体在特定的电解质溶液中反应，形成小分子免疫复合物（＜19S），在增浊剂（如PEG 、NaF等）的作用下，迅速形成免疫复合物微粒（＞19S），使反应液出现浊度。
根据检测器的位置及其所检测的光信号性质不同，免疫浊度分析可分为免疫透射比浊法（turbi-dimetry）和免疫散射比浊法（nephelometry）。
一、免疫透射比浊法 （一）原理
可溶性抗原抗体反应后形成的免疫复合物，使介质浊度发生改变，光线通过抗原抗体反应后的溶液时，被其中的免疫复合物微粒吸收，在保持抗体过量的情况下，吸光度（A值）与免疫复合物量呈正相关。与已知浓度的抗原标准品相比较，可确定标本中抗原的含量。 （二）仪器工作过程
1.将待检标本和抗原参考品作适当稀释。
2.将待测标本和标准抗原溶液（5个浓度抗原标准品）与适当过量的抗血清混合，在一定条件下，抗原抗体反应完成后，在340nm处测定各管吸光度。
3.按方程进行曲线拟合，制备剂量-反应曲线，由计算机处理，计算出抗原浓度。 （三）方法评价
透射比浊法灵敏度比单扩法高5～10倍，CV小于10%，操作简便，结果准确，且能用全自动或半全自动生化分析仪进行检测，常用于生化指标的测定。 本法的不足在于： ①抗体用量较大 ②灵敏度较散射比浊法低 ③耗时较长
二、免疫胶乳比浊法
用抗体致敏的大小适中、均匀一致的胶乳颗粒，在遇到相应抗原时，胶乳颗粒上的抗体与抗原特异结合，引起胶乳颗粒凝聚。分散的单个胶乳颗粒直径位于入射光波长之内，不阻碍光线通过，当2个或2个以上胶乳颗粒凝聚时，透射光和散射光即出现显著变化。抗原-抗体反应后溶液的吸光度或散射光强度与待测抗原浓度呈正相关。采用透射比浊法或散射比浊法测定。 （二）方法评价
本法敏感度大大高于普通比浊法，可达ng／L水平，操作简便，易自动化；血清中的类风湿因子（RF）可与IgG Fc段结合，使IgG致敏胶乳颗粒出现非特异性凝集，用F（ab’）2片段代替IgG既可消除此干扰，又可克服IgG致敏胶的自凝现象；免疫胶乳轻度自凝或抗体活性降低会严重影响结果。
三、免疫散射比浊法 （一）原理
溶液中的微粒受到光线照射后，微粒对光线产生反射和折射而形成散射光。悬浮微粒对光散射形成的散射光强度与微粒的大小、数量、入射光的波长和强度、测量角度等因素密切相关。
不同大小微粒形成的散射光分布不同。当颗粒直径小于入射光波长的1／10时，散射光强度在各个方向的分布均匀一致，称为Rayleigh散射；当粒径大于入射光波长的1／10到接近入射光波长时，随着颗粒直径增大，向前散射光强于向后散射光，称为Debye散射；当颗粒直径等于或大于入射光波长时，向前散射光远远大于向后散射光，称为Mile散射。 （二）定时散射比浊法
定时散射比浊法是在保证抗体过量的情况下，加入待测抗原，此时反应立即开始，在反应的第一阶段，溶液中产生的散射光信号波动较大，所获取的信号计算出的结果会产生一定的误差。 1.仪器测定技术要点 （1）抗原抗体预反应阶段。
（2）反应阶段：加入全量标本，在4分钟内测量散射光信号。
（3）信号检测：将获得的信号值 ，经计算机处理转换为待测抗原浓度。
2.抗原过量检测为保证检测时所获取的信号峰值是由被检抗原产生的，应使所有未知抗原全部与抗体结合形成抗原-抗体复合物，在本方法中采用了两项保证措施： （1）抗体过量。
（2）对抗原过量进行阈值限定。 （三）速率散射比浊法
速率散射比浊法是抗原抗体结合反应的动力学测定法
速率是指抗原抗体反应在单位时间内形成免疫复合物的量（不是免疫复合物累积的量），连续测定各单位时间内复合物形成的速率与其产生的散射光信号联系在一起，形成动态的速率散射比浊法，每项检测仅1～2分钟即可完成。
选取速率最大，且与被测物浓度变化呈线性关系的速率峰值，制作剂量-反应曲线，通过计算机计算可获得被测物浓度的量。 仪器测定技术要点： （1）开启机器，进行定标。 （2）反应阶段。 （3）抗原过量检测。 （四）方法评价
散射比浊法是目前临床应用较多的一种方法，本法自动化程度高，具有快速、灵敏、准确、精密等优点。采用抗原过量检测方法，保证了结果的准确性。但仪器和试剂价格比较贵，对抗体的质量要求很高。
