第４４卷第２３期 ２０１６年１２月 广州化工 Ｖ０１．４４ Ｎｏ．２３ Ｄｅｅ．２０１６ Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ 间接酶联免疫吸附测定河豚鱼中河豚毒素术 严忠雍 ，顾蓓乔 ，张小军 ，方益 ，李佩佩 ２，龙举 ２，高学慧 （１浙江省海洋水产研究所，浙江舟山３１６０２１；２浙江省海洋渔业资源可持续利用技术研究重点实验室， 浙江舟山３１６０２１；３浙江海洋大学水产学院，浙江舟山３１６０２１） 摘 要：为有效确保食用河豚鱼的安全性，进一步监测河豚鱼中河豚毒素，本方法应用间接酶联免疫吸附测定河豚鱼中河 豚毒素的含量，评估河豚鱼的安全风险程度。实验结果表明，间接酶联免疫吸附法测定河豚毒素灵敏度高，方法的在线性范围为 ２～１３５ ｇ／Ｌ内有良好的线性关系，且方法的回收率达到８２．４％～９２．５％，检出限能达到２ Ｉｘｇ／ｋｇ。本方法快速、简单，完全满足 实际工作的需要。 关键词：间接酶联免疫吸附；河豚鱼；河豚毒素 中图分类号：０６５６．３１ 文献标志码：Ｂ 文章编号：１００１—９６７７（２０１６）０２３—００９８—０３ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｅｔｒｏｄｏｔｏｘｉｎ ｉｎ Ｐｕｆｆｅｒ ｂｙ Ｉｎｄｉｒｅｃｔ Ｅｎｚｙｍｅ－ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ ＹＡＮ Ｚｈｏｎｇ—ｙｏｎｇ ，ＧＵ Ｂｅｉ—ｑｉａｏ ，ＺＨＡＮＧ Ｘｉａｏ－ｊｕｎ ，ＦＡＮＧ Ｙｉ ，ＬＩ Ｐｅｉ－ｐｅｉ ，ＬＯＮＧ Ｊｕ 一，ＧＡＯ Ｘｕｅ—ｈｕｉ （１ Ｍａｒｉｎｅ Ｆｉｓｈｅｒｉｅｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｚｈｅｊｉａｎｇ，Ｚｈｅｊｉａｎｇ Ｚｈｏｕｓｈａｎ ３ １ ６０２ １；２ Ｋｅｙ Ｌａｂ ｏｆ Ｓｕｓｔａｉｎａｂｌｅ Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｆｏｒ Ｆｉｓｈｅｒｙ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ ｏｆ Ｚｈｅｊｉａｎｇ，Ｚｈｅｊｉａｎｇ Ｚｈｏｕｓｈａｎ ３ １ ６０２ １；３ Ｚｈｅｊｉａｎｇ Ｏｃｅａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｚｈｅｊｉａｎｇ Ｚｈｏｕｓｈａｎ ３１６０２１，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ａｎ ｉｎｄｉｒｅｃｔ ＥＬＩＳＡ ｍｅｔｈｏｄ ｗａｓ ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ ｔｏ ｍｏｎｉｔｏｒ ｔｅｔｒｏｄｏｔｏｘｉｎ ｉｎ ｐｕｆｆｅｒ ａｎｄ ａｓｓｅｓｓ ｔｈｅ ｓｅｃｕｒｉｔｙ ｒｉｓｋ ｌｅｖｅｌ ｏｆ ｔｈｅ ｐｕｆｆｅｒ．Ｔｈｅ ｉｎｄｉｒｅｃｔ ＥＬＩＳＡ ｍｅｔｈｏｄ ｅｎｓｕｒｅｄ ｔｈｅ ｓａｆｅｔｙ ｏｆ ｐｕｆｆｅｒ ｉｆｓｈ ｃｏｎｓｕｍｐｔｉｏｎ ａｎｄ ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ｏｆ ｔｅｔｒｏｄｏｔｏｘｉｎ ｉｎ ｐｕｆｆｅｒ ｆｉｓｈ．