第３５卷第２期 林 业科技 Ｖｏ１．３５ Ｎｏ．２ Ｍａｒ． ２Ｏ ｌ Ｏ ２ ０ １ ０年３月 ＦｏＲＥＳＴＲＹ ＳＣＩＥＮＣＥ＆ＴＥＣＨＮｏＬｏＧＹ 文章编号：１００１—９４９９（２０１０）０２—００２５一ｏ２ Ｂｔ杀虫蛋白在分月扇舟蛾体内的分布 赵红盈 （黑龙江省森林保护研究所，哈尔滨１５００４０） 摘要：分月扇舟蛾幼虫取食转蜘蛛杀虫肽与Ｂｔ毒蛋白ｃ肽基因小黑杨后，Ｂｔ杀虫蛋白在其中肠、血淋巴、马氏 管中含量比较高；而先饲喂转蜘蛛杀虫肽与Ｂｔ毒蛋白ｃ肽基因小黑杨４ｄ，再饲喂非转基因小黑扬后，其所繁育 的蛹、成虫、卵、幼虫中均不合有Ｂｔ杀虫蛋白。 关键词：Ｂｔ杀虫蛋白；组织分布；ＥＬＩＳＡ法；分月扇舟蛾 中图分类号：Ｓ ７６３．３ 文献标识码：Ａ 分月扇舟蛾（Ｃｌｏｓｔｅｒａ ａｎａｓｔｏｍｏｓｉｓ）分布于我 国东北地区、内蒙古、广西、云南等地，主要危 害杨树、柳树、白桦等树木ｌ１ Ｊ。近年来，采用转 基因树种防治鳞翅目害虫的方法越来越为人们所 包括头部、中肠（保留内含物及清除内含物两 类）、马氏管、血淋巴、脂肪、尾部。余下的幼虫 用对照小黑杨饲喂，并分别取其蛹、成虫、二代 卵和幼虫备用。待测样品均需迅速液氮冷冻，并 低温储藏。 １．３ Ｂｔ杀虫蛋白含量的测定 采用ＥＬＩＳＡ方法 进行检测，Ｂｔ—ＣｒｙｌＡｂ 关注，但大规模种植转抗虫基因植物，是否会影 响生态系统的稳定，也成为科学家关注的焦点。 本研究通过对取食含Ｂｔ杀虫蛋白小黑杨的分月扇 舟蛾幼虫身体各组织进行Ｂｔ杀虫蛋白含量检测， 确定了Ｂｔ杀虫蛋白在分月扇舟蛾体内的分布情 况，以期能为转基因抗虫树种的合理应用提供必 要的理论依据。 ＥＬＩＳＡ试剂盒购自美国Ａｇｄｉａ生物公司。具体操作 步骤如下：①ＰＢＳＴ缓冲液和Ｂｔ标准蛋白的配制： 将８ｇＮａＣｌ、１．１５ｇＮａ２ＨＰＯ４、ｏ．２ｇＫＨ２ＰＯ４、ｏ．２ｇＫＣ１、 ０．５ｇ吐温一２０溶于１Ｌ的蒸馏水中配成ＰＢＳＴ缓冲 １ 材料与方法 １．１供试虫源及转基因小黑杨 液。Ｂｔ杀虫蛋白标准品为ＰＢＳＴ缓冲液逐级稀释 成浓度为０、０．５、１、２、４ｎｇ／ｍＬ的标准溶液。② 取各组织样品称重，研磨，加入ＰＢＳＴ摇样２ｈ， ４℃，１２０００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ；取上清液２０１ａ，ｍ，加 ２００９年５月末，在黑龙江省阿城区周边林带 采集分月扇舟蛾幼虫，并用非转基因小黑杨饲喂， 当成虫羽化时套笼，待所产卵自然孵化后，取３ 龄幼虫备用。 入ＰＢＳＴ稀释至１０００ｔｘｍ，③点样：标准蛋白、待 测样品、对照各５０ ｒｎ／孔，３次重复；室温下， 放置摇床ｌ５～２０ｍｉｎ；加入酶交联物５０￣ｍ／￣Ｌ， 室温下，放置摇床１～２ｈ。④洗板：用ＰＢＳＴ， ２５０１￣ｍ／次，每２ｍｉｎ洗１次，洗６～７次。⑤显色： 加入ＴＭＢ显色底物，ｌ０ｏ ｎ／孔；室温下，放置 转蜘蛛杀虫肽与Ｂｔ毒蛋白ｃ肽基因的单倍体 小黑杨（转基因无性系２， 兀 ）及对照（非转基 因的单倍体小黑杨植株，ＣＫ），均由东北林业大 学林木遗传育种实验室提供。 １．２ ＥＵｓＡ检测的虫体组织取样 摇床３０ｍｉｎ。