第３１卷第３期 ２ ００ ５年５月 光学技术 ＶｌＯ１．３ｌ Ｎｏ．３ Ｍａｙ ２００５ ＯＰＴＩＣＡＬ ＴＥＣＨＮＩＱＵＥ 文章编号：１００２．１５８２（２００５）０３—０３２６—０４ 一种实现显微荧光寿命图的测量方法 林子扬，牛憨笨，郭宝平，屈军乐，彭文达，田劲东 （深圳大学光电子学研究所光电子器件与系统教育部重点实验室，深圳５１８０６０） 摘要：将脉宽１２０ｆＳ、重复率７６ＭＨｚ激光引入激光扫描显微镜的激发光路，利用其扫描系统对荧光标记样品激发 扫描，将激发出的荧光从荧光探测光路引入备用的外部探测口；在探测口接一快速光电倍增管，将光电倍增管的信号送 给时间相关单光子计数器，获得时间相关的荧光强度图；最后通过计算机处理获得荧光寿命图。应用此系统对青色荧光 蛋白（ＣＦＰ）、黄色荧光蛋白（ＹＦＰ）荧光寿命进行了测量，并应用ＣＦＰ、ＹＦＰ实现荧光共振能量转移的测量。通过实验看 出利用已有的激光扫描显微镜，配合较先进的寿命测量方法，可以很好地实现显微荧光寿命图的测量。 关键词：荧光寿命；寿命测量；荧光标记；寿命图 文献标识码：Ａ 中图分类号：０４３２．２ Ｍｅｔｈｏｄ ａｃｈｉｅｖｉｎｇ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｌｉｆｅｔｉｍｅ ｍｉｃｒｏ．ｉｍａｇｅ ＬＩＮ Ｚｉ－ｙａｎｇ，ＮＩＵ Ｈａｎ－ｂｅｎ，ＧＵＯ Ｂａｏ－－ｐｉｎｇ，ＱＵ Ｊｕｎ－ｌｅ，ＰＥＮＧ Ｗｅｎ－ｄａ，ＴＩＡＮ Ｊｉｎｇ－ｄｏｎｇ （Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｏｐｔｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ，Ｓｈｅｎｚｈｅｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｏｐｔｏ－ｅｌｃｔｅｒｕｏｎｉｃｓ Ｄｅｖｉｃｅｓ ａｎｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ （Ｓｈｅｎｚｈｅｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ），Ｍｉｉｓｎｔｒｙ ｏｆ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ，Ｓｈｅｎｚｈｅｎ ５１８０６０，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＬａＳｅｒ ｐｕｌｓｅｓ ｏｆ １２０ｆＳ ｄｕｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ７６ＭＨｚ ｒｅｐｅｔｉｔｉｏｎ ｒａｔｅ ｗｅｒｅ ｂｒｏｕｇｈｔ ｉｎ ｅｘｃｉｔｉｎｇ ｌｉｇｈｔ ｐａｔｈｗａｙ ｏｆ ｌａｓｅｒ ｓｃａｎ— ｎｉｇ ｍｉｎｃｒｏｓｅｏｐｅ ａｎｄ ｔｈｅ ｓａｍｐｌｅ ｏｆ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｔａｇｓ ｗａｓ ｅｘｃｉｔｅｄ，ｕｓｉｇ ｔｈｅ ｓｃａｎｎｉｎｎｇ ｓｙｓｔｅｍ ｏｆ ｌａｓｅｒ ｓｃａｎｎｉｎｇ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ．Ｔｈｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｅｘｃｉｔｅｄ ｂｙ ｅｘｃｉｔｉｇ ｌｉｎｇｈｔ ＷａＳ ｂｍｕｇｈｔ ｉｎ ｅｘｔｅｒｎａｌ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｐｏｒｔ ｆｒｏｍ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｐａｔｈｗａｙ．Ｔｈｅ ｆａｓｔ ｐｈｏ— ｔｏｒｎｕｌｔｉｐｌｉｅｒｗａｓｃｏｎｎｅｘｔｅｄｏｎｔｈｅｐｏｒｔ．Ｔｈｅ ｓｉｇｎａｌｏｆｔｈｅｆａｓｔ ｐｈｏｔｏｍｕｌｔｉｐｌｉｅｒｗａｓ ｓｅｎｔｔｏｔｉｍｅ－ｃｏｒｒｅｌａｔｅｄ ｓｉｇｌｅｐｈｏｔｏｎ ｎｃｏｕｎｔｉｇ ｎａｎｄ ｔｉｍｅ－ｃｏｒｒｅｌａｔｅｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ ｉｍａｇｅ ｗａｓ ｇｏｔ．Ｔｈａｎ，ｔｈｅ ｃｏｍｐｕｔｅｒ ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ ｔｈｅ ｉｍａｇｅ ａｎｄ ｔｈｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｌｉｆｅｔｉｍｅ ｉｍａｇｅ ｗａｓ ｏｂｔａｉｎｅｄ．Ｔｈｅ ｌｆｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｌｉｆｅｔｉｍｅ ｏｆ ｃｙａｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＣＦＰ）ａｎｄ ｙｅｌｌｏｗ ｌｆｏｒｅｕｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＹＦＰ） ｔｈ ｔｈｅ ｓｙｓｔｅｍ ｗｅｒｅ ｍｅａｓｕｒｅｄ．Ｔｈｅ ｍｅ￣１ｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｅｎｅｒｇｙ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｗｉｔｈ ＣＦＰ ａｎｄ ＹＦＰ Ｗａｓ ａｃｈｉｅｖｅｄ．Ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓｔｈａｔ ｔｈｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｌｉｆｅｔｉｍｅ ｍｉｃｒｏ－ｉａｇｅ ｍｅａｓｕｍｒｅｍｅｎｔ ｃａｎ ｂｅ ｗｅｌｌ ｄｏｎｅ ｂｙ ｃｏｍｂｉｉｎｎｇ ｌａｓｅｒ ｓｃａｎｎｉｇ ｍｎｉｃｒｏｓｃｏｐｅ ｗｉｔｈ ａｄｖａｎｃｅｄ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｌｉｆｅｔｉｍｅ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｉｓ ｓｈｏｗｅｄ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｌｉｆｅｔｉｍｅ；ｌｉｆｅｔｉｍｅ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ；ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｔａｇｓ；ｌｉｆｅｔｉｍｅ．