Ｔｈｅ ｉｎｄｉｒｅｃｔ ＥＬＩＳＡ ｍｅｔｈｏｄ ｗａｓ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ，ｔｈｅ ｑｕａｎｔｉｉｆｃａｔｉｏｎ ｌｉｍｉｔ ｏｆ ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄ ｗａｓ ２ ｇ／ｋｇ ｗｉｔｈ ｓａｔｉｓｆａｃｔｏｒｙ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ．Ｔｈｅ ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｏｆ ｔｅｔｒｏｄｏｔｏｘｉｎ ｗａｓ ８２．４％一９２．５％ｉｎ ｔｈｅ ｒａｎｇｅ ｏｆ ２～１ ３５ ＬＬｇ／Ｌ．Ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄ ｗａｓ ｒａｐｉｄ ａｎｄ ｓｉｍｐｌｅ．ｍｅｔ ｔｈｅ ｎｅｅｄｓ ｏｆ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ｗｏｒｋ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｉｎｄｉｒｅｃｔ ｅｎｚｙｍｅ—ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ：ｐｕｆｆｅｒ：ｔｅｔｒｏｄｏｔｏｘｉｎ 河豚毒素（ＴＴｘ）是一种天然海洋生物神经毒素，分布广 泛，主要存在于河豚鱼中，在蟾蜍、蓝环章鱼、螺类等其他动 物体内也有存在。河豚毒素毒性极强，食用０．５ ｍｇ就可致人死 亡，河豚毒素可通过对细胞纳离子通道的阻断作用而抑制神经 冲动的传导，使感觉神经麻痹，四肢瘫痪，呼吸困难，最后因 呼吸抑制而死亡ｕ 。因此每年都有因食河豚鱼而导致中毒的 常复杂，且酶联免疫反应耗时长，操作难度较大。因此，有必 要建立一种快速、高效、简便、灵敏的检测方法。本研究建立 种以单克隆抗体为基础的免疫学检测方法，具有特异性强， 灵敏度高快速、操作简便、经济快捷的特点，满足河豚毒素快 一速筛检的需要，适合实际检测工作。 实 验 事件发生。鉴于河豚中毒的严重危害，我国严禁河豚鲜售鲜 １食。但由于人们嗜食习惯和河豚的昂贵的价格，我国鲜河豚非 法制售活动屡禁不止。因此建立快速、有效的检测和控制河豚 １．１仪器和试剂 ＭＫ３微孔板酶标仪，美国Ｔｈｅｒｍｏ Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ公司；ＭＳ２漩 毒素的方法显得非常必要。 ｒｉｆｕｇｅ５８１０高速离心机，德国 目前，河豚毒素的检测方法有生物测定法、高效液相色谱 涡混合器，德国ＩＫＡ公司；Ｃｅｎｔｆ公司；Ｔ１８匀浆机，德国ＩＫＡ公司；恒温孵育箱，上 法、气相色谱质谱法及免疫化学测定法等Ｈ Ｊ。其中生物测定 Ｅｐｐｅｎｄｏｆ法 一般需要专门动物，适用性差，且操作繁琐，费时费力 重复性差；物理化学检测法 虽灵敏度较高，但检测成本 高，仪器昂贵且检测周期长。酶联免疫吸附剂测定法 灵敏度 高、特异性强、检测成本低，其中国家标准ＧＢ／Ｔ ５００９．２０６— ２００７《鲜河豚鱼中河豚毒素的测定酶联免疫》 １２］是目前我国检 测河豚鱼中河豚毒素时普遍使用的方法。但是该方法前处理非 海一恒科技有限公司；纯度１＞９８％的河豚毒素标准品，德国Ｄｒ 公司；河豚毒素试剂盒，购自江苏美正生物有限公司。实验所 用其他试剂均为分析纯。 １．２溶液系统 １Ｔｒｘ标准溶液：将河豚毒素标准品溶于０．２ ｍｏｌ／Ｌ ｐＨ：４．０ 基金项目：浙江省科研院所公共科技服务项目（２０１６Ｆ３００２０）；舟山市科技计划项目（２０１５Ｃ３１０１１）。 第一作者：严忠雍（１９９０一），男，助理工程师，学士，主要从事渔业环境监测和水产品质量安全研究。 