第４４卷第５期 ２０１３年５月 网络出版时间２０１３－５－２９ １６：００：３４ 一东北农业大学学报 ４４（５）：３６－４１ Ｍａｖ２０１３ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｏｒｔｈｅａｓｔ Ａ ｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ［ＵＲＬ］ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｎｋｉ．ｎｅｔ／ｋｃｍｓ／ｄｅｔａｉｌ／２３．１３９１．Ｓ．２０１３０５２９．１６００．０１３．ｈｔｍｌ 种适于枯草芽孢杆菌总ＲＮＡ提取的改良方法 徐速 ，徐香玲 １５００２５） （１．东北农业大学食品学院，哈尔滨１５００３０；２．哈尔滨师范大学生命科学与技术学院，哈尔滨摘要：枯草芽孢杆菌分泌多种胞外酶，采用普通试剂盒提取方法难获得完整、有效的ＲＮＡ。在ＲＮＡ试剂盒 提取法的基础上，通过增加ＤＥＰＣ水洗涤茵体、溶菌酶裂解细胞、液氮冷冻预处理及调整ＲＮＡ提取试剂添加比例 等处理，可得到完整性良好的ＲＮＡ。电泳检测结果表明，所获ＲＮＡ条带清晰完整，无降解现象；提取的ＲＮＡ可 满足ＲＴ—ＰＣＲ要求。 关键词：枯草芽孢杆菌总ＲＮＡ；提取；方法改良 中图分类号：Ｑ９３６ 文献标志码：Ａ 文章编号：１００５—９３６９（２０１３）０５－００３６－０６ 徐速，徐香玲．一种适于枯草芽孢杆菌总ＲＮＡ提取的改良方法［Ｊ］．东北农业大学学报，２０１３，４４（５）：３６４１． Ｘｕ Ｓｕ．Ｘｕ Ｘｉａｎｇｌｉｎｇ．Ａｎ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｍｅｔｈｏｄ ｓｕｉｔａｂｌｅ ｆｏｒ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｏｔａｌ ＲＮＡ ｆｒ０ｍ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉ／ｉｓ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｏ￣ｈｅａｓｔ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，２０１ ３，４４（５）：３６４１．（ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ ｗｉｔｈ Ｅｎｇｌｉｓｈ ａｂｓｔｒａｃｔ） Ａｎ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｍｅｔｈｏｄ ｓｕｉｔａｂｌｅ ｆｏｒ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｏｔａｌ ＲＮＡ ｆｒＯｍ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ／ｘｕ Ｓｕ’，ｘｕ Ｘｉａｎｇｌｉｎｇ （１．Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｏｒｔｈｅａｓｔ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈａｒ－ ｂｉｎ １ ５００３０，Ｃｈｉｎａ；２．Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｈａｒｂｉｎ Ｎｏｒｍａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈａｒｂｉｎ １ ５００２５，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｃａｎ ｓｅｃｒｅｔｅ ｌｏｔｓ ｏｆ ｅｘｔｒａ．