ｍ柚ｇｅ １引 言 荧光蛋白标记方法在生物医学研究领域得到越 化外，另一个重要荧光特征就是荧光寿命的变化，荧 光蛋白所处的环境变化、蛋白质构象的变化、蛋白质 之间相互作用的变化等都会改变荧光蛋白的荧光寿 命，所以荧光寿命的变化携带了许多重要信息，而且 比荧光强度反映灵敏；另外，荧光寿命不受激发光强 来越广泛的应用和认可，例如绿色荧光蛋白（ＧＦＰ）、 青色荧光蛋白（ＣＦＰ）、黄色荧光蛋白（ＹＦＰ）。ＧＦＰ 可以和各种蛋白质融合来研究活细胞中蛋白质的形 貌、运动和化学特性等，它为理解蛋白质的功能提 供了一个重要的新方法。现在荧光蛋白已成为的重 要的研究工具，如跟踪、量化单一蛋白和复合蛋白， 弱的影响，也不受探测器的电压大小的影响，这些都 有利于研究工作。国外已开展了此类荧光寿命的测 量和荧光寿命图的获取工作，但国内这方面的工作 很少，这要求显微激光扫描的同时进行寿命测量。 这里，我们尝试了一种改进激光扫描共聚焦显微镜， 利用时间相关单光子计数器实现荧光寿命测量并获 取荧光寿命图的方法，因为时间相关单光子计数技 术通过近几年的发展有了较大的提高，特别是在计 数速率和时间响应方面＿２Ｊ。 探测蛋白质．蛋白质分子之间的相互作用，作为一种 传感器描述生物事件和信息，有关这方面的详细情 况可参考文献［１］。在这些应用中，主要是探测荧光 光强和荧光强度的变化，但荧光强度的变化不足以 灵敏反映这些现象中的荧光变化；除荧光光强的变 收稿日期：２００４．０６—０７；收到修改稿日期：２００４—１１—０１ Ｅ－ｍａｉｌ： ＠ＳＺＵ．ｅｄｕ．ｃｎ 基金项目：国家自然科学基金重点项目（Ｎｏ．６０１３８０１０） 作者简介：林子扬（１９５８一），男，浙江人，深圳大学副教授，博士，从事生物光子学、激光应用研究。 ３２６ 第３期 林子扬，等： 一种实现显微荧光寿命图的测量方法 ２时间相关单光子计数荧光寿命测量的基 速度光电倍增管，再将光电倍增管输出的信号送人 本原理 时间相关单光子计数器，最后通过软件处理获得感 到备用外部荧光出口，在出口处接一高灵敏、高响应 时间相关单光子计数荧光寿命测量是一种时域 皮秒时间分辨率的弱光信号的测量方法。时间相关 单光子计数的原理是基于对周期性光信号的单光子 探测的，通过对单个光子的探测时间的测量，重建出 兴趣区域的荧光寿命图和单点的荧光寿命曲线。 图２为此方法和装置的示意图。我们利用已有 的徕卡ＤＭＩＲＥ激光扫描共聚焦显微镜，配置相干 公司的钛宝石飞秒激光器、日本滨松公司的 Ｒ３８０８Ｕ＿５０ ＭＣＰ光电倍增管和Ｂｅｃｋｅｒ＆Ｈｉｃｋｌ 整个光信号的波形。此方法是依据这样的事实，即 探测很弱的高重复频率光信号时，这种光信号是如 ＧｍｂＨ公司的ＳＰＣ：７３０时间相关单光子计数器及 此的弱，以至于在一个信号周期内探测到一个光子 的几率远小于１。因此探测多个光子情况可忽略。 