第４４卷第２３期 严忠雍，等：间接酶联免疫吸附测定河豚鱼中河豚毒素 表１ ｑｑ＇ｘ的回收率和相对标准偏差 Ｔａｂｌｅ １ Ａｖｅｒａｇｅ ｒｅｅｏｖｅｒｉｅｓ ａｎｄ ｒｅｌａｔｉｖｅ ｓｔａｎｄａｒｄ ｄｅｖｉａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｑＴＸ 乙酸盐缓冲液中，配制成浓度为１．０ ｍｇ／ｍＬ标准储备液，４℃ 避光保存，保存期为６个月。 １．３样品采集与制备 １．３．１样品采集 于我国东南沿海１１月间野捕河豚鱼，采集后低温冷藏处 理，保存在冷冻状态中运输至实验室。 １．３．２样品制备 对冷藏样品解冻后，用蒸馏水清洗鱼体表面污物，滤纸吸 干，将鱼分解成肌肉、肝脏、卵巢（雄性为精囊）等部分，各部 分组织分别用蒸馏水洗去血污，滤纸吸干水分后充分均质称 重。 注：Ｉｑ：３。 ２．３ ＥＬＩＳＡ检测方法与液相串联质谱法的比较 １．４样品提取 称取上述均质样品（１．００±０．０２）ｇ于５０ ｍＬ聚苯乙烯离心 管中，加入样品提取液１ ｍＬ，涡旋振荡３ ｒａｉｎ，４０００ ｒ／ｍｉｎ离 心１０ ｒａｉｎ，取５０ 供分析。 １．５样品测定 将试剂盒回温至室温，加样品５０ 每孔到微孔中，加河 豚毒素抗体试剂每孔５０ ，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后 置孵育箱２５℃避光反应３０ ｍｉｎ。揭开盖板膜，将孔内液体甩 干，加洗板液２５０ 每孔到微孔中。充分洗涤４次（每次间隔 １０ Ｓ）后，加河豚毒素酶标物溶液１００ ＩＬＬ每孔到微孔中，用盖 板膜盖板２５℃避光反应３０ ｍｉｎ，洗涤４次。加入底物液Ａ每 孔５０ ，再加入底物液Ｂ每孔５Ｏ ，用盖板膜盖板置孵育箱 ２５℃避光反应１５ ｍｉｎ。加入终止液５０ 每孔到微孔中，于双 波长４５０／６３０ ｎｍ测定吸光值。 ２结果与讨论 ２．１ 线性范围及检出限 用１－Ｉ＇）【毒素储备液分别配制浓度为２，５，１５，４５， １３５ ｇ／Ｌ的标准溶液，用间接ＥＬＩＳＡ法测定制作校准曲线，如 图１所示。该方法的线性范围为２～１３５ ｔＬｇ，＇Ｌ，对 ＩＴｘ的最低 检出限为２ ｇ／Ｌ。 ２．００ ５．ＯＯ １５．０ ４５．０ １３５．０ ｃ／（ｎｇ／ｍＬ） 图１ ｒＩ１）‘标准曲线 Ｆｉｇ．１ Ｔｈｅ ｓｔａｎｄ ｃｕｒｖｅ ｏｆ Ｔｒ）（ ２．２加标回收与精密度 在１．００ ｇ阴性河豚鱼肉中添加ｌ０、４０、７０、１００ ｋｇ的 Ｔｒｘ标准溶液，每个添加水平平行测定３次，计算其回收率和 精密度，见表１。结果表明，方法在１Ｏ一１００ ｇ／ｋｇ之间的添加 水平的回收率为８２．４％一９２．５％，完全符合Ｔｒｘ的检测要求。 用本方法和液相串联质谱法（采用文献报道［１３］方法）对 ６份河豚鱼肉样品分别进行Ｔｒｘ检测，并比对两种方法的检测 结果，结果如表２所示。由表２可知，两种检测方法的测定结 果基本符合，并无明显差异，表明本方法的灵敏度和准确度完 全满足Ｔｒｘ的检测要求。 表２ ＥＬＩＳＡ法与液质联用法的检测结果 Ｔａｂｌｅ ２ Ｔｈｅ ｔｅｓｔ ｒｅｓｕｌｔｓ ｂｙ ＥＬＩＳＡ ａｎｄ ＬＣ－ＭＳ ＮＤ为未检出。 ２．４实际样品测定 用本方法对我国东南沿海野捕的１０河豚鱼样品进行检测， 检测发现６个阳性样品。６个阳性样品对应的ＴＦＸ浓度分别为 ８．９２、２０．３ｌ、８２．５６、１５．８４、２５．２７和３７．７２ ｇ／ｋｇ，表明野生 河豚鱼多数带毒。因此，有必要对河豚鱼进行常规监测和严格 控制。 ３ 结论 本方法在原有的检测标准上进行条件优化，简化实验步 骤，缩短检测时间，提高工作效率。本方法的灵敏度和准确度 完全满足日常Ｔｒｘ的检测需要，适宜推广于实际工作使用。 