四、免疫比浊分析的影响因素和临床应用 （一）免疫比浊分析的影响因素 1.抗原抗体比例 2.抗体的质量 3.增浊剂的使用
4.伪浊度 非抗原抗体特异性结合形成的浊度，称为伪浊度，可导致抗原检测结果假性升高。伪浊度形成的原因包括：①混浊标本、高血脂标本、反复冻融标本；②抗体效价低（＜1：20）、抗血清灭活处理、抗血清含有交叉反应性抗体等；③增浊剂PEG浓度过高；④抗血清细菌污染和变质；⑤器材尤其是比色杯不清洁、尘埃污染等；⑥缓冲液的离子强度太高，pH和温度不适合等，都对浊度产生影响。 5.入射光光源和波长 6.结果报告中的计量单位
7.标准曲线制备与质量控制 应用仪器规定的标准品制备剂量-反应曲线，一般采用5点或6点定标，
然后选择适当的数学方法进行曲线拟合；每更换一批试剂，应重新制备剂量-反应曲线。为保证结果准确可靠，选取合适的质控血清，每次开机进行室内质量控制是极其必要的。 （二）临床应用
免疫比浊分析法主要用于检测血浆、体液中的特定蛋白系列。
特定蛋白成分的定量检测，可为临床诊断、疗效观察、预后分析提供依据。
第二节 自动化发光免疫分析系统
自动化发光免疫分析仪主要由样本盘、试剂盘（盒）、温育反应系统、固相载体分离清洗系统、信号检测系统和计算机数据处理、控制系统组成。
一、吖啶酯标记化学发光免疫分析仪
吖啶酯标记的化学发光免疫分析仪是一种用发光剂直接标记抗体或抗原的一类免疫分析法。该仪器利用化学发光技术和磁性微粒子分离技术，以吖啶酯为化学发光剂，以细小的顺磁性微粒为固相载体。 其测定原理与双抗体夹心法、双抗原夹心法和竞争结合法等相同。 仪器测定技术要点： （1）抗原抗体结合。 （2）洗涤、分离。 （3）加入氧化剂发光。 （4）信号检测。
二、酶联发光免疫分析仪
酶联发光免疫分析仪是用参与催化某一化学发光或荧光反应的酶来标记抗原或抗体，在抗原抗体反应后，加入底物（发光剂），由酶催化和分解底物发光，通过光信号的强弱来进行被测物的定量。常用的标记酶有辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶（ALP），常用的发光底物有鲁米诺、AMPPD和4-MUP。 （一）辣根过氧化物酶标记的化学发光免疫分析仪
该仪器采用辣根过氧化物酶（HRP）标记抗原或抗体、以塑料锥形小管为固相载体，鲁米诺为化学发光剂，还利用增强剂使化学发光强度增加、时间延长。 仪器测定技术要点： （1）抗原抗体结合。 （2）洗涤、分离。
（3）加入信号试剂A和氧化剂B。 （4）信号检测。
（二）碱性磷酸酶标记的化学发光免疫分析仪
该仪器是以碱性磷酸酶标记抗原或抗体，以顺磁性微粒子为固相载体，用AMPPD作为化学发光剂进行测定的自动化仪器。这种化学发光剂发光稳定，持续时间可达几十分钟，容易测定，容易控制。 仪器测定技术要点： （1）抗原抗体结合。 （2）洗涤、分离。 （3）加入AMPPD发光剂。 （4）信号检测。
（三）碱性磷酸酶标记的微粒子荧光免疫分析仪
该仪器以碱性磷酸酶标记抗原或抗体，以塑料微粒为固相载体包被抗体（或抗原），以4-甲基伞型酮
磷酸盐（4-MUP）作为酶促反应的荧光基质（底物），底物被酶水解后，脱磷酸根基团，形成4-甲基伞型酮（4-MU），用360nm激发光照射，发出450nm的荧光。 仪器测定技术要点： （1）抗原抗体结合。 （2）洗涤、分离。 （3）加入底物4-MUP。 （4）信号检测。
三、电化学发光免疫分析仪
一种在电极表面由电化学引发的特异性化学发光反应，它包括电化学和化学发光两个过程。 电化学发光免疫分析仪是采用电化学发光技术、生物素放大技术，以顺磁性微粒为固相载体，用三联吡啶钉标记抗原或抗体，三丙胺（TPA）为电子供体 ，而设计的一种自动化分析仪器。 仪器测定技术要点： （1）抗原抗体结合。 （2）电化学发光反应。 （3）光信号检测。 （4）检测完毕。
四、在临床免疫检测中的应用
