湖南农业科学２０１０，（１１）：７５～７７ Ｈｕｎａｎ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ 三重ＲＴ—ＰＣＲ快速检测多种马铃薯病毒的研究 陈阳婷 ，宁红。，张敏 （１．成都农林科学院园艺研究所，四川成都６１００７２；２．四川省植物检疫站， 四川成都６１００４１；３．四川农业大学，四川雅安６２５０１４） 摘要：依据马铃薯Ｘ病毒、Ｓ病毒、Ａ病毒及卷叶病毒的基因组ＲＮＡ保守序列设计特异性引物对，从反转录反应中ｄＮＴＰｓ浓 度、退火温度、ＰＣＲ反应中Ｍ 浓度、循环条件４方面优化三重ＲＴ—ＰＣＲ反应条件，可以同步扩增出上述４种病毒，分别得到６２０ ｂｐ（ＰＶＸ）、４３５ ｂｐ（ＰＶＳ）、３００ ｂｐ（ＰＶＡ）、２２２ ｂｐ（ＰＬＲＶ）大小的扩增片段。结果表明，反转录反应中ｄＮＴＰｓ浓度和ＰＣＲ反应中Ｍｇ２＋对 整个反应的影响最大；其次是退火温度；循环条件对ＲＴ—ＰＣＲ影响较小。优化的三重ＲＴ—ＰＣＲ反应体系为马铃薯病毒的检测提供 了一种快速、灵敏、简便的方法，对马铃薯病毒的早期检测和防治提供了有效手段。 关键词：马铃薯；ＲＴ—ＰＣＲ；病毒检测 中图分类号：￥４１—３０ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００６—０６０Ｘ（２０１０）１１—００７５—０３ Ｑｕｉｃｋ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｐｏｔａｔｏ Ｖｉｒｕｓｅｓ ｂｙ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＲＴ－ＰＣＲ ＣＨＥＮ Ｙａｎｇ－ｔｉｎｇ’，ＮＩＮＧ Ｈｏｎｇ ，ＺＨＡＮＧ Ｍｉｎ。 ｆ１．Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆＨｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｃｈｅｎｇｄｕ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｌａ ａｎｄ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｃｈｅｎｇｄｕ ６１００２Ｚ ＰＲＣ； ２．Ｓｉｃｈｕａｎ Ｐｌａｎｔ Ｑｕａｒａｎｔｉｎｅ Ｓｔ￣ｉｏｎ，Ｃｈｅｎｇｄｕ ６１００４１，ＰＲＣ；３．Ｓｉｃｈｕａｎ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｙａ＂ａｎ ６２５０１４，ＰＲＣ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ ｐｆｉｍｅ￣ｆｏｒ ｐｏｔａｔｏ ｖｉｒｕｓ Ｘ（ＰＶＸ），ｐｏｔａｔｏ ｖｉｒｕｓ Ｓ（ＰＶＳ），ｐｏｔａｔｏ ｖｉｕｒｓ Ａ（ＰＶＡ）ａｎｄ ｐｏｔａｔｏ ｌｅａｆ ｒｏｌｌ ｖｉｒｕｓ （ＰＬＲＶ）ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｗｅｒｅ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅｉｒ ｃｏａｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｒｅｇｉｏｎ，ａｎｄ ａ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ（ｍ—ＲＴ－ＰＣｒｔ）ｗａｓ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｆｉ＇ｏｍ ｄＮＴＰｓ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ，ａｎｎｅａｌｉｎｇ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ，Ｍ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｙｃｌｉｃ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ．Ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｉｎ－ＲＴ—ＰＣＲ ｃａｎ ａｍｐｌｉｆｙ ＰＶＸ，ＰＶＳ，ＰＶＡ ａｎｄ ＰＬＲＶ ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｌｙ，ａｎｄ ｔｈｅ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｗｅｒｅ ６２０ ｂｐ（ＰＶＸ），４３５ ｂｐ（ｅｖｓ），３００ ｂｐ（ＰＶＡ）ａｎｄ ２２２ ｂｐ（ＰＬＲＶ）．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｄＮＴＰｓ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ａｔ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｓｔａｇｅ（ＲＴ）ａｎｄ ｔｈｅ Ｍ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ａｔ ＰＣＲ ｓｔａｇｅ ｈａｄ ａ ｇｒｅａｔ ｉｍｐａｃｔ ｏｎ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ，ａｎｄ ｎｅｘｔ ｗａｓ ｔｈｅ ａｎｎｅａｌｉｎｇ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ａｔ ＰＣＲ ｓｔａｇｅ；ｔｈｅ ｃｙｃｌｉｃ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｈａｓ ｓｍａｌｌ ｉｍｐａｃｔ ｏｎ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｒｅｓｕｌｔｓ．Ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｉｎ—ＲＴ－ＰＣＲ ｐｒｏｖｉｄｅ ａ ｑｕｉｃｋ，ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ａｎｄ ｓｉｍｐｌｅ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ｐｏｔａｔｏ ｖｉｒｕｓｅｓ， ａｎｄ ｉｔ ａｌｓｏ ｐｒｏｖｉｄｅ ａ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｗａｙ ｆｏｒ ｅａｒｌｙ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｐｏｔａｔｏ ｖｉｕｒｓｅｓ Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｐｏｔａｔｏ；ＲＴ—ＰＣＲ；ｖｉｒｕｓ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ 快速诊断马铃薯病毒病是种薯品质鉴定的重要 优化反应条件。优化后的三重ＲＴ—ＰＣＲ反应体系，可 内容。