参考文献 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０１２０ ０１３０ ０１４０ ０１５０ ０ｌ６０ ０１７０ ０１８０ ０１９０ ０２００ ０ 量也达到要求。并且进行循环设计，萃取剂得以循环使用，大 进料流率／（ｋｇ／ｈ） 大降低了能耗，节约成本，经济效益好。 参考文献 ［１］崔小明．异丙醇的生产应用及市场分析［Ｊ］．化工科技市场，２００２， ２５（９）：１２－１６． 图７异丙醚纯度随着萃取剂进料量的变化曲线图 Ｆｉｇ．７ Ｔｈｅ ｃｕｒｖｅ ｏｆ ｔｈｅ ｐｕｒｉｔｙ ｏｆ ｉｓｏｐｒｏｐｏｌ ｅｔｈｅｒ ｃｈａｎｇｉｎｇ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｎｇ ａｇｅｎｔ ｖｏｌｕｍｅ 由图７可知，随着进料（Ｗ一１）的位置变化，分离水的质量 浓度在进料位置为第８块塔板时达到最大值９９．７７％。异丙醚 ［２］刘中民，朱书魁．丙烯直接水合法生产异丙醇技术［Ｊ］．精细与专 用化学品，２００５，ｉ（１５）：１－４． ［３］孙兰义．化工流程模拟实训一Ａｓｐｅｎ Ｐｌｕｓ教程［Ｍ］．北京：化学工业 出版社，２０１２：１００—２００． 纯度随萃取剂流量大小的变化取１６０ ｋｇ／ｈ最合适。 ３ 结论 ［４］叶青．异丙醚一水三元共沸物分离［Ｊ］．化工进展，２０１１，３０（７）： １４３５—１４３７． ３．１ 产品纯度 从模拟的物流表中可以看到产品物流，Ｄ一２中异丙醚浓度≥ ［５］黄路，叶青．异丙醇一异丙醚一水三元共沸物分离［Ｊ］．石油与天然 气化工，２０１０：２５－３０． （上接第９９页） ［４］周晓翠，谢光洪，刘国文，等．河豚毒素检测方法的研究进展［Ｊ］． 中国畜牧兽医，２００８，３５（７）：４３—４５． ［５］张理，谢克勤，赵金山，等．用昆明小鼠定量测试河豚毒素的研究 ［Ｊ］．中国食品卫生杂志，２００４，１６（６）：４９７—５００． ［６］ 段发淼，谢心磊，朱宝平．用小鼠单位法检测河豚毒素［Ｊ］．中国卫 生检验杂志，２０００，１０（４）：４６３—４６４． ［９］ Ｍａｒｇａｒｅｔ Ａ Ｏ’ｌｅａｒｙ，Ｊｅｎｎｉｆｅｒ Ｊ Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ｇｅｏｆｆｒｅｙ Ｋ Ｉｓｂｉｓｔｅｒ．Ｕｓｅ ｏｆ ｈｉｇｈ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｔｏ ｍｅａｓｕｒｅ ｔｅｔｒｏｄｏｔｏｘｉｎ ｉｎ Ｓｅｌｑｌｍ ａｎｄ ｕｒｉｎｅ ｏｆ ｐｏｉｓｏｎｅｄ ｐａｔｉｔｅｎｔｓ［Ｊ］．Ｔｏｘｉｃｏｎ，２００４（４４）：５４９— ５５３． ［１Ｏ］张虹，柳正良，黄蓓琳，等．反向离子对一高效液相色谱法测定河豚 毒素［Ｊ］．中国现代应用药学杂志，２００１，１８（３）：１９７～１９８． ［１１］宫慧芝，计融，江涛，等．河豚毒素单抗ＥＬＩＳＡ检测试剂盒的研制 ［Ｊ］．中国公共卫生，２００５，２１（１２）：１４２３—１４２４． ［１２］国家标准ＧＢ／Ｔ ５００９．２０６—２００７鲜河豚鱼中河豚毒素的测定酶联 免疫［Ｓ］．２００７． ［７］林蔚，林健，黄宗锈．用ＩＣＲ小鼠生物法测定烤鱼片河豚毒素的研 究［Ｊ］．海峡预防医学杂志，２００８，１４（４）：４９—５０． ［８］ 陈唯真，朱伟华，俞如英．ＨＰＬＣ法测定河豚毒素的含量及稳定性 ［Ｊ］．药物分析杂志，２００４，２４（１）：４１—４３． ［１３］李爱峰，于仁成，周名江．液相色谱一电喷雾离子阱质谱联用分析 河豚毒素［Ｊ］．分析化学，２００７，３５（３）：３９７—４００．