第２４卷第１期 ２０１８年２月 上洛天 报（自然科学版） Ｖｂ１．２４ ＮＯ．１ Ｆｅｂ．２０１８ ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＳＨＡＮＧＨＡＩ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ（ＮＡＴＵＲＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥ） ＤＯｈ １０．１２０６６／ｊ．ｉｓｓｎ．１００７—２８６１．１７５７ 组蛋白赖氨酸甲基转移酶ＤＯＴ１Ｌ抑制剂分子水平 同 通量筛选模型的建立 徐威 ， 苏明波 ，周宇波 （１．上海大学生命科学学院，上海２００４４４；２．国家新药筛选中心，上海２０１２０３） 摘要： 类端粒沉默干扰体１（ｄｉｓｒｕｐｔｏｒ ｏｆ ｔｅｌｏｍｅｒｉｃ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ １－ｌｉｋｅ，ＤＯＴＩＬ）是一种能够催 化组蛋白Ｈ３第７ｇ位赖氨酸（Ｈ３Ｋ７９）发生甲基化修饰的表观遗传调控酶，是第一个被发现不 含有ＳＥＴ结构域的赖氨酸甲基转移酶．Ｈ３Ｋ７９位点的甲基化程度能够影响和调控某些特定 基因的表达，与急性髓性白血病（ａｃｕｔｅ ｍｙｅｌｏｃｙｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ，ＡＭＬ）的发生与发展密切相关． 为建立一种分子水平ＤＯＴＩＬ小分子抑制剂的高通量筛选模型，以ＥＰＺ一５６７６为阳性化合物， 探讨最佳反应酶浓度、底物浓度及反应时间等，并对优化后的反应体系进行检测和确认．通过 对多种参数优化使得高通量筛选体系的Ｚ 因子达到０．５４，表明已成功建立了ＤｏＴ１Ｌ小分子 抑制剂高通量筛选模型． 关键词：类端粒沉默干扰体ｌ（ｄｉｓｒｕｐｔｏｒ ｏｆ ｔｅｌｏｍｅｒｉｃ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ １－ｌｉｋｅ，ＤＯＴＩＬ）；组蛋白赖氨 酸甲基转移酶：小分子抑制剂：高通量筛选 中图分类号：Ｒ ９１４．４ 文献标志码：Ａ 文章编号：１００７．２８６１（２０１８）０１—０１２６．０８ Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ ｏｆ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ－ｂａｓｅｄ ｈｉｇｈ—ｔｈｒｏｕｇｈｏｕｔ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｍｏｄｅｌ ｆｏｒ ｈｉｓｔｏｎｅ ｌｙｓｉｎｅ ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ＤｏＴ１Ｌ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ＸＵ Ｗｅｉ ， ＳＵ Ｍｉｎｇｂｏ。，ＺＨＯＵ Ｙｕｂｏ。 （１．Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｈａｎｇｈａｉ ２００４４４，Ｃｈｉｎａ； ２．Ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｄｒｕｇ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ，Ｓｈａｎｇｈａｉ ２０１２０３，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＤＯＴ１Ｌ ｉｓ ａｎ ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ ｅｎｚｙｍｅ ｔｈａｔ ｃａｎ ｃａｔａｌｙｚｅ ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｔ ｈｉｓｔｏｎｅ ３ ｌｙｓｉｎｅ ７９（Ｈ３Ｋ７９１．Ｉｔ ｉＳ ａｌＳＯ ｆｏｕｎｄ ｔｏ ｂｅ ｔｈｅ ｉｆｒｓｔ ｌｙｓｉｎｅ ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ｗｉｔｈｏｕｔ ａ ＳＥＴ ｄｏｍａｉｎ．Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗ ｔｈａｔ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｌｅｖｅｌ ｏｆ Ｈ３Ｋ７９ ｃａｎ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｓｏｍｅ ｇｅｎｅｓ，ｃｌｏｓｅｌｙ ｒｅｌａｔｅｄ ｔｏ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａｃｕｔｅ ｍｙｅｌｏｃｙｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ （ＡＭＬ）．Ｔｈｉｓ ｗｏｒｋ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｓ ａ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ—ｂａｓｅｄ ｈｉｇｈ—ｔｈｒｏｕｇｈｏｕｔ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｍｏｄｅｌ ｆｏｒ ｄｉｓ— ｃｏｖｅｒｉｎｇ ｎｏｖｅｌ ＤＯＴ１Ｌ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ． ＥＰＺ一５６７６ Ｗａｓ ｕｓｅｄ ａｓ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｔｏ ｏｐｔｉｍｉｚｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｓｓａｙ ａｎｄ ｅｎｓｕｒｅ ａｐｐｒｏｐｒｉａｔｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｎｚｙｍｅ ａｎｄ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ，ａｎｄ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｔｉｍｅ，ｅｔｃ．Ｔｈｅ ａｓｓａｙ Ｗａｓ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ，ａｎｄ ｔｈｅ Ｚ 一ｆａｃｔｏｒ Ｗａｓ ａｂｏｕｔ ０．５４，ｉｎｄｉｃａｔｉｎｇ ｔｈａｔ ａ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ—ｂａｓｅｄ ｈｉｇｈ—ｔｈｒｏｕｇｈｏｕｔ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｍｏｄｅｌ ｆｏｒ ＤＯＴ１Ｌ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ Ｗａｓ ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｄｉｓｒｕｐｔｏｒ ｏｆ ｔｅｌｏｍｅｒｉｃ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ １－ｌｉｋｅ（ＤＯＴ１Ｌ）；ｈｉｓｔｏｎｅ ｌｙｓｉｎｅ ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓ－ 收稿日期：２０１６—０３—２１ 基金项目：国家科技部重大专项资助项目（２０１４ｚｘ０９５Ｏ７＿Ｏ０２—００４） 通信作者：周宇波（１９７６～），男，研究员，研究方向为抗肿瘤分子靶向药物．Ｅ—ｍａｉｌ：ｙｂｚｈｏｕ＠￣ｓｉｍｍ．ａｃ．ｃａ 第１期 徐威，等：组蛋白赖氨酸甲基转移酶ＤＯＴＩＬ抑制剂分子水平高通量筛选模型的建立 １２７ ｆｅｒａｓｅ；ｓｍａｌｌ ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ；ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｏｕｔ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ（ＨＴＳ） 组蛋白的共价修饰主要发生在赖氨酸（Ｋ）和精氨酸（Ｒ）残基上，包括甲基化、乙酰化、磷酸 化、泛素化等，是一种重要的表观遗传调控作用机制．赖氨酸的甲基化和去甲基化在组蛋白修 饰中尤为常见，主要由组蛋白去甲基化酶（ｈｉｓｔｏｎｅ ｄｅｍｅｍｅｔｈｙｌａｓｅ，ＨＤＭ）和组蛋白甲基转移 酶（ｈｉｓｔｏｎｅ ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒｕｓｅ，ＨＭＴ）共同调节细胞内组蛋白的甲基化水平【１】．