原理如图１所示，探测器接受到的信号由一串随机 分布的脉冲组成，每个脉冲表示探测到了光子，有许 多信号周期内没有光子，其他周期是含有一个光子 的脉冲，而含有几个光子的周期信号几乎是没有的。 当探测到一个光子就记录下该光子对应的探测器脉 冲时间，并在该时间对应的计数存储器上加１。经 过多次探测后，在时间计数存储器内就记录了随时 间分布的光子数柱状图，柱状图又与荧光光强度分 布是相关联的，从而构建出荧光光脉冲的波形。 时Ｉ司相 关单光子计 数具有超高Ｄｅｔｅｃｔｏｒ ￣＇Ｗａｖｅｆｏｒｍ Ｔｉｍｅ 时间分辨率 Ｐ （可达２５ｐｓ）、ＰＰｅ ｒｉｏｄ。ｄ； ▲ ■ 超高灵敏度 ；ｅ盯ｒ．ｉｏｄ ▲ （低于单个光 ＰＰｅ盯ｒｉ ｏｄ； 子水平）、短 ；器：：； ▲ 的测量时间、Ｐｅｒｉｏｄ ｌ０ 高动态范围、 Ｐ 。 Ｎ ■ 高线性度、非 驯 常好的信噪Ｐｈｏｔｏｎｓ 比和高增益 稳定性。有 图１贼测量原理 关时间相关 单光子计数器原理的详细情况还可参阅文献［３，４］。 ３方法与装置 我们目的是要达到能测量细胞样品上某一点的 荧光寿命和感兴趣区域的荧光寿命图。为了实现测 量的目的，我们的方法思想是：将飞秒激光引入激光 扫描共聚焦显微镜的激发光路，以便可以利用激光 扫描共聚焦显微镜的扫描系统，对样品感兴趣区域 进行荧光激发扫描；将激发出的荧光由一设置的反 射镜从激光扫描共聚焦显微镜荧光获取通路中反射 相应的单光子计数获取软件与寿命分析软件；通过 光学系统将飞秒激光引入激光扫描共聚焦显微镜， 并使其光路在显微镜内与原Ａｒ Ｉ￣ｑｓｅｒ激光激发光路 重合；同时，分一束光给快速光电管二极管，作为单 光子计数器的计数与时间记录控制信号；将 Ｒ３８０８Ｕ－５０ ＭＣＰ光电倍增管接在徕卡的ＤＭＩＲＥ 激光扫描共聚焦显微镜的备用荧光出口，在显微镜 内设置一光路转换开关（在分光棱镜之前），让飞秒 激光激发样品的荧光能从备用荧光出口出射；另外 制作了一个加载滤光片的装置，放在Ｒ３８０８Ｕ一５０ ＭＣＰ光电倍增管之前，用作滤出感兴趣波长的荧 光；把Ｒ３８０８Ｕ一５０ ＭＣＰ光电倍增管输出的信号接 人单光子计数器作为计数信号；用一台奔腾Ⅲ一 １０００ＭＨｚ微机作控制与处理。改装后，设备即可进 行激光共聚焦扫描，也可进行荧光寿命测量。操作 时，激光共聚焦扫描没有任何改变。在做寿命测量 时，首先将激发光转到飞秒激光，关闭其它激光，找 到待测目标；然后将显微镜内设置的光路转换开关 转向备用荧光出口方向；接着设置好单光子计数器 的各个参数；做好这些准备后，按开始激光共聚焦扫 描按钮开始扫描，再按单光子计数开始按扭，获得时 问相关单光子计数强度图；最后用寿命分析软件对 强度图像做寿命分析，并获得寿命图。 飞秒激光器 ＢＳ ＢＳ ７６ＭＨｚ ｌ２０ｆｓ ＢＳ １迭蕉 皇三堡 丽丽萌＝丽一 ＢＳ ＭＣＰ光电倍增管 氩离子 激光器 徕卡ＤＭＩＲＥ 激光扫描共 聚焦显微镜 共聚焦显微镜 控制软件一测 量与显示 图２测量装置示意图 Ｒ３８０８Ｕ一５０ ＭＣＰ光电倍增管的脉冲响应半宽 度为３０ｐｓ；ＳＰＣ－７３０时间相关单光子计数器的时间 响应比Ｒ３８０８Ｕ一５０ ＭＣＰ光电倍增管的脉冲响应半 ３２７ 光学技术 第３１卷 宽度好１０倍，其光子计数速率达到１０ ／Ｓ，既每毫秒 可计数１０００个光子；这些为实现寿命测量提供了可 靠的保证。