遗传ＨＥＲＥＤＩＴＡＳ（Ｂｅｉｊｉｎｇ）２５（４）：４９５～４９８，２００３ 专论与综述 叶绿体基因工程简介 李宏韬，赵淑青，赵彦修，张 慧 （山东师范大学逆境植物重点实验室，济南２５００１４） 摘要：叶绿体是植物细胞中一种特殊的细胞器。自１９８８年开始，人们认识到叶绿体在植物基因工程中的特殊地 位。叶绿体基因工程的特点，特别是其高效表达和安全性，使其受到越来越多的重视，本文对叶绿体转化作了较为 全面的介绍，包括其优势、方法、用途及不足等内容。 关键词：植物基因组工程；核转化；叶绿体；叶绿体转化；叶绿体基因组 中图分类号：Ｑ７８ 文献标识码：Ａ 文章编号：０２５３—９７７２（２００３）０４－－０４９５—０４ Ｔｈｅ Ｉｎｔｒｕｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ Ｇｅｎｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ＬＩ Ｈｏｎｇ—Ｔａｏ，ＺＨＡＯ Ｓｈｕ—Ｑｉｎｇ，ＺＨＡＯ Ｙａｎ—Ｘｉｕ，ＺＨＡＮＧ Ｈｕｉ （Ｋｅｙ Ｌａｂ ｏｆ Ｓａｌｔ Ｓｔｒｅｓｓ Ｐｌａｎｔｓ，Ｓｈａｎｄｏｎｇ Ｎｏｒｍａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｊｉｎａｎ ２５００１４，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ ｉｓ ａ ｋｉｎｄ ｏｆ ｓｐｅｃｉａｌ ｃｅｌｌ ｏｒｇａｎｉｎ ｐｌａｎｔ ｃｅｌｌｓ．Ｓｉｎｃｅ １ ９８８，Ｓｃｉｅｎｔｉｓｔｓ ｈａｖｅ ｒｅａｌｉｚｅｄ ｉｔｓ ａｄｖａｎｔａｇｅｓ ｉｎ ｐｌａｎｔ ｇｅｎｅ ｅｎｇｉｎｅａｒｉｎｇ．Ｉｔ ｓ ｈｉｇｈ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｓａｆｅｔｙ ｍａｄｅ ｉｔ ｂｅｅｎ ａｔｔａｃｈｅｄ ｍｏｒｅ ａｎｄ ｍｏｒｅ ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ ｔｏ．Ｔｈｉｓ ｐａｐｅｒ ｉｎ— ｔｒｏｄｕｃｅｓ ｔｈｅ ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｍａｒｉｏｎ，ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｉｔｓ ａｄｖａｎｔａｇｅｓ，ｍｅｔｈｏｄｓ，ｕｓｅｓ ａｎｄ ｄｅｆｅｃｔｓ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｐｌａｎｔ ｇｅｎｅｔｉｃ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ；ｎｕｃｌａｒ ｔｒａｎｓｆｅｏｒｍａｔｉｏｎ；ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ；ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ；ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ ｇｅｎｏｍｅ １８８２年，Ｓｔｒａｂｕｒｇｅｒ观察到藻类叶绿体能分裂并进入子 移到了核中，遗留在叶绿体中的基因是功能必需的一些基 代细胞；１９０９年，Ｂａｕｒ和Ｃｏｒｒｅｎｓ通过在三种枝条颜色不同 的紫茉莉之间进行杂交得出结论：质体是母本遗传的。