ｃｅｌｌｕｌａｒ ｅｎｚｙｍｅｓ．Ｆｕｌｌ ｔｏｔａＩ ＲＮＡ ｉＳ ｈａｒｄｌｙ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｂＶ ｔｈｅ ｇｅｎｅｒａＩ ｔｏｔａｌ ＲＮＡ ｋｉｔ ｍｅｔｈｏｄ．Ｏｎ ｔｈｅ ｂａｓｅ ｏｆ ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ｔｏｔａｌ ＲＮＡ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ，ｆｕｌｌ ｔｏｔａｌ ＲＮＡ ｍａｙ ｂｅ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｗｈｉｌｅ ｗａｓｈｉｎｇ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ＤＥＰＣ ｗａｔｅｒ，ｓｐｌｉｔｔｉｎｇ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ｌｙｓｏｚｙｍｅ，ｐｒｅｔｒｅａｔｉｎｇ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ｌｉｑｕｉｄ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ａｎｄ ａｄｊｕｓｔｉｎｇ ｔｈｅ ｖｏｌｕｍｅ ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＲＮＡ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔ．Ｔｈｅ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ＲＮＡ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｗａｓ ｆｕｌ１ ｗｉｔｈｏｕｔ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ．Ｔｈｅ ＲＮＡ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｕｓｅｄ ｆｏｒ ＲＴ－ＰＣＲ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｔｏｔａｌ ＲＮＡ ｆｒｌ０ｍ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ；ｅｘｔｒａｃｔ：ｍｅｔｈｏｄ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ＲＮＡ提取可用于ｅＤＮＡ文库的构建、ＲＴ— 酶、蛋白酶、青霉素酶、核酸酶、磷酸酯酶、脂 ＰＣＲ、Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交、芯片杂交等研究，获得完整 ＲＮＡ是进行上述基因表达研究的基础条件 】。在原 核生物中，细胞ＲＮＡ主要包括ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、 ｍＲＮＡ ３种形式，其中ｒＲＮＡ约占细胞８０％，ｔＲＮＡ 约占ｌ０％～ｌ５％，ｍＲＮＡ约占１％一５％，而ｒＲＮＡ又 酶、磷脂酶ｃ、硫胺素酶及溶菌酶等物质［４１，属内 枯草芽孢杆菌分泌的酶量大、种类多，甚至种内 不同菌株间也存在差异。对于分泌核酸酶量大尤 其是分泌ＲＮａｓｅ的菌株，采用常规ＲＮＡ试剂盒提 取并不能得到理想的ＲＮＡ制品。