ＳＰＣ－７３０时间相关单光子计数器测量的 时间是Ｒ３８０８Ｕ一５０ ＭＣＰ光电倍增管探测到荧光光 子开始到快速光电管二极管接收到下一激光脉冲停 止，在光子计数时间内对样品上激光扫描的每一点 多次周而复始重复“开始一停止一开始”，同时激光扫 描的同步信号作为ＳＰＣ－７３０存储单元的控制信号， 当发生荧光共振能量转移时，作为供体的ＣＦＰ荧光 寿命会明显变短［引，测量ＣＦＰ荧光寿命是否明显变 化来判断荧光共振能量转移是否发生。 从而获得一幅每一点与相应荧光寿命相关的强度 图，通过计算机处理得到荧光寿命图。 ４实验与应用 本文使用此系统进行了实验研究来验证系统的 可行性；主要进行了青色荧光蛋白（ＣＦＰ）和黄色荧 光蛋白（ＹＦＰ）的荧光寿命测量，并进行了荧光共振 能量转移的测量，实现了两个蛋白质相互作用的应 用研究；荧光共振能量转移技术是现代细胞生物研 究的极重要的方法，它可测量几个纳米大小的分子 之间距离；荧光共振能量转移技术的详细描述可参 阅文献［５］。 我们构建了ＣＦＰ—ＨＳＰ２７和ＹＦＰ—ｐ３８两个质 粒。热休克蛋白ＨＳｐ２７是一种细胞应激反应蛋白， 当细胞受到热、紫外线照射或其他环境应激时，它能 帮助细胞进行损伤的修复，ＨＳｐ２７基因来自 ｐＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ－Ｈｓｐ２７；ｐ３８是丝裂原激活蛋白激酶 家族（ＭＡＰＫ）的一个重要成员，ｐ３８基因来自ｐｃＤ ＮＡ３一ｐ３８，经常在细胞应激时被激活，也可以被许多 细胞因子（如肿瘤坏死因子，细胞死亡因子）所激活。 激活的ｐ３８一般将启动细胞的凋亡过程。对于细胞 凋亡来说，ＨＳｐ２７和ｐ３８是一对相互制约的蛋白。 将构建的ＣＦＰ—ＨＳＰ２７和ＹＦＰ—ｐ３８两个质粒分别转 染到小鼠成纤维细胞Ｌ９２９内和同时转染到小鼠成 纤维细胞Ｌ９２９内进行表达，制成三种样品ＣＦＰ— ＨＳＰ２７一Ｌ９２９、ＹＦＰ．ｐ３８一Ｌ９２９和ＣＦＰ—ＨＳＰ２７＋ ＹＦＰ—ｐ３８一Ｉ＿．９２９，分别用于青色荧光蛋白（ＣＦＰ）、黄 色荧光蛋白（ＹＦＰ）的荧光寿命测量和荧光共振能量 转移的测量。样品的制备由中科院北京生物物理研 究所沈询研究组完成。 青色荧光蛋白（ＣＦＰ）和黄色荧光蛋白（ＹＦＰ）的 荧光寿命测量结果如图３、图４所示。图５（ａ）、（ｂ） 分别图３、图４中十字叉点的寿命测量结果。 荧光共振能量转移的测量结果见图６，测量的 是ＣＦＰ荧光寿命。为能较准确测量，我们在 ８０８Ｕ ＭＣＰ光电倍增管之前放置了Ｃｈｒｏｍａ公司 的ＣＦＰ带通滤光片，确保只有ＣＦＰ的荧光通过。 ３２８ ９３Ｅ＋ｌ ｌ ０Ｅ＋３ ２ ０Ｅ＋３ ３ ０Ｅ＋３ ｔｉｐｓ ｆ巾ｓ （ａ）荧光寿命图 ＯＣ）荧光寿命分布 图３青色荧光蛋白（ＣＦＰ）荧光寿命图和 荧光寿命分布，不同颜色表示不同寿命 ｌ ０Ｅ＋３ ｌ ５Ｅ＋３ ２ ０Ｅ＋３ ２．５Ｅ＋３ ３．０Ｅ＋３ ｔｉｐｓ ｔｉｐｓ （ａ）荧光寿命图 Ｃｏ）荧光寿命分布 图４黄色荧光蛋白（Ⅵ１Ｐ）荧光寿命图和 荧光寿命分布，不同颜色表示不同寿命 上述实验，图像获取的时间都为５０ｓ。从实验 结果图３、图４得出ＣＦＰ的荧光寿命约为２．３ｎｓ， ＹＦＰ的荧光寿命约为２．７ｎｓ，另外从相应的荧光寿 命统计分布看，寿命都集中这两个值的附近，这说明 细胞内各处荧光蛋白的表达基本相同。