四川解剖学杂志２００９年第１７卷第１期 ・ ３３ ・ 论著 缺血再灌注大鼠脑匀浆上清对干细胞的诱导 蔡磊，刘桂香，刘光萍，李雅娜，钱知勉，冯国营 （滨州医学院，山东烟台 ２６４００３） 【摘要】 目的研究缺血再灌注大鼠脑匀浆上清对干细胞的诱导作用。方法采用全骨髓培养法从ＳＤ大鼠 骨髓中分离培养骨髓间充质干细胞（ＢＭＳＣｓ），经贴壁法体外扩增、传代和鉴定。采用化学试剂和缺血再灌注后的大 鼠脑匀浆上清分别诱导ＢＭＳＣｓ培养物，免疫细胞化学染色检测其诱导后神经元特异性烯醇化酶（ＮＳＥ）和胶质纤维 酸性蛋白（Ｇ ）的表达。结果诱导后的ＢＭＳＣｓ可表达ＣＤ４４，不表达ＣＤ３４。缺血再灌注后的大鼠脑匀浆上清诱 在脑缺血再灌注后的环境下更有利于ＢＭ－ 一 导ＢＭＳＣｓ分化的神经细胞更稳定，中等程度表达ＮＳＥ和ＧＦＡＰ。结论ＳＣｓ的神经分化。 【关键词】 骨髓问充质干细胞；细胞培养；诱导；细胞分化 【中图分类号】 Ｒ６１４ 【文献标识码】Ａ Ｉｎｄｕｃｉｎｇ Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ Ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ ｏｆ Ｂｒａｉｎ Ｈｏｍｏｇｅｎａｔｅ ｉｎ Ｉｓｃｈｅｍｉａ－ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ Ｒａｔ ｏｎ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ＣＡＩ Ｌｅｉ，ＬＩＵＧｕｉ－ｘｉａｎｇ，ＬＩＵＧｕａｎｇ－ｐｉｎｇ，ＬＩ Ｙａ—ｎａ，Ｑ Ｎ Ｚｈｉ－ｒｎｉａｎ，ＦＥＮＧ Ｇｕｏ—ｙｉｎｇ （Ｂｉｎｚｈｏｕ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ，Ｙａｎｔａｉ ２６４００３） ［Ａｂｓｔｒａｃｔ］Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｓｔｕｄｙ ｔｈｅ ｉｎｄｕｃｉｎｇ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ ｏｆ ｂｒａｉｎ ｈｏｍｏｇｅｎａｔｅ ｉｎ Ｉｓｃｈｅｍｉ— ａ－ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ ｒａｔ ｏｎ ｓｔｅｍ ｃｅｌ１．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｔｈｅ ＳＤ ｒａｔ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｗｅｒｅ ｉｓｏｌａｔｅｄ ａｎｄ ｃｕｌ— ｔｕｒｅｄ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ｗｈｏｌｅ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｃｕｌｔｕｒｅ，ａｆｔｅｒ ｅｘ ｖｉｖｏ ｅｘｐａｎｓｉｏｎ，ｐａｓｓａｇｉｎｇ ａｎｄ ｉｄｅｎ— ｔｉｆｅｄ ｂｙ ＣＤ４４ ａｎｄ ＣＤ３４，ｔｈｅ ＢＭＳＣｓ ｗｅｒｅ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｒｅａｇｅｎｔ ａｎｄ ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ ｏｆ ｂｒａｉｎ ｈｏｍｏｇｅｎａｔｅ ｉｎ Ｉｓｃｈｅｍｉａ－ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ ｒａｔ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ，ｔｈｅｎ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｎ－Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｅｎｏ— ｌａｓｅ（ＮＥＳ）ａｎｄ Ｇｌｉａｌ Ｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ Ａｃｉｄｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＧＦＡＰ）ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｃａ１ ｍｅｔｈ— ｏｄ．Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＣＤ４４ ｗａｓ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ａｎｄ ＣＤ３４ ｗａｓ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｉｎ ＢＭＳＣｓ，ｎｅｕｒｏｎｓ ｉｎ— ｄｕｃｅｄ ｂｙ ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ ｏｆ ｂｒａｉｎ ｈｏｍｏｇｅｎａｔｅ ｉｎ Ｉｓｃｈｅｍｉａ－ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ ｒａｔ ｗｅｒｅ ｍｏｒｅ ｓｔａｂｌｅ，ａｎｄ ｓｈｏｗｅｄ ｍｉｄｄｌｅ ｄｅｇｒｅｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＮＳＥ ａｎｄ ＧＦＡＰ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎｓ Ｔｈｅ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ ｏｆ Ｉｓｃｈｅｍｉａ－ ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ ｉＳ ｍｏｒｅ ｈｅｌｐｆｕｌ ｔｏ ｎｅｕｒａｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ． ［ＫｅｙＷｏｒｄｓ］Ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｍｅｓｅｎｃｈａｍａｌ ｃｅｌｌ；ＣｅＵ ｃｕｌｔｕｒｅ；Ｉｎｄｕｃｅ；Ｃｅｌｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ 缺血性脑损伤是临床上常见的中枢神经系统疾 病，目前尚无有效治疗手段，患者预后不佳，生活质量 偏低。随着干细胞移植治疗的研究进展，利用细胞再 Ｌ－ＤＭＥＭ培养基、胎牛血清（ＦＣＳ）、２一巯基乙醇 （ＭＥＲ）、二甲基亚砜（ＤＭＳＯ）、丁羟茴醚（ＢＨＡ）、神 经胶质酸性蛋白（ＧＦＡＰ）、神经元特异性烯醇化酶 （ＮＳＥ）抗体均为ＳＩＧＭＡ公司产品。ＣＤ３４、ＣＤ４４、 ＳＡＢＣ试剂盒、二氨基联苯胺（ＤＡＢ）显色剂盒为武汉 博士德公司产品。 １．２ ＢＭＳＣｓ的培养和纯化 生为神经疾病治疗提供了一条新思路［１］。骨髓间充 质干细胞（ＢＭＳＣｓ）是目前备受关注的一类具有多向 分化潜能的干细胞，在特定条件下，ＢＭＳＣｓ可以跨胚 层分化成神经细胞［２］。本实验通过体外培养获得纯 化的大鼠ＢＭＳＣｓ并加以鉴定，通过模拟大脑微环境 诱导其成为神经细胞，为进一步的体内移植打下理论 基础。 ｌ 材料与方法 １．１ 实验动物及试剂 取４周龄ＳＤ大鼠，脱颈处死后置于１Ｏ 新洁尔 灭液中浸泡３～５ ｍｉｎ，在无菌条件下取双下肢骨，小 心剔除软组织和肌肉。将骨骺端剪开，暴露两端骨髓 腔，使用５ ｍｌ注射器抽取Ｌ－ＤＭＥＭ培养液反复冲洗 骨髓腔，冲洗液收集于无菌离心管中， １０００ ｒ／ｍｉｎ离 心５ ｍｉｎ。弃去上清液，加入含１５ ＦＣＳ的Ｉ， ＤＭＥＭ充分吹打至单细胞悬液，调细胞浓度为４× １０ ／ｍｌ接种于培养瓶中，置于３７℃、５ ＣＯ２培养箱 出生４周ＳＤ大鼠（雌雄不限），体重１３０ ｇ左右， 由山东烟台绿叶制药有限公司实验动物中心提供。 四川解剖学杂志２００９年第１７卷第１期 ・３５・ 大量实验表明源于中胚层的ＢＭＳＣｓ在一定外 ３ 讨论 目前缺血性脑损伤实验常用大鼠的缺血再灌注 在条件的作用下可以分化为外胚层的神经细胞［１ 。 但是不同的分化结果及其分子水平的分化机制仍不 明确，尚需更深人的研究和探讨，以期在未来的细胞 替代治疗中正确选择诱导手段。本实验从一定程度 上模拟了脑缺血再灌注后的大脑微环境，从而为 ＢＭＳＣｓ体内移植治疗提供一定的理论依据。 模型嘲。在这一模型的制备中我们发现，缺血后大鼠 １ｈ神经功能缺损较严重，这与脑缺血后皮质运动区 受损有关［６］，至缺血后６ ｈ（即再灌注后４ ｈ）神经功 能缺损程度进一步加重，提示缺血一定时间后恢复血 供反而加重了原有的缺血性损伤，导致更为严重的缺 血再灌注损伤。其后随着再灌注时间的推移，神经功 能缺损程度逐渐好转，至缺血后７ ｄ，仅遗留有轻度的 参考文献 ［１］ＳａｔｏＹ。ＮａｋａｎｉｓｈｉＫ，Ｈａｙａｋａｗａ Ｍ，ｅｔ ａ１．Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｂｒａｉｎ ｉｎｊｕｒｙ 神经功能缺损［７］。