在我国，主要的马铃薯病毒种类有马铃薯ｘ 以同时检测田间复合侵染的３种马铃薯病毒。 病毒（Ｐｏｔａｔｏ ｖｉｒｕｓ Ｘ，ＰＶＸ），马铃薯Ｙ病毒（Ｐｏｔａｔｏ １材料与方法 ｖｉｒｕｓ Ｙ，ＰＶＹ），马铃薯卷叶病毒（Ｐｏｔａｔｏ ｌｅａｆ ｒｏｌｌ ｖｉｒｕｓ，ＰＬＲＶ），马铃薯Ａ病毒（Ｐｏｔａｔｏ ｖｉｒｕｓ Ａ，ＰＶＡ） １．１试验材料 及马铃薯ｓ病毒（Ｐｏｔａｔｏ ｖｉｒｕｓ Ｓ，ＰＶＳ）。对生产影响 从田间采集感染有马铃薯病毒的发病植株，以 最大的病毒是ＰＶＹ和ＰＬＲＶ，其次是ＰＶＸ和ＰＶＡ， ＥＬＩＳＡ方法确定病毒种类，分别将ＰＶＸ、ＰＶＳ、ＰＬＲＶ ＰＶＳ影响较小｝ｌＪ。通过３ ａ田间调查及分子检测，发 和ＰＶＡ混合接种于防虫温室内种植的健康马铃薯 现在四川地区，ＰＶＸ、ＰＶＳ、ＰＶＡ及ＰＬＲＶ往往复合 植株上，以植物组织培养室内经过茎尖脱毒的马铃 侵染，迫切需要经济方便的多重检测方法。本研究设 薯组培苗作为阴性对照。 计了这４种病毒的引物，从退火温度、反转录反应中 １．２病毒ＲＮＡ的提取 ｄＮＴＰｓ浓度、ＰＣＲ反应中Ｍｇ 度、循环条件４方面 采用北京ＴＩＡＮＧＥＮ生化科技有限公司的 ＲＮＡｐｒｅｐ Ｐｌａｎｔ Ｋｉｔ试剂盒提取带毒马铃薯植株的 收稿日期：２０１０—０４—０９ 总ＲＮＡ作为待测的病毒ＲＮＡ。 基金项目：ｔ￣Ｊｌｌ省科技攻关项目（０７ＦＧ００２～００８） １．３ ｃＤＮＡ的合成 作者简介：陈阳婷（１９８３一），女，四川宜宾县人，硕士，主要研 究方向为植物病理。 根据ＰＶＸ、ＰＶＳ、ＰＶＡ以及ＰＬＲＶ的基因组 通讯作者：宁红 ＲＮＡ保守序列设计特异性引物对（表１）。反转录体 ７６ 湖南农业科学 第１１期 系（２ｏ ＩＬＬ）：病毒总ＲＮＡ ２．５ ，２０ ｐｍｏｌ／Ｌ病毒下 游引物各０．５ ＩＬＬ，５ｘＭＭＬＶ ｂｕｆｆｅｒ（ＭＢＩ）４ Ｌ，２０ ｕ／ ＩｘＬ ＲＮＡ抑制剂（Ｒｎａｓｉｎ，ＭＢＩ）０．５ ＩＬＬ，２００ Ｕ／ＩｘＬ ＭＭＬＶ反转录酶（ＭＭＬＶ ＲＴ，ＭＢＩ）１ ＩＬＬ，ｄＮＴＰｓ分 别选用０．５、１、１．５ ｍｍｏｌ／Ｌ，ＤＥＰＣ处理水补足２０ ２．１反转录（ＲＴ） 反转录体系中ｄＮＴＰｓ浓度为０．５、１、１．５ ｍｍｏｌ／Ｌ 时，对三重ＲＴ—ＰＣＲ同时检测ＰＶＸ、ＰＶＡ和ＰＬＲＶ 的影响如图１一Ａ所示，当ｄＮＴＰｓ小于１ ｍｍｏｌ／Ｌ， ＰＶＡ扩增靶带很弱；当ｄＮＴＰｓ浓度为１～１．５ ｍｍｏｌ／Ｌ 时能扩增出ＰＶＸ、ＰＶＡ、ＰＬＲＶ这３种病毒的靶标条 Ｌ。反转录条件：４２℃３０ ｒａｉｎ，９４￣Ｃ ５ ｒａｉｎ，４￣Ｃ保存。 扩增反应在ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ ＰＣＲ扩增仪中进行。 表１用于ＦＩＴ—ＰＣＲ反应的４种马铃薯病毒引物对 ２ ９ ７ ５ ３∞∞∞∞∞ １．４ ＰＣＲ反应 ＲＣＲ体系（总体积２５ Ｌ）：取４ Ｌ合成的 ｅＤＮＡ作为反应模板，ＩＯｘＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒ（ＢｉｏＢＲＫ）２．５ ，５ ｕ／ｔｘＬ Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶（ＢｉｏＢＲＫ）０．５ ＩｘＬ，１０ ｍｍｏｌ／Ｌ ｄＮＴＰ ０．５ Ｌ，ＭｇＣ１２分别选用２．５、３、３．５ ｍｍｏｌ／Ｌ，２０ ｐｍｏｌ／Ｌ ４种病毒上游引物和下游引物各 １ ＩｘＬ，双蒸水补足２５ Ｌ。退火温度从５７￣Ｃ设到 ６１℃；ＰＣＲ反应条件是９４￣（２变性３０ ｓ，６０￣Ｃ退火３０ Ｓ，７２℃延伸１ ｒａｉｎ，设置为３Ｏ个循环、３５个循环、４０ 个循环、４５个循环，最后７２℃延伸１０ ｒａｉｎ；ＰＣＲ反 应在ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ ＰＣＲ扩增仪中进行。