大量研究表明： 组蛋白的共价修饰作用参与众多基因的表达调控，促进细胞生长发育，调节机体新陈代谢，参 与相关疾病肿瘤的发生和发展过程，在表型和基因型之间承载着重要的桥梁作用【２】． 类端粒沉默干扰体１（ｄｉｓｒｕｐｔｏｒ ｏｆ ｔｅｌｏｍｅｒｉｃ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ １－１ｉｋｅ，ＤＯＴ１Ｌ）是一种作用在组蛋白 Ｈ３第７９位赖氨酸（Ｈ３Ｋ７９）Ｊ：的甲基转移酶，是目前所知在酵母菌和哺乳动物体内唯一作用于 该位点的甲基转移酶【３．ＤＯＴ１Ｌ不含大部分甲基转移酶所共有的在进化上极端保守的ＳＥＴ ３Ｊ结构域．除了调控某些基因的转录激活程序以外，ＤＯＴＩＬ还参与ＤＮＡ的修复、细胞的生长分 化以及细胞周期的调控等［４】＿在体内条件下，ＤＯＴＩＬ的敲除将导致小鼠胚胎致死．ＤＯＴＩＬ在 小鼠胚胎干细胞的生长发育过程、心脑血管的发生和发展过程以及胚胎软骨组织的形成中都 发挥着重要作用【５Ｊ＿大量研究结果表明：由ＤＯＴ１Ｌ催化调控的Ｈ３Ｋ７９位点单，双甲基化程度 的异常与重组型混合系白血病（ｍｉｘｅｄ ｌｉｎｅａｇｅ ｌｅｕｋｅｍｉａ，ＭＬＬ）的发生与发展密切相关［６】．在重 组型ＭＬＬ细胞中，染色质的异常转位导致ＭＬＬ基因与其融合伴￣（ＡＦ４，ＡＦ９或ＡＦ１０）发生 融合，使ＤＯＴ１Ｌ异常聚集，促进了Ｈ３Ｋ７９位点的高度甲基化，导致诸如Ｈ０ＸＡ９和ＭＥＩＳ１的 癌基因过量表达，促进了细胞的恶性增殖Ｉ ７。．重组型ＭＬＬ可以发展成急性髓性白血病（ａｃｕｔｅ ｍｙｅｌｏｃｙｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ，ＡＭＬ）或者急性淋巴细胞白血病（ａｃｕｔｅ ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ，ＡＬＬ）， 这表明Ｄ０ＴＩＬ是潜在的白血病治疗靶点【８．基于计算机水平的辅助测试新技术的出现和发 ８Ｊ展，极大地提高了靶点药物筛选的时效性和可靠性【９１． 目前在研的ＤＯＴ１Ｌ抑制剂有３种：①２０１１年Ｅｐｉｚｙｍｅ公司推出了第一种ＤＯＴ１Ｌ抑制 剂ＥＰＺ００４７７７，它是底物ｓＡＭ的竞争性抑制剂，分子水平ＩＣ５０约为０．４ ｎｍｏｌ／Ｌ，选择性较好， 能显著抑制重组型ＭＬＬ细胞系和ＭＬＬ—ＡＦ４，ＭＬＬ—ＡＦ９型小鼠造血细胞的增殖【１０】；②２０１３ 年Ｅｐｉｚｙｍｅ公司推出了第二种ＤＯＴ１Ｌ抑制剂ＥＰＺ一５６７６，其对ＤＯＴＩＬ靶点有着更为强烈的 抑制效果、分子水平ＩＣ５０为８０ ｐｍｏｌ／Ｌ，选择性较好，在抑制ＭＬＬ—ＡＦ４重组型细胞ＭＶ＿４—１１ 的ＩＣ５０为３．５ ｎｍｏｌ／Ｌ，对Ｈ３Ｋ７９位点双甲基化程度抑制的ＩＣ５０为３ ｎｍｏｌ／Ｌ，目前处于临床 一期研究阶段【１１】；③２０１２年加拿大多伦多大学结构基因组学会推出了另一种ＤＯＴＩＬ小分子 抑制剂ＳＧＣ０９４６，分子水平ＩＣ５０为３００ ｐｍｏｌ／Ｌ，对Ｈ３Ｋ７９位点双甲基化程度抑制的ＩＣ５０为 ８．８ ｎｍｏｌ／Ｌ，选择性较好 对ＨＯＸＡ９和ＭＥＩＳ１基因的抑制效果更为显著【１２Ｊ． １材料与方法 １．１ 材 料 ＳＡＭ缓冲液：５ ｍｍｏｌ／Ｌ硫酸，１０％乙醇溶液．反应缓冲液：５０ ｍｍｏｌ／Ｌ三羟甲基氨基甲 烷盐酸，ｐＨ＝８．０，１５０ ｍｍｏｌ／Ｌ氯化钠，３ ｍｍｏｌ／Ｌ氯化镁，０．１％牛血清白蛋白．高盐缓冲液： ５０ ｍｍｏｌ／Ｌ三羟甲基氨基甲烷盐酸，ｐＨ－－７．４，１ ｍｍｏｌ／Ｌ氯化钠，０．１％Ｔｗｅｅｎ一２０，０．３％多聚赖 氨酸．检测缓冲液：２５ ｍｍｏｌ／Ｌ羟乙基哌嗪乙硫磺酸，ｐＨ＝７．４，０．０１％Ｔｗｅｅｎ－２０． １．２实验方法 本实验采用ＰＥ公司提供的ＡｌｐｈａＬＩＳＡ ＤＯＴ１Ｌ Ｈｉｓｔｏｎｅ Ｈ３ Ｌｙｓｉｎｅ—Ｎ—ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ试剂盒检测Ｈ３Ｋ７９位点甲基转移酶ＤＯＴＩＬ的活性，ＤＯＴＩＬ小分子抑制剂高通量筛 １２８ 上海戈 报（自然科学版） 第２４卷 选（ｈｉｇｈ ｔｈｒｏｕｇｈｏｕｔ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ＨＴＳ）模型反应原理如图１所示 表１实验试剂 Ｔａｂｌｅ １ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ ｒｅａｇｅｎｔｓ 试剂 公司 ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ 型号 ＡＬ１４７ ＡＬ１４８ ６７６０００２ Ａｎｔｉ—Ｈｉｓｔｏｎｅ Ｈ３（Ｃ—ｔｅｒ）ＡｌｐｈａＬＩＳＡ⑩Ａｃｃｅｐｔｏｒ Ｂｅａｄｓ Ａｎｔｉ—Ｄｉｍｅｔｈｙｌ－Ｈｉｓｔｏｎｅ Ｈ３ Ｌｙｓｉｎｅ ７９（Ｈ３Ｋ７９ｍｅ２）Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ａｌｐｈａ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｄｏｎｏｒ Ｂｅａｄｓ Ｐｕｒｉｉｆｅｄ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｓｏｍｅｓ（ＨｅＬａ Ｃｅｌｌｓ） ＤＯＴ１Ｌ（Ｈｕｍａｎ），Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｗｈｉｔｅ Ｏｐａｑｕｅ ＯｐｔｉＰｌａｔｅＴＭ＿３８４ ＴｏｐＳｅａ１ＴＭ—Ａ Ｆｉｌｍ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｂｉｏｌｏｇｙ ＨＭＴ··３５－－１３０ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｂｉｏｌｏｇｙ ＨＭＴ－１１－１０１ ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ ６００７２９０ ６０５０１９５ ｓ一（５＇－Ａｄｅｎｏｓｙ１）一Ｌ—Ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ Ｃｈｌｏｒｉｄｅ（ＳＡＭ） Ｐｏｌｙ－－Ｌ—－Ｌｙｓｉｎｅ ＥＰＺ一５６７６ Ｓｉｇｍａ Ｓｉｇｍａ Ａ７００７ Ｐ１３９９ Ｓｅｌｌｅｃｋ￥７０６２ 发射光 ６ｌ５ ｎｍ 激发光 ６８０ ｎｍ 链霉亲和素 供体 图１ Ｄ０Ｔ１Ｌ小分ｆ抑制剂高通量筛选模型反 原理 Ｆｉｇ．１ Ｒｅａｃｔｉｏｎ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ＤＯＴＩＬ ｓｍａｌｌ ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ＨＴＳ ｍｏｄｅｌ 由图１可以看出，组蛋白核小体Ｈ３Ｋ７９位点能够在组蛋白甲基转移酶ＤＯＴＩＬ的催化 作用下，由低甲基化程度向高甲基化程度转化．ＡｌｐｈａＬＩＳＡ能够检测核小体上甲基化修饰的 Ｈ３Ｋ７９位点的 甲基化（Ｈ３Ｋ７９ｍｅ２）程度．通过甲基化抗体将受体珠和供体珠连接在一起，当 发生甲基化时，给予６８０ ｎｍ波长的激发光，供体珠能够产生高能态的单线氧．高能态的单线 氧能够进一步激发受体珠发射出５２０￣６２０ ｎｎｌ波长的荧光，通过检测荧光强度来反映甲基化 的Ｈ３Ｋ７９ｍｅ２含量． ２ 结 果 ２．１ 最佳反应酶浓度和反应时间的确定 ＡｌｐｈａＬＩＳＡ活性检测足一一种基于终点法的测活方法，需要保证检测时ＤＯＴＩＬ甲基转移 酶的酶活始终保持在初速度反应水平，即在整个活性检测过程中ＤＯＴ１Ｌ的酶活始终保持在 线性范围内． 为了探索最佳反应酶浓度和反应时间 本工作设计了如下反应实验体系．在Ｗｈｉｔｅ Ｏｐａｑｕｅ ＯｐｔｉＰｌａｔｅＴＭ＿３８４孔板中依次加入１ Ｌ １０倍缓冲液，２ Ｌ终浓度依次为１００，２５，１２．５， 第１期 徐威，等：组蛋白赖氨酸甲基转移酶ＤＯＴ１Ｌ抑制剂分子水平高通量筛选模型的建立 １２９ ３．１２５，１．５６２ ５，０ ｎｍｏｌ／Ｌ的ＤＯＴＩＬ酶．２ Ｌ ２０￣ｔｍｏｌ／Ｌ的ｓ一腺苷甲硫氨酸（ｓ—ａｄｅｎｏｓｙｌ ｍｅ－ ｔｈｉｏｎｉｎｅ，ＳＡＭ）和０．１５０ ｎｇ／￣Ｌ寡聚核小体混合物，反应时长为１８０，１２０，６０，３０，０ ｍｉｎ．达到反 应时间后，用高盐溶液终止反应，１５ ｍｉｎ后加入受体珠和抗体的混合液，６０ ｍｉｎ后加入供体珠， ３０ ｍｉｎ后进行Ｅｖｉｓｉｏｎ检测．实验结果如图２所示． 【ｃ０＿【× 瘩 Ｉｓ《∞Ｈ１Ｂ暑一《 ＿【×图２反应体系中最佳ＤＯＴＩＬ酶浓度和最佳反应时间的检测 Ｆｉｇ．２ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｂｅｓｔ ｅｎｚｙｍｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｔｉｍｅ 由图２可以看出，随着酶浓度的升高和反应时间的延长，接收到的信号值逐渐增强．但是， 在高浓度ＤＯＴＩＬ酶的催化作用下，整条曲线并非呈线性正相关．综合考虑节约成本、反应体 系的稳定性和实验的可操作性，最终选定５ ｎｍｏｌ／Ｌ的ＤＯＴＩＬ酶浓度，反应时长１８０ ｍｉｎ． ２．