这两 项发现引起了人们对叶绿体遗传的研究兴趣 ］。１９８８年， 因，有巨大的拷贝数（一个叶绿体中，基因拷贝数可达上百 个；一个细胞中，基因的拷贝数可达上万个），而且它们都是 原核生物来源的，具有原核生物基因的特点。叶绿体基因多 Ｂｏｙｎｔｏｎ等首次用野生型叶绿体ＤＮＡ转化了单细胞生物一 衣藻一突变体（ａｔｐＢ基因突变体），使其完全恢复光合作用 能力，标志着叶绿体基因工程的诞生Ｌ２ ；１９９０年，高等植物 烟草的叶绿体转化获得成功，叶绿体转化的优势逐渐被人们 认识并利用。 为多顺反子转录单位，这些转录单位中基因的排列顺序是高 度保守的［１３ 。 ２叶绿体转化的优点 叶绿体转化的最大优点是外源基因的高效表达 。这 ｌ叶绿体简介 叶绿体是绿色植物光合作用的场所，来源于古代的衣藻 类原核生物，含有双链环状ＤＮＡ（Ｍａｎｎｉｎｇ，１９７１）。叶绿体 是因为叶绿体基因本身就有巨大的拷贝数（５０００～１００００拷 贝／细胞），下表列出了几种外源基因在叶绿体转化和核转化 中表达丰度的比较： ＤＮＡ有ＩＲＡ和ＩＲＢ两个反向重复序列（分别位于Ａ链和Ｂ 链），两者基因大小完全相同，只是方向相反，它们之间有一 个大的单拷贝区（１ａｒｇｅ ｓｉｎｇｌｅ ｃｏｐｙ ｒｅｇｉｏｎ，ＬＳＣ），大小约 ８０ｋｂ，和一个小的单拷贝区（ｓｍａｌｌ ｓｉｎｇｌｅ ｃｏｐｙ ｒｅｇｉｏｎ，ＳＳＣ）， 大小约２０ｋｂ。多数叶绿体ＤＮＡ大小在１２０～１６０ｋｂ，最大 ２０００ｋｂ（伞藻），最小８５ｋｂ（刺海松）Ｌ１］。 叶绿体基因组中的基因在漫长的进化历程中，有许多转 甚至有报道外源蛋白积累达４Ｏ ＴＳＰ以上。 收稿日期：２００２—０５—２０；修回日期：２００２一ｌ２—１１ 作者简介：李宏韬（１９７９一），男，汉族，山东淄博人，在读硕士，专业方向：植物发育遗传 通讯作者：张慧（１９６４一），男，教授，博士导师，专业方向：植物发育遗传。 ４９６ 遗传ＨＥＲＥＤＩＴＡＳ（Ｂｅｉｊｉｎｇ）２００３ ２５卷 转基因植物的安全性是植物基因工程的一个很重要的 问题 。不仅从理论上，实践中也有许多实例证明了这种情 ３００倍 ；Ｒｏｃｋ等用ａａｄＡ基因转化番茄叶绿体，在果实中 有高达０．５ ＴＳＰ的蛋白积累，证明了叶绿体转化在食用性 疫苗的生产中的可行性＿ｓ 。其优势为：（１）减小了哺乳动 况确实存在，而且主要是通过花粉传播的ｌ１ ，这将很大程 度上限制转基因植物的实际生产应用。叶绿体转化可以避 免这种情况发生，因为绝大多数高等植物的叶绿体是母本遗 传的，花粉中不存在外源基因＿１ ” 。虽然来自野生种的 物病毒污染的危害；（２）低耗费的大规模生产能力。 ３．２在植物耐性方面。叶绿体转化也有广泛的应用： ３．