ＰＣＲ反应结束 后，取出扩增产物５ Ｌ进行琼脂糖凝胶电泳检测。 ｌ ９７ ５ １．５ 三重ＲＴ—ＰＣＲ的组合 ∞∞∞ ∞ 三重ＲＴ—ＰＣＲ检测ＰＶＸ、ＰＶＳ、ＰＶＡ和ＰＩ ＲＶ 共有４种组合方式，分别是：（１）ＰＶＸ、ＰＶＳ和ＰＶＡ； （２）ＰＶＸ、ＰＶＳ和ＰＬＲＶ；（３）ＰＶＸ、ＰＶＡ和ＰＬＲＶ；（４） ＰＶＳ、ＰＶＡ和ＰＬＲＶ。每一种组合的反应体系都从 ｄＮＴＰｓ浓度对反体转录的影响、退火温度对ＰＣＲ的 影响、Ｍｇ２ 浓度对ＰＣＲ的影响和反应程序对ＰＣＲ 的影响４个方面进行优化。 １．６ ＲＴ—ＰＣＲ产物的克隆和测序 ＲＴ—ＰＣＲ产物切胶回收后，按标准方法克隆到 ＰＧＭ—Ｔ中，ＰＣＲ法筛选阳性菌落，提取质粒ＤＮＡ， 酶切验证后分别测序（上海英俊生物技术有限公 司）。 ２结果与分析 带；当ｄＮＴＰｓ浓度为１．５ ｍｍｏｌ／Ｌ时，扩增效果最好。 三重ｌｉｔ—ＰＣＲ同时检测ＰＶＳ、ＰＶＡ和ＰＬＲ￣的影响 如图１一Ｂ所示，ｄＮＴＰｓ浓度为０．５～１．５ ｍｍｏｌ／Ｌ都能 扩增出３种病毒条带。 皇；Ａ 羞 Ｂ 图１ ｄＮＴＰｓ浓度的优化 （Ｍ：ＤＮＡ ｍａｒｋｅｒ；１－３：反应中分别加入０．５、１、１．５ ｍｍｏｌ／Ｌ ｄＮＴＰｓ） 本试验采用的是两步法二重ＲＴ—ＰＣＲ，首先反 转录合成ｅＤＮＡ，然后取一部分ｅＤＮＡ进行ＰＣＲ扩 增。如果反转录没有合成ｅＤＮＡ或合成的较少，将 直接影响到ＰＣＲ扩增的效果，所以反转录反应相 对较为重要ｌｌｌ。可知，ｄＮＴＰｓ浓度是影响反转录反应 重要的因素。 ２．２聚合酶链式反应（ＰＣＲ） ２．２．１ 退火温度对ＰＣＲ的影响 如图２一Ａ所示。 退火温度从５８℃到６２％都能同时扩增出ＰＶＸ、 ＰＶＳ、ＰＬＲＶ ３种病毒；从图２一Ｂ可知，当退火温度 达到６１￣Ｃ时，三重ＲＴ—ＰＣＲ仅能扩增出ＰＶＳ和 ＰＶＡ两种病毒。当退火温度为６Ｏ℃时，病毒的三条 靶标条带清晰且亮度高，扩增效果最好。所以，退火 温度对ＰＣＲ也有一定的影响。 Ｍ １ ２ ３ ４ ５ ６ ６ ｌ ２ ３ ４ ５ Ｍ ■ ■ Ａ Ｂ 图２退火温度的优化 （Ｍ：ＤＮＡ ｍａｒｋｅｒ；１～５：退火温度分别是５８、５９、６０、 ６１、６２￣Ｃ；６：阴性对照） ２．２．２ Ｍｇ 浓度对ＰＣＲ的影响ＰＣＲ体系中Ｍｇ２＋ 浓度为２．５、３．０、３．５ ｍｍｏｌ／Ｌ时，对三重ＲＴ—ＰＣＲ同 时检测ＰＶＡ、ＰＶＹ和ＰＬＲＶ的影响如图３一Ａ所示， ３ 第１１期 陈阳婷等：三重ＲＴ—ＰＣＲ快速检测多种马铃薯病毒的研究 当Ｍｇ ｈ浓度为２．５ ｍｍｏｌ／Ｌ时，无法扩增出ＰＶＡ，只 能扩增出ＰＶＳ和ＰＬＲＶ的靶标条带；当Ｍｇ２＋￣度增 为３ ｍｍｏｌ／Ｌ，能同时扩增出ＰＶＳ、ＰＶＡ、ＰＬＲＶ ３种 ＢＬＡＳＴ报道的ＰＶＳ病毒的序列同源性达到９８％； ＰＶＸ的ＲＴ—ＰＣＲ扩增产物的序列与ＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴ 报道的ＰＶＸ病毒的序列同源性达到９６％。 病毒的靶标条带；再继续增大Ｍｇｚ 浓度，对３种病 毒的扩增效果不好。如图３一Ｂ所示，Ｍｇ 浓度为 ３讨论 ２．５、３．０、３．５ ｍｍｏｌ／Ｌ时，都能同时扩增出ＰＶＸ、ＰＶＳ、 ＰＶＡ的靶标条带，当Ｍｇ 浓度增为３ ｍｍｏｌ／Ｌ，扩增 效果最好。因此，Ｍｇ２＊￣度对ＰＣＲ扩增的影响较大。 传统的指示植物法检测病毒费时费力且灵敏 度低，目前应用最广的是以病毒抗血清为基础的酶 联免疫法（ＥＬＩＳＡ）检测病毒。ＥＬＩＳＡ法比传统的检 测方法灵敏度提高了许多，但存在着假阳性或假阴 Ｍ ｌ ２ ３ ４ ４ １ ２ ３ Ｍ 臣ｖ ● ｌ ９ ７ ５ ３ ∞∞∞∞ Ａ Ｂ 图３ ＭｇＣ１ 浓度的优化 （Ｍ：ＤＮＡ ｍａｒｋｅｒ；１－３：ＭｇＣｌ２浓度分别为２．