GUS 活性检测(总)

目的：通过Gus活性测定了解或研究Gus基因是否转化进入植物细胞；Gus基因

在植物组织、细胞内的表达部位；Gus基因在植物细胞内瞬时表达量及稳定表达量；外源基因在植物细胞内的表达调控。

材料：转化的植物组织、器官、原生质体、种子的胚及萌发的幼苗等。 一、 组织化学染色法

试剂：

(1) 200mmol/L 磷酸钠缓冲液（pH7.0）

制备方法：A液：称取NaH2PO4·2H2O3.12g溶于蒸馏水，定容至100ml。

B液：称取Na2HPO4·12H2O7.17g溶于蒸馏水，定容至100ml。

取100ml B液与40ml A液混合（混合后pH值约7.03），用NaH2PO4·2H2O

调至7.0。

(2) 染色液： 试剂 磷酸钠缓冲液（PH7.0） Na2EDTA K3[Fe(CN)6] K4[Fe(CN)6] TritonX-100 甲醇 ddH2O X-Gluc 终浓度 100mmol/L 10mmol/L 1mmol/L 1mmol/L 0.5%(v/v) 20%(v/v) － 0.5mg/ml 母液浓度 200mmol/L 50mmol/L 40mmol/L 40mmol/L － － － － 配20ml所需母液量（ml） 10 4 0.5 *可不加 0.5 0.1 4 0.9或5.9（补水至20ml） 10mg ＊说明：

GUS活性的精确定位需要有亚铁离。GUS酶水解其底物X-Gluc产生可溶性无色的吲哚基衍生物，它可扩散到其他部位，必须经氧化缩合成二聚体，才能形成不溶性的蓝色沉淀，二聚体化由氧化催化剂(如亚铁氰化钾、过氧化物酶或过

－

氧化氢酶等)催化，若不加Fe2，则仅形成可溶性中间产物而扩散，加亚铁氰化钾后因吲哚基二聚体化而不扩散，不溶性蓝色沉淀形成越快，GUS酶的定位越精确。

(3) FAA固定脱色液：5％甲醛，5％乙酸，5％乙醇。

材料准备：

(1) 瞬时表达检测取浸染后1-5天的材料，稳定表达取转化后处理6周后的材料。

(2) 叶片、幼根等制成徒手切片（或剪成小块、小片）。 (3) 悬浮细胞、原生质体低速离收集，无菌等渗液洗涤。 (4) 清洁的愈伤组织可以直接使用

直接染色法

(1) 将准备好的材料浸泡在染液中，于25-37℃保温1小时至过夜。

(2) 叶片等绿色材料转入70％乙醇中脱色2-3次，到阴性对照材料呈白色。 (3) 肉眼或显微镜下观察，白色背景上的蓝色小点即为Gus表达位点。

固定染色法

(1) 将材料浸入固定液中，必要时可抽真空1分钟，室温下轻摇30-60分钟。 (2) 取出材料，用磷酸钠缓冲液漂洗3-4次。

(3) 将材料放入1.5ml无菌离心管（或其它无菌小容器）中，加入染色液，

浸没材料，盖上管盖或封闭容器，于37℃水浴中保温几分钟至过夜。 (4) 取出材料，用75％的乙醇漂洗，或放入FAA液中20分钟。 (5) 先后用20％乙醇、50％乙醇各浸泡20分钟以上。

(6) 显微镜下观察，白色背景上的蓝点斑点即为Gus表达位点。 (7) 染色后的材料可浸入含80％乙醇的FAA液中保存。

二、 荧光光度计定量测定