从图５的结 果明显看出，当发生荧光共振能量转移时，供体 ＣＦＰ的荧光寿命减少近１ｎｓ，约为１．２ｎＳ～１．３ｎｓ；图 ５中左右两幅彩图颜色变化十分明显反映了ＣＦＰ 荧光寿命的明显变化；在图５中给出发生荧光共振 能量转移时荧光强度图，比较图５上排ＣＦＰ荧光强 度图和发生荧光共振能量转移时荧光强度图，从强 度变化上较难判断是否发生荧光共振能量转移；由 此看出通过ＣＦＰ荧光寿命的变化测量研究荧光共 振能量转移比荧光强度方法更好，更可靠。 ５结论 第３期 林子扬，等： 一种实现显微荧光寿命图的测量方法 ２Ｏ ４Ｏ ６Ｏ ８Ｏ １００ １２０ １４０ １６０ １８０ ２００ ２２０ ２４０ ２５６ 时间通道 （ａ）图３十字叉点的寿命测量结果， 表示寿命， 表示均方差 ∞３ ２ ２ ５ ５ Ｌ ０ ５ ２Ｏ ４Ｏ ６Ｏ ８Ｏ １Ｏ０ １２０ １４０ １６Ｏ １８０ ２００ ２２０ ２４０ ２５６ 时间通道 （ｂ）图４十字叉点的寿命测量结果， 表示寿命， 表示均方差 图５单点荧光寿命测量结果 ＣＦＤ－ｈｓｐ２７ ＣＦＤ－ｈｓｐ２７／ＹＦＰ—ｐ３８ 究水平可以得到提高，其应用可包含荧光共振能量 转移的测量、多荧光标记的区分、钙离子寿命图、自 体荧光寿命测量等等，这些对生物医学的研究会有 感谢中科院北京生物物理研究所沈询、郑春雷 Ｉｎｔ￣ｓｉｔｙ ｌｍａｇｅ Ｉｍｍｓｉｔｙ ｔｍａｇｅ ＣＦＰｉｎ ＣＦＰ＿ｈ印２７ 一■ ■■ 图６荧光共振能量转移的测量 极大的帮助。 在实验样品方面给予的大力支持。 参考文献： 【Ｉ］Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ—Ｓｃｈｗａｒｔｚ Ｊ，Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ Ｇ Ｈ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ＬＩＳａ ｏｆ ｌｆｕ— ｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｍａｒｋｅｒｓ ｉｎ ｌｉｖｉｎｇ ｃｅ￣ｓ［Ｊ］．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００３，３００：８７． ｃｒｏｓｃｏｐｙ ｂｙ ＴＣＳＰＣ ｉｎ￣ｎｇ［Ｃ］．ＳＰＩＥ ＢＩＯＳ ２００１，Ｍｕｌｔｉｐｈｏｔｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ ｉｎ ｔｈｅ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，２００１． ［２］Ｂｅｅｋｅｒ Ｗ，Ｂｅｒｇｒｎａｎｎ Ａ，ｅｔ １ａ．Ｐｉｃｏｓｅｃｏｎｄ ｌｆｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｌｉｆｅｔｉｍｅ ｍｉ． 结果，不同颜色表示不同寿命 ［３３ Ｏ’ＣｏｎｎｏｒＤＶ，ＰｈｉｌｌｉｐｓＤ．Ｔｉｍｅ－ｃｏｒｒｅｌａｔｅｄ ｓｉｇｌｎｅ ｐｈｏｔｏｎ ｃｏｕｎｔｉｎｇ ［Ｍ］．Ａｃａｄｅｍｉｃ，Ｌｏｎｄｏｎ，１９８４． ［４］Ｂｅｃｋｅｒ＆Ｈｉｃｋｌ ＧｍｂＨ．