２．１除草剂抗性 基因渐渗现象理论上可造成外源基因的逃逸，但实际上很少 发生 。 现有的多数除草剂都是通过抑制叶绿体中光合作用酶 来杀灭植物［１ ，在叶绿体中大量积累某种除草剂起作用的 酶，可以提高植物对这种除草剂的抗性，就允许使用更高剂 量的除草剂，来更有效地杀灭杂草。Ｄａｎｉｅｌｌ等将ＥＰＳＰＳ基 因转入烟草叶绿体中，使烟草对ｇｌｙｐｈｏｓａｔｅ的抗性达 叶绿体基因组小，与原核生物基因组相似，操作简便。 外源基因使用的启动子和终止子是叶绿体特异的（如：Ｐｒｒｎ、 ＰｐｓｂＡ、ＴｐｓｂＡ、Ｔｒｐｓｌ６），具有原核性，所以在原核生物中也 可以表达。如：Ｄａｎｉｅｌｌ在用ＥＰＳＰＳ转化烟草叶绿体时使用 １６Ｓ ｒＲＮＡ启动子［１ ，首先在Ｅ．ｃｏｌｉ中检测了载体Ｐｚｓ—ＲＤ－ ５ｍｍｏｌ／Ｌ，比野生型烟草高１Ｏ倍，１００ 稳定遗传，无基因 “逃逸”现象ｌ１ 。 ３．２．２抗虫性 ＥＰＳＰＳ的效率，才用于烟草叶绿体的转化，得到抗除草剂 Ｇｌｙｐｈｏｓａｔｅ的高抗烟草植株，并可稳定遗传，简化了载体优 化过程＿１ 。 １９９５年，Ｍａｌｉｇａ实验室用ＢＴ基因转化烟草叶绿体，ＢＴ 蛋白表达量为３ ～５ ＴＳＰ ］。Ｋｏｔａ于１９９９年、Ｃｏｓａ于 叶绿体中，功能相似的基因常常存在于同一操纵子 中［１ ，并同时表达，下表列除了叶绿体中几个常见的操纵 子 ｌｌ： 操纵子 １６Ｓ－￡ｒ’ｌＪ一２３ ４．５Ｓ－５Ｓｒ＂ ２００１年分别将ＢＴ Ｃｒｙ２Ａａ２基因转入烟草叶绿体，前者可 １００ 杀死４０００多倍抗性的抗性虫 ］，后者报道ＢＴ表达量 达４６．１ 。可以解决核转化中ＢＴ蛋白表达量低引起的害 虫的抗药性问题 ］。我国对叶绿体转化的研究主要是Ｂｔ基 基因产物 ｒＲＮＡ、Ｔｒｎａ 因ｌ１ ，张中林等发现，用未修饰的完整的Ｂｔ ＣｒｙｌＡ（Ｃ）基 ｒｐ１２３－ｒｐ１２－ｒｐｓ１９－ｒｐ１２２－ｒｐｓ３－ｒｐ１１６ 核糖体蛋白、其实银子１ ＲＮＡ聚合酶ａ亚基 ＲＮＡ聚合酶Ｂ、７亚基 ＰＳ ＩＩ和细胞色素亚基 ＰＳⅡ亚基、ｏｒｉｂ２、Ｔｒｎａ 因转化叶绿体，植物抗虫性最大；侯丙凯等人构建了用于油 菜叶绿体转化的载体ｐＮＲＡＢ，并验证了其杀虫性，为国内外 首次关于重要经济作物一油菜叶绿体转化的报道（２１）。 ３．２．３抗逆性 ｒｐ１１４－ｒｐｓＳ－ ｆ ｒｐｓ１１一ｒｐｏＡ ｒｐｏＢ－ｒｐｏＣ１一ｒｐｏＣ２ ｐｓｂＢ－ｐｓｂＨ－ｐｅｔＢ—ｐｅｔＤ ｐｓｂＡ－ｐｓｂＫ－ｐｓｂＤ－ｐｓｂＣ－ｏｒｉｂ２－ｔｒｎＧ ＰｓａＡ－ｐｓａＢ—ｒｐｓ１４ ａｔｐｌ－ａｔｐＨ－ａｔｐＦ－ａｔｐＨ ＰＳＩ亚基、核糖体蛋白 ＡＴＰ酶 人们早就注意到叶绿体转化在植物抗逆性研究中的重 要作用。已有的工作主要是针对活性氧的清除。 植物受到环境胁迫，细胞中产生过量的活性氧，将对植 物会造成巨大伤害。目前认为，活性氧的产生是环境胁迫对 所以外源基因也可以以多顺反子（ｐｏｌｙｃｉｓｔｒｏｎ）的形式 植物造成伤害的一个很重要的原因。 转化叶绿体，并被正常表达，避免了核转化中多基因转化时 常出现的基因沉默现象，有利于标记基因和目的基因及功能 相关基因的共同转化。使在一次转化中形成整条代谢途径 成为可能。 