２ 寡聚核小体最佳浓度的确定 寡聚核小体是ＤＯＴＩＬ高通量筛选体系建立实验中重要的底物之一，组蛋白甲基转移酶 ＤＯＴＩＬ能够将核小体组蛋白Ｈ３第７９位的赖氨酸甲基化，实验依赖于完整的核小体结构．为 探索最佳寡聚核小体反应浓度，选择终浓度为０．１５０，０．１２５，０．１００，０．０７５，０．０５０，０．０２５ ｎｇ／ｇＬ 的寡聚核小体，５ ｎｍｏｌ／Ｌ的ＤＯＴ１Ｌ酶浓度，２０￣ｌｍｏｌ／Ｌ的ＳＡＭ，反应时长１８０ ｍｉｎ，其他反 应条件不变．实验结果如图３所示． Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｃｏｓｏｍｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ／（ｎｇ· 一 ） 图３反应体系中底物核小体最佳浓度的检测 Ｆｉｇ．３ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｂｅｓｔ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｓｏｍｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ 由图３可以看出：在一定浓度范围内，接收到的信号值随寡聚核小体浓度的升高而增大． 实验本底维持在一个相对较低的水平，证明了实验的稳定性．综合考虑高通量筛选的需求和节 １３０ 上 天 振（自然科学版） 第２４卷 约成本的原则，最终选定寡聚核小体的终浓度为０．１５０ ｎｇ／ ． ２．３ 底物ＳＡＭ反应 值的测定和最佳浓度的确定 组蛋白去甲基转移酶ＤＯＴ１Ｌ在适宜条件下可催化Ｈ３Ｋ７９的甲基化水平升高反应，该反 应需要一个甲基的供体ＳＡＭ．在底物ＳＡＭ存在的条件下，ＤＯＴ１Ｌ将ＳＡＭ上的甲基转移到 Ｈ３Ｋ７９位的赖氨酸上，完成催化反应．为检测ＳＡＭ反应的 值，依次选择终浓度为０．１，Ｏ．３， ０．９，２．７，８．１，２４．３，７２．９和２１８．７ ９ｍｏｌ／Ｌ的ＳＡＭ，５ ｎｍｏｌ／Ｌ的ＤＯＴＩＬ酶浓度，０．１５０ ｎｇ／ｐＬ 寡聚核小体，反应时长１８０ ｍｉｎ，其他反应条件不变．实验结果如图４所示． ＳＡＭ／（￣ｍｏ１．Ｌ一 １ 图４反应体系中底物ＳＡＭ最佳浓度的检测 Ｆｉｇ．４ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｂｅｓｔ ＳＡＭ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ 由图４可以看出，在一定范围内，接收到的信号值随ＳＡＭ浓度的升高而增大，但达到一定 浓度后，底物ＳＡＭ的浓度不再成为体系中的限制因素，故信号值不再增大．最终检测ＳＡＭ在 反应体系中的 值为１３．４６ ｐ．ｍｏｌ／Ｌ，选定ＳＡＭ的终浓度为２０￣ｍｏｌ／Ｌ． ２．４ 多聚赖氨酸浓度的确定 多聚赖氨酸（ｐｏｌｙ—Ｌ—ｌｙｓｉｎｅ，ＰＬ）是一种由２０￣３０个赖氨酸残基聚合而成的多聚蛋白复合 体，具有优良的抑菌防腐和食品保鲜功能．赖氨酸是人体必需氨基酸之一，是一种极性带正电 荷的碱性氨基酸．大量赖氨酸通过肽键复合到一起，为反应体系提供了极强的极性环境，有利 于反应信号的稳定和放大．ＰＬ最佳浓度检测实验结果如图５所示． 利用ＡｌｐｈａＬＩＳＡ方法检测ＤＯＴＩＬ的酶活，需要保证实验组和对照组的差异足够大，形成 的窗口足够宽，为进一步进行小分子抑制剂的筛选打下基础．由图５可以看出，ＰＬ的存在极大 地提高了反应的窗口值，在最高为０．３００ ００％的ＰＬ浓度条件下，实验组信号值可以达到空白 组信号值的１３．２倍，并且随着ＰＬ浓度的降低而减小．根据实验结果，最终确定０．０３０ Ｏ０％的 ＰＬ浓度为最佳反应浓度． ２．５ 阳性抑制剂ＥＰＺ．５６７６ ｇｐ￣ＪＪ效果的确定 通过前期实验已经基本确定了反应体系中各成分的最佳浓度与最佳反应时间，１０倍缓 冲液，终浓度为５ ｎｍｏｌ／Ｌ的ＤＯＴ１Ｌ酶，２０￣ｍｏｌ／Ｌ的ＳＡＭ，０．１５０ ｎｇ／ｐ．Ｌ的寡聚核小体， ０．０３０ ００％的ＰＬ高盐溶液，反应时间３ ｈ，体系的稳定性和可适用性需要进一步以阳性化合物 作验证．ＥＰＺ一５６７６是一种国际公认的选择性较好的ＤＯＴＩＬ二代抑制剂，是底物ＳＡＭ的竞 争型抑制剂，目前处于临床一期研究价段．以ＥＰＺ一５６７６为阳性化合物，检测其在分子水平的 ＩＣ５０值，结果如图６所示． 第１期 徐威，等：组蛋白赖氨酸甲基转移酶ＤＯＴ１Ｌ抑制剂分子水平高通量筛选模型的建立 １３１ － ●Ｐ ； ‘【ｆ０一×】 ｌ塌【ｓ《∞Ｈ 暑一《 ｝ｌ ｌ一 ｌ － － Ｉ ！ ＿ ■ ｒ ｌ ＰＬ ｅｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ／（ｇ·ｍＬ一 ） 图５反应体系中ＰＬ最佳浓度的检测 Ｆｉｇ．５ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｂｅｓｔ ＰＬ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ＬＯＧ（ＥＰＺ．５６７６）／（ｎｍｏｌ·Ｌ一 １ 图６阳性化合物ＥＰＺ一５６７６的ＩＣ５０检测 Ｆｉｇ．６ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＩＣ５０ ｏｆ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｏｍｐｏｕｎｄ ＥＰＺ一５６７６ 利用优化后的ＤＯＴＩＬ测活体系，检测不同浓度条件下ＥＰＺ一５６７６对ＤＯＴＩＬ甲基转移酶 的抑制作用（见图６）．结果显示，阳性抑制剂ＥＰＺ一５６７６对ＤＯＴＩＬ甲基转移酶的抑制ＩＣ５０为 ０．４８ ｎｍｏｌ／Ｌ，与文献［１１ｊ报道基本一致，说明已成功建立组蛋白甲基转移酶ＤＯＴ１Ｌ高通量 筛选模型． ２．６ 筛选系统的稳定性和可操作性 高通量筛选实验需要比较阳性对照组、未知样品组以及阴性对照组的检测结果，需要筛选 数以万计的未知样品，耗费大量金钱和实验材料．故在高通量筛选实验开始之前，需要进行一 些小样本容量的检测实验，以确定所建立的实验体系是否适用于后续的大规模筛选体系． 为了保证在机器加样条件下高通量筛选的稳定进行，本工作优化了加样过程，以确定是否 适合进行高通量筛选．并考察了高通量筛选体系中Ｂｒａｖｏ加样系统以及酶活性检测过程中可 能引起的系统变异程度．Ｚ 因子是关于信号区间和变异程度的组合，是衡量高通量筛选稳定 性与可靠性的重要指标，能综合反映信噪比和测量偏差的大小．一般认为，Ｚ ＞０．５的筛选体 系适合进行高通量筛选．依据Ｚ 因子计算公式，对所建立的ＤＯＴＩＬ抑制剂筛选体系的Ｚ 因 子进行检测，结果为０．５４（见图７），符合高通量筛选的质量控制要求，表明可以开展高通量筛选 实验． １３２ 上海天 振（自然科学版） 第２４卷 —ｆ０＿【×一／１对—＆Ｉｓ《∞Ｈ ＩＩｄＩ Ｎｕｍｂｅｒ 图７ Ｚ 因子的测定 Ｆｉｇ．７ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｚ ｆａｃｔｏｒ ３ 讨 论 分子水平药物筛选过程是新药开发与后续体内评价的关键步骤，是一个通过应用系统化 的实验手段从数以万计的候选化合物中筛选出对某一特定靶点具有较高抑制活性的化合物 的过程．这一过程要求实验方法灵敏度高、特异性强、稳定性好、自动化程度高，同时要尽可 能地降低成本．近年来随着能量共振转移技术的发展与成熟，多功能ＡｌｐｈａＬＩＳＡ法已逐渐成 为被广泛应用的药物筛选分析法．经过充分的标记特异性和交叉反应验证后的ＡｌｐｈａＬＩＳＡ 法，可广泛应用于表观遗传中特定的甲基化、乙酰基化修饰的快速检测．该方法稳定性好，特 异性强，反应过程无需洗涤［１３１．ＡｌｐｈａＬＩＳＡ ＤＯＴ１Ｌ Ｈｉｓｔｏｎｅ Ｈ３ Ｌｙｓｉｎｅ—Ｎ—Ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ方法将完整的寡聚核小体结构作为底物，通过生物素链接的特异性识别Ｈ３Ｋ７９位二甲 基化程度的抗体，识别特定的表观遗传标记，链霉亲和素供体另一端携带的供体珠在接收到特 定波长的激发光后将发射出高能态的单线氧．高能态单线氧被锚定在组蛋白Ｈ３Ｃ末端的受体 珠接收后，释放出另一特定波长的反射光，通过接收这一反射光的强度达到检测组蛋白Ｈ３第 ７９位赖氨酸二甲基化程度产物的目的．整个过程依赖于完整的空间核小体构象结构，但是也 有一定缺陷．首先，这种检测方式不能排除荧光化合物的干扰；其次，如果化合物的作用方式 并非在于抑制了酶的活性，而在于干扰了供体抗体与Ｈ３Ｋ７９二甲基化位点的结合，或者干扰 了受体抗体与Ｈ３的结合，都会导致假阳性的产生．在后续实验中应尽量避免这一结果带来的 影响． 以高通量筛选为基础的先导化合物发现技术是近年来迅速发展并被不断优化的药物筛选 分析新方法．高通量筛选以其快速、灵敏、规模大、成本低、稳定性好、操作简单、化合物用量 少等特点而普遍受到药物研发者的青睐．本工作结合组蛋白甲基转移酶ＤＯＴＩＬ小分子抑制 剂自身的研发特点，通过建立以能量共振转移技术为基础的高通量筛选模型，发掘具有新颖结 构的ＤＯＴ１Ｌ小分子抑制剂，增强对于ＤＯＴＩＬ靶点本身的认识，在理解和阐述新的相关机制 的同时，发现潜在的候选化合物．