目前自动发光免疫分析系统都是采用将发光技术与免疫反应和计算机技术完美结合的自动化仪器分析。可用于内分泌激素类、肿瘤标志物类、心肌标志物类、病毒标志物类、治疗性药物浓度、骨代谢指标和贫血类等方面的检测，是目前免疫化学应用最为广泛的新技术。
第三节 自动化荧光免疫分析系统
荧光免疫自动化分析主要是将抗原抗体结合反应与荧光物质发光分析和计算机技术有机结合的一项自动化免疫分析技术。
荧光免疫自动化分析仪包括样本盘、试剂盘（盒）、条码识别系统、仪器控制系统、信号检测系统、数据处理系统，能自动进行加样、温育、洗涤、分离、荧光强度测定和报告打印等功能。 根据抗原抗体反应后是否需要进行固相分离，分为均相和非均相两类。 非均相荧光免疫测定主要有时间分辨荧光免疫测定法。 均相荧光免疫测定主要有荧光偏振免疫测定法。
一、时间分辨荧光免疫分析仪
时间分辨荧光免疫测定（TRFIA）是以镧系元素标记抗原或抗体作为示踪物，并与时间分辨测定技术相结合，建立起来的一种新型非放射性微量分析技术，具有灵敏度高，镧系元素发光稳定，荧光寿命长，不受样品自然荧光干扰，标准曲线范围宽等特点，已在临床实验室广泛应用。 （一）原理
镧系元素中Eu最为常用。它的激发光谱带较宽（波长为300～350nm），发射光谱带窄（多在613nm±10nm），在此波段内，来自生物样品的荧光干扰少。激发光谱和发射光谱之间的Stokes位移大，约为270nm，能有效地把激发光和发射的荧光分开。 （二）仪器测定技术要点以双抗体夹心法为例 1.抗原抗体结合
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2.加入Eu螯合抗体 3.加入酸性增强液 4.信号检测 （三）解离增强原理
被镧系元素标记的抗体或抗原形成的如铕标记抗原-抗体复合物在弱碱性反应液中经激发后的荧光信号较弱，必须再加入一种增强液，使Eu-抗体-抗原复合物的pH降低至2～3，以利于Eu从复合物上完全解离下来。 （四）注意事项
1.TRFIA分析用的酸性增强液易受环境、试剂、容器等里面的镧系元素污染，使本底升高 ，所用试剂和器材应尽量防尘。
2.TRFIA分析用载体最常用的是聚苯乙烯微96孔板，其荧光本底低，并有洗涤微孔板的自动装置，但不同厂家生产的微孔板，所产生的荧光有很大差异，应选择应用。
二、荧光偏振免疫分析仪
荧光偏振免疫测定（FPIA）为一种均相荧光免疫测定方法，其利用荧光物质在溶液中被单一平面的偏振光（波长485nm）照射后，可吸收光能而产生另一单一平面的偏振发射荧光（波长525nm），该荧光强度与荧光标志物质在溶液中旋转的速度与分子大小成反比，常采用抗原抗体竞争反应原理，适用于小分子半抗原（如药物浓度）的检测。 （一）原理
偏振荧光强度与荧光物质分子在液相中转动的速度成反比，即分子大，转动速度慢，荧光强度大；分子小，转动速度快，荧光强度小。
依据荧光素标记抗原和抗体竞争结合物之间偏振荧光强度的差异，用竞争法可直接测定溶液内小分子药物的含量。
（二）仪器测定技术要点 1.抗原抗体结合。 2.偏振荧光强度测定。 （三）注意事项
1.FPIA的结果好坏取决于荧光素标记的好坏、激发态荧光的平均寿命、抗原的相对分子量和复合物的特性等因素。
2.为提高FPIA灵敏度，可用除蛋白剂对标本进行预处理，去除干扰成分。
第四节 自动化酶联免疫分析系统
（一）仪器组成和性能 1.条形码识别系统 2.样本架和加样系统 3.试剂架 4.温育系统 5.液路系统 6.洗板系统 7.酶标板读数仪 8.自动装载传递系统 9.计算机管理和信息系统
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（二）仪器评价
全自动酶联免疫分析仪中的连体机是将样本处理工作站和全自动酶联免疫分析仪联合起来，工作速度快，自动化程度高，适合大批量样本的处理，如血站系统。
分体机，由于它有一个独立的全自动样本处理站，加样速度快，适合试验项目变化多、样本批量不等的临床实验室。
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