针对枯草芽孢杆 菌分泌酶种类多、酶量大的特点，通过增加 ＤＥＰＣ水洗涤菌体、溶菌酶裂解细胞、液氮冷冻 预处理及调整ＲＮＡ提取试剂添加比例等处理，提 分为２３Ｓ ＲＮＡ、１６Ｓ ＲＮＡ和５Ｓ ＲＮＡ三种类型翻。 ＲＮＡ提取的关键环节是防止ＲＮａｓｅ污染 】。芽孢 杆菌属内多数种都能向胞外分泌多种酶，如淀粉 收稿日期：２０１２—０６—１５ 基金项目：东北农业大学博士启动基金项Ｉ￣（２０１０ＲＣＢ） 作者简介：徐速（１９６８一），女，教授级高级工程师，博士，研究方向为食品与生物工程。Ｅ－ｍａｉｌ：ｓｕｃｃｅｓｓ３３２０＠ｓｉｎａ．ｃｏｎｒ 第５期 徐速等：一种适于枯草芽孢杆菌总ＲＮＡ提取的改良方法 取到菌体细胞完整的总ＲＮＡ，电泳结果显示ＲＮＡ 条带无降解现象，提取的ＲＮＡ可满足ＲＴ—ＰＣＲ要 求。 ７０％乙醇，轻轻上下颠倒３～５次，１２ ０００ ｒ・ｍｉｎ １ ｍｉｎ，取沉淀；室温抽干３～５ ｍｉｎ即可；灭菌 ０．１％ＤＥＰＣ水１５～３Ｏ 溶解，一８０℃存放。 １．２．２ ＲＮＡ电泳［ １ １ 材料与方法 １．１材料 对提取的ＲＮＡ进行０．８％琼脂糖凝胶电泳检测。 １．２．３反转录合成ｃＤＮＡ第一条链：采用反转录试 剂盒 １．１．１菌株 Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＺＪ０６由本实验室保存。 １．１．２引物合成 反转录反应体系：总体积２０ ｔｘＬ，ＭｇＣ１：，２５ ｍｍｏｌ・Ｌ～４ ＩｘＬ，反转录１０ｘｂｕｆｆｅｒ ２ Ｌ，ｄＮＴＰ混 由上海生工完成。 １．１．３试剂盒、工具酶 生工上海有限公司ＵＮＩＱ柱式ＤＮＡ回收纯化试 剂盒，宝生物ＲＮＡｉｓｏ提取试剂盒，Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ反转录试剂盒＃Ａ３５００，ＤＮＡ回收试剂 盒、Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶、ｄＮＴＰ、Ｔ４ＤＮＡ连接酶、 ＲＮａｓｅＡ、克隆载体ｐＭＤ１８一Ｔ、Ｅ．ｃｏｌｉ．ＪＭ１０９等购自 ＴａＫａＲａ公司。 １．２方法 １．２．１枯草芽孢杆菌总ＲＮＡ的提取 ①菌体培养：将Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＺＪ０６斜面菌体 接人ＣＭ液体培养基中，３０℃１６ ｈ后，无菌条件下 １％接种量接入适当培养基中，３０ 培养菌液至一 定时间，取１ ｍＬ菌液于１．５ ｍＬ Ｅｐｐｅｎｄｏｆ管中， １０ ０００ ｒ・ｍｉｎ－ ４℃离心１ ｍｉｎ，取菌体沉淀。 ②菌体预处理：用灭菌０．１％ＤＥＰＣ水１ ｍＬ・次 洗涤菌体，用枪头充分打散洗涤菌体后，１０ ０００ ｔ・ｍｉｎ ４℃离心１ ｍｉｎ，取菌体沉淀。再重复上述 处理１次。 ③溶菌酶处理菌体：向上述菌体沉淀中加入 １ ｍＬ灭菌０．１％ＤＥＰＣ水，混匀，再加入灭菌０．１％ ＤＥＰＣ水配制的溶菌酶溶液至终浓度２ ｍｇ・ｍＬ－ ，３７℃ ３０ ｍｉｎ，１０ ０００ ｒ・ｍｉｎ ４℃１ ｍｉｎ离心，取 沉：淀。 ④液氮处理菌体：将上述１．５ ｍＬ Ｅｐｐｅｎｄｏｆｆ管 置液氮中冷冻２—３ ｍｉｎ。 ⑤ＲＮＡｉｓｏ试剂盒法提取细胞总ＲＮＡ：将上述 冷冻Ｅｐｐｅｎｄｏｆ管取出后置冰浴上，立即加入１ ｍＬ ＲＮＡｉｓｏ试剂（若菌液ＯＤ较大，可适当增加ＲＮＡｉｓｏ 试剂用量倍数），用枪头充分打散菌体，室温放置 ５—１０ ｍｉｎ。加入０．２ ｍＬ氯仿，剧烈振荡，冰浴上放 置５ ｍｉｎ；１２ ０００ ｒ・ｍｉｎ～１５ ｍｉｎ，取上清；加入等 体积异丙醇，轻轻上下颠倒３～５次，冰浴上放置 １０ ｍｉｎ；１２ ０００ ｒ・ｍｉｎ １０ ｍｉｎ取沉淀；加入１ ｍＬ 合物，１０ ｍｍｏｌ・Ｌ～２ ＩｘＬ，重组核糖核酸酶抑制剂 ０．