５、３．０、３．５ ｍｍｏｌ／Ｌ；４：阴性对照 ２－３反应程序 如图４一Ａ所示，ＰＣＲ的循环数从３０到４５均能 同时扩增出ＰＶＸ、ＰＶＳ和ＰＶＡ，但是当循环数目小 于３０时，ＰＶＡ的目的条带不明显；当循环数目大于 ４０时，ＰＶＡ的目的条带非常微弱；效果较好的是３５ 个循环。从图４一Ｂ，可知ＰＣＲ的循环数从３Ｏ到４５ 均能同时扩增出ＰＶＸ、ＰＶＡ和ＰＬＲＶ，扩增效果差异 不大。总的来说，反应程序对整个反应影响不大。 Ｍ ｌ ２ ３ ４ ５ Ｍ ｌ ２ ３ ４ ５ 圉 一 图４循环次数的优化 （Ｍ：ＤＮＡ ｍａｒｋｅｒ；ｌ～４：ＰＣＲ循环数分别为３０、３５、 ４０、４５个循环；５：阴性对照） ２．４ ＲＴ—ＰＣＲ产物的克隆及测序 切胶回收ＰＶＸ、ＰＶＳ、ＰＶＡ和ＰＬＲＶ的ＲＴ— ＰＣＲ产物，克隆到ＰＧＭ—Ｔ载体中，通过ＰＣＲ验证 得到的白色菌落分别含有以上几种病毒的ｃＤＮＡ， 提取质粒测序。测序结果与ＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴ报道的病 毒基因序列对比，ＰＬＲＶ的ＲＴ—ＰＣＲ扩增产物的序 列与ＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴ报道的相应病毒的序列同源性 达到１００％；ＰＶＡ的ＲＴ—ＰＣＲ扩增产物的序列与 ＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴ报道的ＰＶＡ病毒的序列同源性达到 ９９％；ＰＶＳ的ＲＴ—ＰＣＲ扩增产物的序列与ＮＣＢＩ 性现象，也无法区分因外壳蛋白基因有一定同源性 的病毒类型［２１，并且不足以检测含量极少的韧皮部病 毒及休眠种薯中的病毒。近年来发展的反转录聚合 酶链反应（ＲＴ—ＰＣＲ）方法因其具有灵敏、快速、特异 性强等优点，在植物病毒的检测上显示出强大的优 势『３】。在国内外已有单一ＲＴ—ＰＣＲ检测ＰＶＹ、ＰＬＲＶ、 ＦＳＴＶｄ等的应用。 在ＲＴ—ＰＣＲ中使用一对以上的引物就称之为 多重ＲＴ—ＰＣＲ，它能够同时扩增目的ＤＮＡ中的几 个片段，以节省模板、时间和减少费用。设置多重 ＰＣＲ反应体系必须确保反应中所有的引物有相近 的熔解温度，扩增产物应该大小相近但又能够通过 电泳分开。本研究设计的这４种病毒的引物，基本 满足以上条件；并且从退火温度、ｄＮＴＰｓ浓度、Ｍｇ 浓度、循环条件４方面优化反应条件，将其应用于 同时扩增３种病毒已成功实现。与单重ＲＴ—ＰＣＲ相 比，三重ＲＴ—ＰＣＲ更适合于检测田问复合侵染的多 种病毒，可以大大简化病毒检测的工作量，又能进 一步降低成本，更有利于马铃薯种苗病毒实际检 测，对于生产实践有着非常重要的意义。研究结果 表明，采用该反应程序可以稳定性地检出田间自然 感染的几种主要马铃薯病毒。并可以此研究结果为 基础，对反应体系做进一步的优化，建立四重ＲＴ— ＰＣＲ同时检测多种马铃薯病毒的技术。 参考文献： 【１】袁青，殷幼平，王中康．二重ＲＴ—ＰＣＲ快速检测马铃薯病毒 的方法ＩＪＪ．植物检疫，２００５，１９（３）：１３５—１３８． 【２Ｊ Ｊｅｌｋｍａｎｎ Ｗ，Ｋｅｉｍｋｏｎｒａｄ Ｒ．Ａｎ ｉｍｍｕｎｏ—ｃａｐｔｕｒｅ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｌａｔｅ—ｔｒａｐｐｅｄ ＥＬＩＳＡ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐ— ｐｌｅ ｓｔｅｍ ｓＰｊｎｉｎｇ ｖｉｒｕｓ［Ｊ］．Ｐｈｙｔｏｐａｌｈｏｌｏｇｙ，】９９７，】４５：４９９－５０４ ［３］李浩戈，吴元华，赵秀香．马铃薯Ｙ病毒的ＲＴ—ＰＣＲ检Ｎ［ＪＩ．沈 阳农业大学学报，１９９０；３０（３）：２４４—２４６． （责任编辑：卢红玲）