另一方面，通过与组蛋白甲基转移酶家族其他抑制剂筛选模 型进行比较分析，进一步评价化合物的选择性，筛选出抑制效果好、针对性强的ＤＯＴ１Ｌ抑制 剂，为后续临床实验打下坚实的基础． ４ 结束语 本实验通过建立以能量信号共振转移为基础的组蛋白甲基转移酶ＤＯＴＩＬ高通量筛选模 型，进一步优化反应体系，确定最终的最佳反应ＤＯＴ１Ｌ酶浓度为５ ｎｍｏｌ／Ｌ，最佳底物ＳＡＭ 第１期 徐威，等：组蛋白赖氨酸甲基转移酶ＤＯＴ１Ｌ抑制剂分子水平高通量筛选模型的建立 １３３ 浓度为２０ ｌｌｍｏｌ／Ｌ，最佳寡聚核小体浓度为０．１５０ ｎｇ／￣ｔＬ，ＰＬ浓度为０．０３０ ００％，最佳反应时 长为３ ｈ．利用优化体系对ＤＯＴ１Ｌ阳性抑制剂ＥＰＺ一５６７６进行ＩＣ５０检测，得到ＩＣ５０值为 ０．４８ ｎｍｏｌ／Ｌ，与已有文献报道相一致，说明ＥＰＺ一５６７６可以作为ＤＯＴＩＬ小分子抑制剂高通量 筛选模型的阳性化合物．为了确保机器自动加样的稳定性和准确性，本工作对所建立的筛选模 型的ｚ 因子进行检测，结果为Ｏ．５４，达到了高通量筛选模型的建立标准，表明已成功建立组蛋 白甲基转移酶Ｄ０Ｔ１Ｌ小分子抑制剂高通量筛选模型． 参考文献： 【１】ＢＡＮＮＩＳＴＥＲ Ａ Ｊ，ＫＯＵＺＡＲＩＤＥＳ Ｔ．Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｈｒｏｍａｔｉｎ ｂｙ ｈｉｓｔｏｎｅ ｍｏｄｉｉｆｃａｔｉｏｎｓ［Ｊ】．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０１１，２１（３）：３８１—３９５． 【２】ＰＯＲＴＥＬＡ Ａ，ＥＳＴＥＬＬＥＲ Ｍ．Ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ ｍｏｄｉｉｆｃａｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｈｕｍａｎ ｄｉｓｅａｓｅ［Ｊ］．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ，２０１０， ２８（１０）：１０５７－１０６８． 【３ ＷＯＮＧ Ｍ，ＰＯＬＬＹ Ｐ，ＬＩ３】Ｕ Ｔ．Ｔｈｅ ｈｉｓｔｏｎｅ ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ＤＯＴ１Ｌ：ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ａｎｄ ａ ｃａｎｃｅｒ ｔｈｅｒａｐｙ ｔａｒｇｅｔ【Ｊ】．Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０１５，５（９）：２８２３－２８３７． ［４ ＭＩ４】Ｎ Ｊ，ＦＥＮＧ Ｑ，ＬＩ Ｚ，ｅｔ ａ１．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ｃａｔａｌｙｔｉｃ ｄｏｍａｉｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ＤＯＴ１Ｌ，ａ ｎｏｎ－ＳＥＴ ｄｏｍａｉｎ ｎｕｃｌｅｏｓｏｍａｌ ｈｉｓｔｏｎｅ ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒｓｅ［ａＪ】．Ｃｅｌｌ，２００３，ｌ１２（５）：７１ １—７２３． 【５ ＷＥＮ Ｌ，Ｆｕ Ｌ，Ｇｕｏ Ｘ，ｅｔ５】 ａ１．Ｈｉｓｔｏｎｅ ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ＤＯＴＩＬ ｐｌａｙｓ ａ ｒｏｌｅ ｉｎ ｐｏｓｔｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｉｎ Ｘｅｎｏｐｕｓ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ［Ｊ】．ＦＡＳＥＢ Ｊｏｕｒｎａｌ：Ｏｆｉｆｃｉａｌ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｉｅｓ ｆｏｒ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２０１５，２９（２）：３８５－３９３． ［６ ＳＴＥＩ６】Ｎ Ｅ Ｍ，ＴＡＬＬＭＡＮ Ｍ Ｓ．