５ ＩｘＬ，ＡＭＷ反转录酶（高浓度）１５ ｕ，随机引物 ０．５ ｎｇ，总ＲＮＡ １ ｇ，无核酸酶水补充。 反转录反应程序：室温放置１０ ｍｉｎ，然后 ４２℃保温６０ ｍｉｎ，９５℃加热样品５ ｍｉｎ，再置于 ４℃放置１５ ａｒｉｎ，一２０℃备用。 １．２．４ ＲＴ—ＰＣＲ扩增目的片段［６１ ①反应体系：总体积２５ ，反转录产物（模 版）１ ＩｘＬ１０ｘＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ ２．５ ＩｘＬ，ｄＮＴＰ（２．５ ｍｍｏｌ・Ｌ １ ２ Ｌ，弓Ｉ物１（２０ ｔｒｍｏｌ・Ｌ『 ）０．５ Ｌ，弓Ｉ物２（２Ｏ ｐ．ｍｏｌ・Ｌ－ ）０．５ Ｌ Ｔａｑ酶（５ Ｕ・ Ｌ ）０．２５ Ｌ， ｄｄＨ２Ｏ１８．２５ Ｌ。 ②反应参数９４℃预变性５ ｍｉｎ；９４℃变性 １ ｍｉｎ，５４℃退火３０ Ｓ，７２℃延伸１ ｍｉｎ，循环３０ 次；７２℃延伸１０ ｍｉｎ。取ＰＣＲ产物Ｏ．８％琼脂糖凝 胶电泳分析。 ③ＲＴ—ＰＣＲ阴性对照将提取的总ＲＮＡ以无 ＤＮＡａｓｅ的ＲＮａｓｅ处理后，按上述反转录方法进行 反转录，以此反转录产物为模版进行ＲＴ—ＰＣＲ，验 证反转录产物有无基因组ＤＮＡ污染。 ④ＲＴ—ＰＣＴ产物检测：将ＲＴ—ＰＣＴ扩增得到的 目的片段经胶回收试剂盒回收后，克隆至 ｐＭＤ１８一Ｔ载体，转化大肠杆菌感受态ＪＭ１０９后， 送至测序以验证目的片段的正确性。 １．２．５ Ｎ—ＰＣＲ扩增目的片段 将上述ＲＴ—ＰＣＲ扩增产物稀释１００倍，作为此 轮Ｎ—ＰＣＲ模版，以下列引物ＮＰ上、ＮＰ下进行第２ 轮Ｎ—ＰＣＲ扩增。ＮＰ上：５’ＡＧＡＡＧＡＴＣＡＣＧ Ｉ＇ＡＧＣＡ ＣＡＴＧ ３’；ＮＰｖ：５’ＡＡＣＧＴＣＣＡＴＡＴＴＧ１ＹＩＴＩ’ＧＣＧ ３’。 ①反应体系 总体积２５ Ｌ，第１轮ＰＣＲ产物（１００ｘ）１ Ｌ， １０ｘＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ ２．５ ＩｘＬ，ｄＮＴＰ（２．５ ｍｍｏｌ・Ｌ－ ）２ ＩｘＬ， ＮＰ上（２０ Ｉ￣ｍｏｌ・Ｌ－ ）０．５１ｘＬ，ＮＰ下（２０ ｐ￣ｍｏｌ・Ｌ ）０．５ 第５期 徐速等：一种适于枯草芽孢杆菌 ￣，ＲＮＡ提取的改良方法 上，重点防止实验材料枯草芽孢杆菌菌体细胞本 件温和，裂解效果完全，更有利于ＲＮＡ的释放。 身带来的内源性污染。 本试验采用的若干预处理方法为解决内源性 常用细菌ＲＮＡ提取方法主要有ＴＲＩＺＯＬ试剂提 ＲＮＡａｓｅ污染问题提供了行之有效的方法。 取法、ＳＤＳ—Ｐｈｅｎｏｌ法、ＣＴＡＢ法等 ２】，无论哪一种 针对枯草芽孢杆菌胞外分泌酶量种类多、含 方法均基于裂解菌体细胞、蛋白变性、核酸与多 量大的特点，本试验在ＲＮＡ试剂盒提取法的基础 糖、蛋白、脂类、ＤＮＡ等成分分离的原理。菌体 上，通过增加ＤＥＰＣ水洗涤菌体、溶菌酶裂解细 细胞常用异硫氰酸胍、盐酸胍、饱和酚、ＳＤＳ、 胞、液氮冷冻预处理及调整ＲＮＡ提取试剂添加比 ＣＴＡＢ等裂解变性，在ＲＮＡａｓｅ抑制剂 一巯基乙醇 例等处理，得到了完整性良好的ＲＮＡ。电泳检测 等配合下，经氯仿抽提，异丙醇沉淀获得ＲＮＡ纯 结果，所获ＲＮＡ条带清晰完整，无降解现象；提 品 ｌ。目前有些ＲＮＡ提取试剂盒就是基于上述原理 取的ＲＮＡ可满足ＲＴ—ＰＣＲ要求。 设计的。试剂盒提取法因操作简单效果明显而受到 关注。试剂盒提取ＲＮＡ因厂家不同，所用方法不 【参考文献】 同，相应成本和适用范围随之也不同。曹建斌通过 试验认为，Ｏｌｉｇｏｔｅｘ Ｄｉｒｅｃｔ ｍＲＮＡ Ｍｉｃｒｏ Ｋｉｔ试剂盒 【１】张维铭主编．现代分子生物学实验手册［Ｍ１．２版．北京：科学出 直接提取ｍＲＮＡ，产物纯度较高，可立即用于生物 版社，２００７：８９—９３． 