⑥终止：加入终止液ｌ００ ｍ 孔。⑦ 凑数：用酶标仪在４５０ｎｍ吸光度下，读取ＯＤ值。 采用套笼饲喂方法，即将分月扇舟蛾３龄幼 虫饥饿２４ｈ后，接入带有ＴＴ２和ＣＫ植株套笼中。 饲喂４天后，取出部分幼虫进行解剖取样，主要 ・黑龙江省青年科学技术专项资金项目（Ｑｃｏ７ｃ５４） ⑧数据处理：根据所得ＯＤ值，计算样品中Ｂｔ杀 虫蛋白含量。 林业科技 第３５卷 内含物的中肠。这说明，在中肠的内含物中含有 ２结果与分析 检测结果（表１）表明，分月扇舟蛾幼虫取 食小黑杨Ｔｒ２后，Ｂｔ杀虫蛋白在中肠（有内含 一定数量的Ｂｔ杀虫蛋白，并且具有明显的活性。 在幼虫的血淋巴中Ｂｔ杀虫蛋白的含量也比较高， 其原因可能是内含物通过中肠组织中杯状细胞的 杯状部内腔，在进行肠管腔与体液间阳离子交换 时－３ Ｊ，渗入血腔；或者是肠道组织部分细胞被Ｂｔ 杀虫蛋白破坏，肠腔中的内含物侵入到血腔中， 导致血淋巴中Ｂｔ杀虫蛋白含量的增加，而且这些 物）、血淋巴、中肠（无内含物）、马氏管中的含 量较高，均显著高于在头部、脂肪体、尾部中的 含量；头部、脂肪体、尾部中Ｂｔ杀虫蛋白的含量 与对照相比没有显著性差异。Ｂｔ杀虫蛋白含量的 Ｂｔ杀虫蛋白也同样具有一定的活性。 次序为：中肠（有内含物）＞血淋巴＞中肠（无 ３．２饲喂４天小黑杨Ｔ 后，再饲喂小黑杨所繁 内含物）＞马氏管＞头部＞尾部。 育的蛹、成虫、卵、幼虫中，Ｂｔ杀虫蛋白的含量为 分月扇舟蛾幼虫取食小黑杨 ４天后，再 零。其原因可能是分月扇舟蛾在生长发育过程中， 取食对照黑杨，其繁育的蛹、成虫、卵、幼虫均 Ｂｔ杀虫蛋白在昆虫体内得到了充分的降解；或者是 不含Ｂｔ杀虫蛋白。 随着排泄物、分泌物排出体外。这说明，取食转Ｂｔ 表１ Ｂｔ杀虫蛋白在分月扇舟蛾体内的含量 杀虫蛋白的幼虫，如果能进行正常的生长发育，应 该不会将Ｂｔ杀虫蛋白传递给它的下一代。 参考文献 ［１］ 李成德编．森林昆虫学［Ｍ］．北京：中国林业出版社， ２ＯＯ４． ［２］ 赵红盈，张永军，吴孔明，等．转ＣｒｙｌＡｃ／ＣｐＴＩ双价抗虫 水稻Ｂｔ杀虫蛋白的表达特性及其对二化螟的毒杀效果 ［Ｊ］．农业生物技术学报，２Ｏ０４，１２（１）：７６—７９． ［３］ 程云吉，牟吉元．棉铃虫消化系统的组织学研究［Ｊ］．华 东昆虫学报，１９９７，６（２）：１７—２３． ［４］ＨＥＡＤ Ｇ，ＢＲＯＷＮ ｃ Ｒ，ＣＲＯＴＦＩ Ｍ Ｅ，ｅｔ ａ１．ＣｒｙＩ ｐｒｏｔｅｉｎ ｌｅｖｅｌｓ ｉｎ ｐｈｙｔｏｐｈａｇｏｎｓ ｉｎｓｅｃｔｓ ｆｅｅｄｉｎｇ Ｏｎ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ３ 讨 论 ｃｏｒｎ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｅｘｐｏｓｕｒｅ ｒｉｓｋ ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ［Ｊ］． Ｅｎｔｏｍｏｌｏｇｉａ Ｅｘｐｅｒｍｅｎｔａｌｉｓ ｅｔ Ａｐｐｌｉｃａｔａ，２００１，９９：３７—４５． 第１作者简介：赵红盈（１９７８一），女，博士，从事 ３．