核转化中，外源基因的插入是随机的，这就要求大量的 活性氧的清除有酶促（ＳＯＤ、ＡＰＸ、ＧＡＴ等酶类）和非酶 促（抗坏血酸、谷光甘肽等还原性物质）两种途径。编码 ＳＯＤ、ＡＰＸ等酶的基因已经转入到烟草、苜蓿、马铃薯、棉花 的叶绿体中，提高了植物的耐氧化能力，从而提高了植物对 环境胁迫的耐受能力。将催化抗氧化物质生物合成的酶类 转化叶绿体，也可提高植物的抗氧化能力。 另外，在渗透保护物质方面，叶绿体高效的外源基因表 达是否有用武之地，还须作进一步研究。 筛选以找到需要的转化植株，而且随机的插入很难控制，可 能引起基因的失活，使转化后的表型不能真正地反映外源基 因的功能。叶绿体中的基因在不同的物种中是高度保守 的［１ ，可以利用同源整合，将外源基因定点地插入到两个基 因之间 （常用的同源序列有：ｒｂｃＬ／ａｃｃＤ、】６ＳｔｒｎＶ／ ｒｐｓ１２ｒｐｓ７、ｐｓｂＡ／ｔｒｎＫ、ｒｐｓ７／ｎｄｈＢ等），并不影响叶绿体原 有基因的的表达。 作物改良是人们急须解决的问题，以往的方法是提高植 物的耐逆、保水、营养吸收的能力，间接提高其产量。在作物 叶绿体中转入光合作用相关酶类（如：叶绿素合成相关酶、 ＲｕＢＰ羧化酶等）的基因，可直接大幅度地提高植物光合能 力，使作物产量明显增加。这也许是提高作物产量的最直 接、有效的方法。 ３叶绿体转化的应用 ３．１叶绿体转化已经被用于医用蛋白的生产 Ｓｔａｕｂ等将ｈｓｔ（ｈｕｍａｎ ｓｏｍａｔｏｔｒｏｐｉｎ）基因转入烟草叶 绿体中，有活性的ＨＳＴ蛋白的积累＞７％ＴＳＰ，为核转化的 ４ 目前存在的叶绿体转化的方法 基因枪法是目前采用最多、转化效率最高的方法 ］。 ４期 李宏韬等：叶绿体基因工程简介 ４９７ 大多数已经成功的转化都是用这种方法实现的。基因枪法 基因在叶绿体中的表达 。该基因的产物可被植物利用， 减少了单纯用于筛选的蛋白表达量。 比较简便，其操作与核转化中使用的基因枪法相似，适用于 各种外植体，造成的损伤小，外植体再生能力强。但比较昂 贵。 ５．４．２标记基因可以通过短的重复序列之间的同源重组去 除。但这是一个自发的过程，无法控制［２ 。 １９９３年，Ｇｏｌｄｓ等首次使用ＰＥＧ介导的方法实现了烟 草叶绿体的转化 。１９９６年Ｋｏｏｐ等用ＰＥＧ法将ａａｄＡ基 ５．４．３一种Ｃｒ￣ｌｏｘ叶绿体标记基因消除系统已经被人们 使用 。在标记基因两端各加一个ｌｏｘ位点，与目的基 因（其５ 端有烟草１６Ｓ ｒＲＮＡ启动子和人工合成的核糖体结 合位点，３ 端有一个包含绿藻ｒｂｃｌ基因的３ ＵＴＲ区的５００ｂｐ 的片段）导人烟草叶绿体的ｒｐｌ３２和ｔｒｎＬ基因之间＿２ ，每 因一起在无ＣＲＥ蛋白的条件下，导人叶绿体中。当标记基 因需要被去除时，就用常规方法将Ｃｒｅ基因导人核内，该基 因编码一种叶绿体定位的ｌｏｘ位点特异的重组酶，可以切掉 两个ｌｏｘ位点之间的标记基因。 ５．４．４已经成功转化的植物种类少，在已转化的几种植物 １０６个原生质体中可得到２Ｏ～４Ｏ个转化植株。但总的来说 ＰＥＧ法效率较低。而且，需要制备原生质体，操作复杂，有 待进一步优化。 中，只有烟草和番茄能通过有性生殖使外源基因稳定遗传， 而且番茄是唯一能产生有高的外源蛋白积累的可食用果实 的植物。