ＳＰＣ－３００ ｔｈｒｏｕｇｈ ＳＰＣ－７３０ ｏｐｅｒａｔｉｎｇ ｎｍ— ｕａＩ［ＥＢ／ＯＬ］．ｗｗｖ￣．ｂｅｃｋｅｒ－ｈｉｃｋ１．ｄｅ． ［５］Ｆｏｒｓｔｅｒ Ｔ．Ｚｗｉｓｃｈｅｎｍｏｌｃｕｌｅａｒｅ Ｅｎｅｒｇｉｅｗａｎｄｅｒｕｎｇ ｕｎｄ Ｈｕｏｒｅｓｃｅｎｚ 综上，本文的方法是可行的，而且有它的优点。 首先，利用了激光扫描显微镜的扫描系统，不但可以 得到样品上某点的荧光寿命，而且可以得到样品上 感兴趣区域的寿命图，同时保持了显微功能，使荧光 寿命图的获取可以达到细胞层次；其次，使激光扫描 显微镜的功得到扩展；更重要的是使研究手段和研 ［Ｊ］．Ａｎｎ．５Ｐｈｙｓ．，１９４８，（２）：５７—７５． ［６］Ｂａｓｔｉａｅｍ Ｐ Ｉ Ｈ．，Ｓｑｕｉｒｅ Ａ．Ｈｕｏｒｅｓｃｅｎｅｅ ｌｉｆｅｔｍｅｉ ｉｍａｇｉｇ ｍｉｎ： ｃｒｏｓｃｏｐｙ：ｓｐａｔｉａｌ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ ｉｎ Ｔｒｅｎｄｓ ＣｅＵ Ｂｉｏｌ，１９９９，（９）：４８—５２． ｃｅｌｌ［Ｊ］． （上接第３２５页） ［４］Ｈｙ１ｍｋｙｕ Ｌ．Ｌａｅｒ－ａｓｓｉｓｔｅｄ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｃｌｅａｎｉｇ ｎｏｆ ｔｈｉｎ ｏｘｉｄｅ ｆｉｌｍｓ ｏｎ ｃａｒｂｏｎ ｓｔｅｅｌ ｓｕｒｆａｃｅｓ［Ａ］．Ｍｉｙａｍｏｔｏ Ｉ．Ｆｏｕｒｔｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｙｍｐｏ— ｓｌｕｍ ｏｎ Ｌａｓｅｒ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｍｉｃｒｏｆａｂｒｉａｔｃｉｏｎ［Ｃ］．Ｂｅｌｌｉｇｈａｎｍ：ＳＰＩＥ， ２０ｏ３．３８＿一４３． ＰｈｙＳ．Ａ，１９９９，６９：￥７２７．［６］Ｍｅｊａ Ｐ．Ｌａｓｅｒ ｃｌｅａｎｉｇ ｎｏｆ ｏｘｉｄｉｚｅｄ ｉｒｏｎ ｓａｍｐｌｅｓ：Ｔｈｅ ｉｎｆｌＨｅｎｃｅ ｏｆ ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ ｎｄ ａｅｎｖｉｍｎｍｅｎｔ［Ｊ］．Ａｐ— ｐ１．ＰｈｙＳ．Ａ，１９９９，６９：Ｓ６８７—６９０． ［７］姚素薇．镍阳极氧化膜形成和破坏过程的光电化学响应［Ｊ］．中 国腐蚀与防护学报，１９９５，１５（３）：２１７—２２２． １８Ｊ Ｋａｕｔｅｋ Ｗ．Ｅｌｃｔｒｅｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｒｅａｃｔｉｉｔｙ ｏｖｆ ｌａｓｅｒ－ｒｎａｃｈｉｎｅｄ ｍｉｍ－ｃａｖｉ—ｏ ｔｉｓｏｎ ａｅｎｏｄｉｓｅｄ ａｌｕｍｉｎｉｕｍ ａｌｌｏｙｓ【Ｊ］．Ｅｌｃｔｅｏｃｈｉｒｍｉａｃ Ａｃｔａ，２００３， ４８：３２４９—３２５５． ［５３ Ｐａｓｑｕｅｔ Ｐ．Ｌａｓｅｒ ｃｌｅａｎｉｇ ｎｏｆ ｏｘｉｄｅ ｉｏｎ ｌｒａｙｅｒ：Ｅｆｉｆｃｉｅｎｃｙ ｅｎｈａｎｃｅ— ｍｅｎｔ ｄｕｅ ｔＯ ｄｅｃｔｏｃｈｅｒｍｉｃａｌ ｉｎｄｕｃｅｄ ａｂｓｏｒｐｔｉｉｖｔｙ ｃｈａｎｇｅ［Ｊ］．Ａｐｐ１． ３２９