１取食４天小黑杨 的分月扇舟蛾幼虫，其 森林病虫害方面的研究工作。 有内含物的中肠组织中Ｂｔ杀虫蛋白的含量最高， 收稿日期：２０１０—０１—０５ 并显著高于幼虫体内的其他组织，其中也包括无 Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｔ Ｉｎｓｅｃｔｉｃｉｄａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ Ｃｌｏｓｔｅｒａ ａｎａｓｔｏｍｏｓｉｓ ＺＨＡＯ Ｈｏｎｇｙｉｎｇ （Ｈｅｉｌｏｎｇｆｉｎｇ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｈａｒｂｉｎ １５００４０） Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｗｈｅｎ Ｌｙｍａｎｔｒｉａ ｄｉｎｎａｅｕｓ ｆｅｅｄｅｄ ｏｎ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｘｉａｏｈｅｉ ｐｏｐｌａｒｓ ｗｉｔｈ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｇｅｎｅ ｏｆ ｔｈｅ ｓｐｉｄｅｒ ｉｎｓｅｃｔｉｃｉｄａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ ａｎｄ Ｂｔ—ｔｏｘｉｎ Ｃ—ｐｅｐｔｉｄｅ，ｔｈｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ ｔｈｅ ｍｉａｓｕｔ，ｂｌｏｏｄ ａｎｄ ｍａｌｐｉｇｈｉｎａ ｔｕｂｕｌｅｓ ｗｅｒｅ ｈｉｇｈｔ．Ｂｕｔ ａｆｔｅｒ Ｌｙｍａｍｒｉａ ｄｉｎｎａｅｕｓ ｆｅｅｄｅｄ ｏｎ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｘｉａｏｈｅｉ ｐｏｐｌａｒｓ ｗｉｈｔ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｇｅｎｅ ｏｆ ｈｔｅ ｓｐｉｄｅｒ ｉｎｓｅｃｔｉｃｉｄａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ ａｎｄ Ｂｔ—ｔｏｘｉｎ Ｃ—ｐｅｐｔｉｄｅ ｆｏｒ４ ｄａｙｓ，ｔｈｅｎ ｆｅｅｄｅｄ ｏｎ ｎｏｎ—ｂｉｏｔｅｃｈ Ｘｉａｏｈｅｉ ｐｏｐｌａｒ，Ｂｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ ｈｔｅ ｐｕｐａ，ｍｏｔｈ，ｅｇｇ ｗａｓ ｈａｄ ａｎｙ Ｂｔ ｐｒｏｔｅｉｎ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ Ｂｔ；Ｔｉｓｓｕｅ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ；ＥＬＩＳＡ ｍｅｔｈｏｄ；Ｃｌｏｓｔｅｒａ ａｎａｓｔｏｍｏｓｉｓ