实验八 乳酸脱氢酶

一、实验目的

了解琼脂糖凝胶电泳的方法和原理，学会分离LDH同工酶的方法。 二、原理

同工酶是指能够催化相同的化学反应，但酶分子的结构理化特性乃至免疫学性质不同的一组酶，同工酶这种差异是由于酶蛋白的编码基因不同或基因相同但转录、翻译或后加工有别所造成的。同工酶存在于生物的同一种属或同一个体的不同组织，甚至同一组织或细胞的不同亚细胞结构中。

人们已发现几百种同工酶。乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase LDH）是人们认识的第一个同工酶。LDH是糖酉孝解中的一个酶，它催化的反应如下。

COOH COOH

HO—C—H+NAD＋ C＝O＋NADH＋H+ CH3 CH3

LDH有五种同工酶，分子量在13万～15万之间，由四个亚基组成。LDH的亚基有两种类型，一种是心肌型亚基（H型）（B基因），另一种是骨骼肌型亚基（M型）（A基因）。两类亚基以不同比例可组成五种四聚体。即LDH1(H4)、LDH2(H3M1)、LDH3(H2M2)、LDH4(H1M3)、LDH5(M4)。H型亚基与M型亚基的氨基酸组成有差异，前者含酸性氨基酸残基多，故LDH可用电泳的方法进行分离。本实验用pH8.6的缓冲液，在此条件下电泳，LDH的五种同工酶均净带负电荷，向正极泳动，但LDH1最快，依次减慢，LDH5最慢。

在哺乳动物体内，一般厌氧性组织中，如骨骼肌、肝脏中，LDH5含量高；在非厌氧性组织中，如心、脑中，LDH1含量高。

本实验用琼脂糖凝胶，LDH的五种同工酶在琼脂糖凝胶板上分离后，进行酶促反应，使乳酸脱氢生成NADH，NADH将人工递氢体PMS还原，还原型PMS最终将NBT还原。

NADH++H++PMS=====NAD++PMSH2 PMSH2＋NBT======PMS＋NBTH2 NBTH2为蓝色化合物。

三、实验器材

（一）、仪器 1、电泳仪

1、水平电泳槽 2、离心机 3、玻璃匀浆器 5、恒温箱

6、微量移液器 7、吸量管

四、材料与试剂

1、小白鼠（成年） 2、白瓷盘 3、剪子 4、镊子 5、载玻片 6、滤纸 7、生理盐水

8、0.01mol/l pH7.4磷酸钠缓冲液：取0.01mol/L NaH2PO419ml和0.01mol/L Na2HPO481ml混合即可。

9、0.05mol/l pH8.6巴比妥钠盐缓冲液：称取巴比妥钠10.3g，巴比妥1.84g，加蒸馏水溶解并稀释至1000m1，pH为8.6。

10、0.5％琼脂糖：琼脂糖0.5g，巴比妥钠盐缓冲液50ml，蒸馏水48ml，10mol/lEDTA2ml， 水浴加热溶解。 11、染色液（以每块凝胶板用量计算）： 取LDH酶活性染色液0.5ml，0.5％琼脂糖（预先已溶化）0.5ml混匀，临用前10分钟配制，避光保存37℃恒温箱内。 12、LDH酶活性染色液 ：NAD+（氧化型辅酶I）（5mg/ml）2.5ml、NBT（氯化硝基四氮唑蓝）（1mg/ml）7.5ml、PMS（吩嗪二甲酯硫酸盐）（1mg/ml）0.5ml、1mol/l乳酸钠2.5ml、0.5mol/l Tris缓冲液（pH7.0）3.7ml、0.1mol/lNaCl 1.3ml、加双蒸水25ml。

13、脱色固定液：95％乙醇140ml、1％或5％冰乙酸10ml、蒸馏水50ml。

五、实验步骤

（一）、LDH的提取

取成年小白鼠断头杀死，任取下列组织：心、肝、肾、脾、肺、胃、肠、舌、骨骼肌和性腺，用生理盐水洗去血迹，称取以上组织0.1克加20倍体积0.1mol/lNaPB（pH7.4），用玻璃匀浆器在冰浴上匀浆，匀浆经3000rpm离心20min，取上清液用于电泳分析（在4℃冰箱保存备用）。 （二 ）、凝胶的制备

取溶化的0.5％琼脂糖2.5ml，加至干净的载玻片上，凝固后即可使用。 （三）、加样

将普通滤纸剪成12×1.5mm的细条，用微量移液器取LDH提取液10－15μl，将剪好的滤纸条充分浸润后，平贴在距载玻片一端的约1/3处。 （四）、电泳

将凝胶板移入平式电泳槽内，点样端在负极，加入巴比妥钠盐缓冲液，两端用四层已浸透缓冲液的纱布“搭桥”。电压120V，通电40－45min。 （五）、染色与固定

电泳完毕，每块凝胶板上立即加上预先配制好的染色液1.0ml，均匀覆盖，于37℃恒温箱内保温30－60min，至有清晰的蓝紫色带区出现。

将凝胶板放入5％乙酸中固定30min，再用蒸馏水漂洗2－3次，待背景无色后，即可用于定量或扫描等处理。

图1 LDH同工酶PAGE活性染色示意图

1、正常人血清 2、猪心提取液3、猪骨骼肌提取液

六、注意事项

1、LDH属于胞内酶，通过匀浆破碎细胞释放出LDH，像肌肉、胃、肠等较难破碎的组织，匀浆时间可适当延长。

2、铺板时应注意将载玻片放平，用吸量管吸取2.5ml溶化的琼脂糖，一次放入载玻片中央，让其向四周扩展，这样形成的胶面光滑平整。

3、浸润LDH提取液的滤纸条，要用镊子夹住贴在据载玻片一端的1/3处，注意与载玻片一端平行。

参考文献

1、张龙翔、张庭芳、李令媛，生化试验方法和技术（第二版），高等教育出版社，1997 2、袁玉荪、 朱婉华、 陈钧辉，生物化学实验，高等教育出版社，1988 3、刘粤梅、 朱怀荣 ，生物化学实验教程， 1997

4、黄如彬、丁昌玉、林厚怡 ， 生物化学实验教程，1995

5、陈钧辉、陶力、李俊等，生物化学实验（第三版），科学出版社，2003