大鼠的神经修复与大脑微环境的 促神经生长因子的浓度升高是分不开的，因此我们实 验中把化学试剂诱导、损伤后以及正常的脑匀浆上清 诱导作了比较，对预移植的骨髓间充质干细胞在体外 不同环境下转化为神经细胞的情况做一分析，从而为 体内移植做铺垫。 在ＭＥＲ作用下，细胞呈现出典型的树突、胞体、 轴突形态。细胞免疫组化鉴定发现诱导后５ ｈ的神 经元样细胞表达ＮＳＥ，同时神经胶质细胞标志物 ＧＦＡＰ表达阴性。脑匀浆上清作用缓慢而温和，胞体 以以类双极神经细胞居多。细胞免疫组化鉴定发现 ＢＭＳＣｓ诱导后ＮＳＥ、ＧＦＡＰ均呈阳性表达。结果表 明：ＭＥＲ有诱导ＢＭＳＣｓ向神经元分化的趋势；而鼠 脑匀浆上清则可以诱导ＢＭｓＣｓ向神经元和神经胶 质细胞分化。本实验验证了化学诱导剂诱导后出现 大量的细胞死亡，而脑缺血再灌注后大鼠脑匀浆上清 诱导后未出现明显的细胞死亡现象，该结果具有一定 意义：在内环境下，移植细胞可以更好地存活并与机 体内环境相互作用，更有利于促进神经系统功能恢 复。Ｃｈｏｐｐ研究小组系列实验发现：使用鼠脑匀浆上 清和ＢＭＳＣｓ共培养，体系中多种重要的神经细胞生 长因子如脑源性神经营养因子、神经生长因子、碱性 成纤维细胞生长因子等浓度升高［８ ；ＤＮＡ微点阵也 发现共培养后的ＢＭＳＣｓ中上述细胞因子的基 表 达增高［ 。 由于ＢＭＳＣｓ目前还没有公认的特异性抗原表 型，它可以表达ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０等多种基 质细胞和间质细胞的表面标志抗原，不表达造血干细 胞标志抗原ＣＤ３４、白细胞标志抗原ＣＤ４５［ 叫¨，我们 如何在骨髓中尽可能得到均一的间充质干细胞因此 尤为重要。在本实验中，我们使用取自同一供体的 ＢＭＳＣｓ，使用ＣＤ４４和ＣＤ３４对不同代数的ＢＭＳＣｓ 进行鉴定。这样利用细胞传代、鉴定及纯化，从而得 到比较均一、性质相同或相似的神经干细胞，为我们 种子细胞的来源提供理论支持。 ｉｎ ｎｅｏｎａｔａｌ ｈｙｐｏｘｉｅ－ｉｓｃｈｅｍｉｅ ｒａｔｓ ｂｙ ｉｎｔｒａｃｅｒｅｂｒｏ ｖｅｎｔｒｉｅｕｌａｒ ｉｎｊｅｅ— ｔｉｏｎ ｏｆ ｎｅｕｒａｌ ｓｔｅｍ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓ ｔｏｇｅｔｈｅｒ ｗｉｔｈ ｃｈｏｎｄｒｏｉｔｉｎａｓｅ ＡＢＣ［３］．Ｒｅｐｒｄｏ Ｓｃｉ．２００８ Ｊｕｌ；１５（６）：６１３—２Ｏ． ［２］Ｔｏｎｄｒｅａｕ Ｔ，Ｄｅｊｅｎｅｆｆｅ Ｍ，Ｍｅｕｌｅｍａｎ Ｎ，ｅｔ ａ１．Ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐａｔｔｅｒｎ ｏｆ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｎｅｕｒｏｎａｌ ｃｅｌｌｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｂｏｎｅ ｍａｒ— ｒｏｗ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｒｏｍａｌ ｃｅｌｌｓ ＥＪ］．ＢＭＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．２００８，Ａｐｒ １１，９：１６６． ［３３ Ｋａｄｉｙａｌａ Ｓ，Ｙｏｕｎｇ ＲＧ。Ｔｈｉｅｄｅ ＭＡ，ｅｔ ａ１．Ｃｕｌｔｕｒｅ ｅｘｐａｎｄｅｄ ｃａ— ｎｉｎｅ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｐｏｓｓｅｓｓ ｏｓｔｅｏｅｈｏｎｄｒｏｇｅｎｉｃ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｉｎ ｖｉｖｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏＥＪ］．Ｃｅｌｌ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．１９９７，６：１２５—１３４． ［４］Ｋｏｉｚｕｍｉ Ｊ，Ｙｏｓｈｉｄａ Ｙ，Ｎａｋａｚａｗａ Ｔ，ｅｔ ａ１．Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｆ ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｂｒａｉｎ ｅｄｅｍａ：Ａ ｎｅｗ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｃｅｒｅｂｒａｌ ｅｍ－ ｏｂｌｉｓｍ ｉｎ ｒａｌ￣ｓ ｉｎ ｗｈｉｃｈ ｒｅｃｉｒｅｕｌａｔｉｏｎ ｃａｎ ｂｅ ｉｎｔｒｏｄｕｃｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｉｓｃｈｅ－ ｍｉｃ ａｒｅａ．