人类的主要作物都未能实现真正的叶绿体转 化 ］。 １９９９年Ｋｎｏｂｌａｕｃｈ等发明了一种新的显微注射法ＧＥＦ （ｇａｌｉｎｓｔａｎ ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ｆｅｍｅｓｙｒｉｎｇｅ）Ⅲ用于叶绿体的转化。它 使用更细的毛细针管（直径０．１／￣ｍ）、更精确的推注方式（利 用镓、铟、锡合金受热膨胀产生的力），将外源基因直接注射 到叶绿体中。ＧＥＦ减小了对细胞的伤害，提高了再生效率， 能更精确地控制注射量。但操作较复杂，没有更多的报道验 证其可靠性。 ５．４．５ 还有一些与核转化共有的问题。１）对非目的昆虫的 毒害；２）外源基因的长期持续表达造成的能量的浪费等。 ６叶绿体转化有着广阔的应用前景： １）对叶绿体光合作用机制的基础研究。２）改善农作物 ５ 叶绿体转化存在的问题 ５．１叶绿体中巨大的基因拷贝数是其主要优点，也是其主 光合能力，提高作物产量。３）探索叶绿体转化时外源基因表 达的信号，使外源基因在特定部位、特定时间表达，减少能量 的浪费。 随着叶绿体转化的不断发展，拟南芥等模式植物叶绿体 转化的成功，叶绿体转化的优点更加明显，必将成为人们对 植物进行改造的重要手段，成为植物基因工程中一颗耀眼的 新星。 要困难所在［２ 。要使外源基因稳定遗传，就需要若干个细 胞世代使野生型基因拷贝完全去除，达到同质化（ｈｏｍｏｐｌａｓ ｔｏｒｎｉｃ）状态。如水稻中叶绿体转化比较容易实现，但按已有 的方法进行细胞培养，再生太快，无法达到同质化状态，现有 的细胞培养方法需要改善，减缓细胞分化速度，以有足够的 时间完成同质化过程。 ５．２ 用于叶绿体转化的载体系统不完善，不同物种转化效率 参考文献（Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ）： ［１３ ＬＩＵ Ｌｉａｎｇ—Ｓｈｉ，ｅｔ ａ１．Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｇｅｎａｔｉｅｓ［Ｍ］．Ｂｅｉｊｉｎｇ：Ｓｃｉ— ｅｎｃｅ Ｐｒｅｓｓ，１９９７． 不稳定。叶绿体转化中外源基因的插入是同源重组的过程， 同源序列的长度影响转化效率。ｓ．Ｒ．Ｓｉｋｄａｒ等进行的拟南芥 叶绿体转化中Ｄｒ］，使用的载体ｐＧＳＢ１Ａ的同源序列长左右各 为１Ｋｂ，较烟草中使用的载体ｐＺＳ１９７的同源序列（左：１． ５６Ｋｂ；右：１．２９Ｋｂ）和ｐＲＢ１５的同源序列（左：１．５６Ｋｂ；右：３． 刘良式，等．植物分子遗传学［Ｍ］．北京：科学出版社，１９９７年． ［２］ Ｂｏｙｎｔｏｎ Ｊ Ｅ，ｅｔ ａ１．Ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｉｎ Ｃｈｌａｍｙｄｏ一 ？ｌ＇ｌｏｒｌａ５ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ ｖｅｌｏｃｉｔｙ ｍｉｃｒｏｐｒ０ｊｅｃｔｉｌｅｓ［Ｊ］．