Ｍｉｘｅｄ ｌｉｎｅａｇｅ ｒｅａｒｒａｎｇｅｄ ｌｅｕｋｅｍｉａ：ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ ａｎｄ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ＤＯＴＩＬ［Ｊ】．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ，２０１５，２２（２）：９２—９６． 【７ ＬＩ７】Ｕ Ｗ，ＤＥＮＧ Ｌ，ＳＯＮＧ Ｙ，ｅｔ ａ１．ＤＯＴＩＬ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｓｅｎｓｉｔｉｚｅｓ ＭＬＬ—ｒｅａｒｒｎｇｅｄ ＡＭＬ ｔａｏ ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ【Ｊ】．ＰＬｏＳ ＯＮＥ，２０１４，９（５）：ｅ９８２７０． 【８】ＣＨＥＮ Ｃ Ｗ，ＡＲＭＳＴＲＯＮＧ Ｓ Ａ．Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ＤＯＴＩＬ ａｎｄ ＨＯＸ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ＭＬＬ—ｒｅａｒｒａｎｇｅｄ ｌｅｕｋｅｍｉａ ａｎｄ ｂｅｙｏｎｄ［Ｊ】．Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｌａ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ，２０１５，４３（８）：６７３－６８４． ［９］朱晓华，冯玉田，章玉鉴．基于组件技术的虚拟仪器开发方法的研究［Ｊ】＿上海大学学报（自然科学 版），１９９９，５（４）：３５７－３６１． ［１０】ＤＡＩＧＬＥ Ｓ Ｒ，ＯＬＨＡＶＡ Ｅ Ｊ，ＴＨＥＲＫＥＬＳＥＮ Ｃ Ａ，ｅｔ ａ１．Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｋｉｌｌｉｎｇ ｏｆ ｍｉｘｅｄ ｌｉｎｅａｇｅ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ａ ｐｏｔｅｎｔ ｓｍａｌｌ－ｍｏｌｅｃｕｌｅ ＤＯＴＩＬ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ［Ｊ］．Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ，２０１ １，２０（１）：５３－６５． 【１１］ＤＡＩＧＬＥ Ｓ Ｒ，ＯＬＨＡＶＡ Ｅ Ｊ，ＴＨＥＲＫＥＬＳＥＮ Ｃ Ａ，ｅｔ ａ１．Ｐｏｔｅｎｔ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ＤＯＴ１Ｌ ａｓ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ＭＬＬ—ｆｕｓｉｏｎ ｌｅｕｋｅｍｉａ［Ｊ］＿Ｂｌｏｏｄ，２０１３，１２２（６）：１０１７－１０２５． 【１２１ Ｙｕ Ｗ，ＣＨＯＲＹ Ｅ Ｊ，ＷＥＲＮＩＭＯＮＴ Ａ Ｋ，ｅｔ ａ１．Ｃａｔａｌｙｔｉｃ ｓｉｔｅ ｒｅｍｏｄｅｌｌｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ＤＯＴＩＬ ｍｅｔｈｙｌ－ ｔｒａｎｓｆｅｒｓｅ ｂｙ ａｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ［Ｊ１．Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，２０１２，３：１２８８． ｆ１３１ ＰＥＴＥＲＳ Ｃ Ｄ，ＪＥＳＰＥＲＳＥＮ Ｂ，ＮＯＲＲＥＧＡＡＲＤ Ｒ．ＡｌｐｈａＬＩＳＡ ｖｅｒｓｕｓ ＥＬＩＳＡ．ｂａｓｅｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ １８ ｉｎ ｈｅａｌｔｈｙ ｓｕｂｊｅｃｔｓ ａｎｄ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｅｎｄ—ｓｔａｇｅ ｒｅｎａｌ ｄｉｓｅａｓｅ［Ｊ】＿Ｓｃａｎｄｉｎａｖｉａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ，２０１２，７２（８）：５８３－５９２． 本文彩色版可登陆本刊网站查询：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｊｏｕｒｎａ１．ｓｈｕ。ｅｄｕ．ｃｎ