Ｊｐｎ Ｊ Ｓｔｒｏｋｅ，１９８６，８（１）：ｌ一８． ［５］Ｌｏｖｅ Ｓ Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ａｎｄ ｂｒａｉｎ ｉｓｃｈｅｍｉａ［Ｊ］．Ｊ Ｐｒｏｇ Ｎｅｕｒｏｐｓｙｅｈｏ－ ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｂｉｏｌ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ。２００３，２７（２）：２６７． ［６］Ｄｏｎｇａ ＥＺ，Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ ＰＲ。Ｃａｒｌｓｏｎ Ｓ，ｅｔ ａ１．Ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ ｍｉｄｄｌｅ ｅｅｒ— ｅｂｒａｌ ａｒｔｅｒｙ ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ ｗｉｔｈｏｕｔ ｃｒａｎｉｅｃｔｏｍｙ ｉｎ ｒａｔｓ［Ｊ］．Ｓｔｒｏｋｅ， １９８９。２Ｏ：８４—９１ ［７３娄晓辉，张亚卓，孙梅珍，等．应用人骨髓基质细胞治疗大鼠缺血性 脑梗塞的实验研究口］．中华神经外科杂志，２００２，１８（５）：３０２— ３０５． ［８］Ｃｈｅｎ Ｘ，ＫａｔａｋｏｗｓｋｉＭ，Ｃｈｏｐｐ Ｍ，ｅｔ ａ１．Ｈｕｍａｎ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｓｔｒｏｍａｌ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ ｂｙ ｔｒａｕｍａｔｉｃ ｂｒａｉｎ ｔｉｓｓｕｅ ｅｘｔｒａｃｔｓ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｊ Ｎｅｕｍｓｃｉ Ｒｅｓ，２００２，６９（５）：６８７ —９１． ［９］Ｑｕ Ｒ，Ｌｉ Ｙ，Ｃｈｏｐｐ Ｍ。ｅｔ ａ１．Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ａｎｄ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｏｆ ｍｏｕｓｅ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｓｔｒｏｍａｌ ｃｅｌｌｓ ｉｎ－ ｄｕｅｅｄ ｂｙ ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｂｒａｉｎ ｅｘｔｒａｃｔｓ［Ｊ＇］．Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ，２００７，２７ （４）ｔ ３５５－－６３． ［１Ｏ］Ｗｏｏｄｂｕｒｙ Ｄ，Ｓｅｈｗａｒｚ ＥＩ，Ｐｒｏｃｋｏｐ ＤＪ，ｅｔ ａ１．Ａｄｕｌｔ ｒａｔ ａｎｄｈｕ— ｍａｒｌ ｂｏｎｅ ｍａｒｏｒｗ ｓｔｒｏｍａｌ ｃｅｌｌｓ ｄｉｆｅｒｅｎｔｉａｔ ｉｎｔｏ ｎｅｕｒｏｎｓ［Ｊ］．Ｎｅｕ— ｒｏｓｃｉ Ｒｅｓ，２０００，６１（４）：３６４－￣３７０． ［１１］ＤｏｍｉｎｉｅｉＭ，Ｌｅ Ｂｌａｎｃ Ｋ。Ｍｕｅｌｌｅｒ Ｉ，ｅｔ ａ１．Ｍｉｎｉｍａｌ ｃｒｉｔｅｒｉａ ｆｏｒ ｄｅｆｉｎｉｎｇ ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｍｍａｌ ｃｅｌｌｓ．确ｅ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｔｈｅｒａｐｙ ｐｏｓｉｔｉｏｎ ｓｔａｔｅｍｅｎｔ［Ｊ３．Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ， ２００６，８（４）ｔ ３１５—７． ［１２］Ｃｈｕ Ｑ，Ｗａｎｇ ＹＰ，Ｆｕ ＸＱ，ｅｔ ａ１．Ｔｈｅ Ｐｈｅｎｏｍｅｎｏｎ ａｎｄ Ｍｅｃｈ— ｎｉｓｍ ｏｆ ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｏｎｅ Ｍａｒｒｏｗ Ｓｔｒｏｍａｌ Ｃｅｌｌｓ ｉｎｔｏ Ｎｅｕｒｏｎ ｌｉｋｅ ｅＣｌｌｓＥＪ］．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈｕａｚｈｏｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）（Ｓ１６７２－－０７３３），２００４，２４ （３）：２５９—２６１．