Ｓｃｉｅｎｃｅ １ ９８８， ２４０：１５３４～１５３８． ６１Ｋｂ）短，所以转化效率低许多，１００次样品轰击中只有一个 转化植株，而烟草中一次样品轰击就可得到一个转化植株。 目前认为同源序列的长度在１～２Ｋｂ为最佳。 ５．３ 目前已存在的载体ｐＲＢ７０、ｐＲＢ９４、ｐＲＢ９５适用于双子 叶植物，但不适用于禾本科植物，因为禾本科植物（１）ｔｒｎ— ｆＭ／ｒｐｓ１４区有一个断点产生的大的倒位，（２）ｒｐｓｌ４的转录 有不同的ＲＮＡ编辑方式［２ 。 ５．４要筛选转化子就要使用标记基因，而标记基因高的表 达水平（＞１０ ＴＳＰ）对植物是一个很大的代谢负担 。目 ［３］Ｓｈｉｍａｄａ Ｈ，Ｓｕｇｉｕｒａ Ｍ．Ｆｉｎｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｆｅａｔｕｒｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｃｈｌｏｒｏ— ｐｌａｓｔ ｇｅｎｏｍｅ：ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｄ ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ ｇｅ— ｎｏｍｅｓＩ－Ｊ］．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，１９９１，１９：９８３～９９５． ［４］Ｋｎｏｂｌａｕｃｈ Ｍ，ｅｔ ａ１．Ａ ｇａｌｉｎｓｔａｎ ｅｘｐａｎｅｉｏｎ ｆｅｍｔｏｓｙｒｉｎｅ ｆｏｒ ｍｉ— ｃｒｏｉｎｊｉｃｔｉｏｎ ｏｆ ｏｒｇａｎｅｕｅｓ ａｎｄ ｐｒｏｋａｒｙｏｔｅｓ［Ｊ］．Ｎａｔｕｒｅ ｂｉｏｔｅｃｈ— ｎｏｌｏｇｙ，１９９９，１７：９Ｏ６～９０９． Ｅ５３ Ｒｕｆ Ｓ，ｅｔ ａ１．Ｓｔａｂｌｅ ｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｏｍａｔｏ ｐｌａｓｔｉｄｓ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａ ｆｏｒｅｉｇｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ ｆｒｕｉｔ［Ｊ］．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ— ｎｏｌｏｇｙ，２００１，１９：８７０～８７５． 前有以下解决方案： ５．４．１人们利用植物基因进行筛选。如用甜菜醛抗性，来 自于编码ＢＡＤＨ（ｂｅｆａｉｎｅ ａｌｄｅｈｙｄｅ ｄｅｈｙｃｈｒｏｇｅｎａｓｅ）的植物 ［６３ ＨＯＵ Ｂｉｎｇ—Ｋａｉ，ＸＩＡ Ｇｕａｎｇ－Ｍｉｎ，ＣＨＥＮ Ｚｈｅｎｇ—Ｈｕａ．Ｓｔｒａｔｅ ｇｉｅｓ ｆｏｒ ｏｐｔｉｍｉｚｉｎｇ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒｓ ｕｓｅｄ ｉｎ ｐｌａｎｔ ｇｅｎｅｔｉｃ ｅｎ— ｇｉｎｅｅｒｉｎｇ［Ｊ］．Ｈｅｒｅｄｉｔａｓ（Ｂｅ ｉｎｇ），２００１，２３（５）：４９２～４９７．