下游技术；ＥＺ Ｓｐｉｎ Ｃｏｌｕｍｎ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡＭｉｎｉ ｐｒｅｐｓ ［２】 Ｒａｌｐｈ Ａ，Ｓｌｅｐｃｋｙ，Ｈ Ｅｋｎｅｓｔ Ｈｅｍｐｈｉｌ１．Ｔｈｅ Ｇｅｎｕｓ Ｂａｃｉｌｌｕｓ－ Ｓｕｐｅｒ Ｋｉｔ和ＲＮＡｉｓｏ Ｐｌｕｓ试剂盒适宜提取总ＲＮＡ， Ｎｏｎｍｅｄｉｃａｌ［Ｊ］Ｐｒｏｋａｒｙｏｔｅ，２００６（４）：５３０—５６０． 前者适合小量检测，后者用于大量提 。选择试剂 ［３】曹建斌．ＲＮＡ的提取及３种ＲＮＡ提取试剂盒的比较［Ｊ１．科技情 盒提取方法主要依据是提取量大、成本较低、时间 报开发与经济，２００８，１８（１０）：２０６—２０７． 短、操作方便等，因此本试验选择ＲＮＡｉｓｏ试剂盒。 【４】孙乃恩，孙东旭，朱德煦．分子遗传学［Ｍ】．南京：南京大学出版 与真核生物细胞相比，原核生物细菌ＲＮＡ的 社．２００４． 含量少、半衰期短、易降解ｎ 。枯草芽孢杆菌拥 【５】Ｊ萨姆布鲁克，Ｅ Ｆ弗里奇，Ｔ曼尼阿蒂斯．分子克隆实验指南 有强大的蛋白质外泌系统，其产生的内源性ＲＮＡ 【Ｍ】．２版．北京：科学出版社，１９９２． 酶更加大了ＲＮＡ提取的难度，本试验单纯采用常 ［６】储卫华，陆承平．嗜水气单胞菌Ｊ－１株丝氨酸蛋白酶基因克隆 规试剂盒提取ＲＮＡ，很难达到理想效果。为了减 与序列分析［Ｊ】．水产学报，２００４（２）：８４－８８． 少和去除枯草芽孢杆菌菌体内源性ＲＮＡａｓｅ的影 【７】宗成志，左欣欣，严海燕．影响ＲＮＡ提取质量的因素分析【Ｊ】．广 响，采用灭菌０．Ｉ％ＤＥＰＣ水洗涤菌体以稀释去除菌 西农学报，２０１ １，２６（１）：３１－３４． 体外泌内源性ＲＮＡａｓｅ；为了增加提取ＲＮＡ的浓 ［８］孙映雪，孙成英，赵永刚，等．两种一步法ＲＮＡ提取试剂的比较 度，采用ＤＥＰＣ水配制的溶菌酶裂解细胞处理；为 ．中国动物检疫，２００４，２１（１２）：２２—２４． 了抑制残余的内源性ＲＮＡａｓｅ’活Ｉ生，在加入ＲＮＡｉｓｏ 【９】廖鲜艳，李永仙，李琦，等．啤酒酵母胞内ＲＮＡ提取的研究咖． 试剂裂解前，将菌体用液氮低温冷冻；为了获得足 酿酒，２００２，２９（２）：８４－８６； 够数量菌体且减少外泌酶的影响，摸索了菌体与 ［１０】李红熙，徐美隆，杨智．一种适合葡萄多种组织的总ＲＮＡ提取 ＲＮＡｉｓｏ试剂用量的比例，使之充分保证菌体细胞在 方法［Ｊ］．中国农学通报，２０１２，２８（７）：１５５－１５９． 裂解剂和变性剂的控制下川。通过上述几方面的改 【ｌ１】王玉成，张国栋，姜静．一种适用范围广的总ＲＮＡ提取方法【Ｊ】 ．进处理，提取到完整的总ＲＮＡ，可用于下一步的反 植物研究，２００６，２６（１）：８４－８６． 转录及满足ＲＴ—ＰＣＲ要求。 【１２］陈星，潘迎捷，孙晓红，等．细菌总ＲＮＡ提取方法的研究进展 本改良法的特点：①试验预处理方法操作方 叨．湖南农业科学，２０１０（５）：９－１ １． 便，整个提取过程反应温和，避免使用有机试 【１３】Ｊｕｎｈｕｉ Ｌ，Ｃｈｕａｎｈｏｎｇ Ｔ．Ａ ｓｉｍｐｌｅ，ｒａｐｉｄ ａｎｄ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｍｅｔｈｏｄｆｏｒ 剂，减少了对实验人员带来的不利影响。②以液 ｔｏｔａｌ ＲＮＡ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｆｒｏｍ Ｌｅｎｔｉｎｕｌａ ｅｄｏｄｅｓ［Ｊ］．Ｂｉｏｔｅｅｈｎｏｌ Ｌｅｔｔ， 氮冷冻处理代替液氮研磨处理，简化了试验操 ２００６（２８）：１ １９３—１ １９７． 作，减少了外源ＲＮＡａｓｅ污染几率。③溶菌酶裂解 【１４］杨占军，谷守琴，张健．几种植物组织总ＲＮＡ提取方法的特点 细胞壁处理适宜枯草芽孢杆菌菌体特点，酶解条 及疑难对策叨们．安徽农业科学，２００９，３７（１８）：８３４１－８３４２．