血 凝
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项 目 标 准 操 作 规 程
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1． 一般注意事项
样品收集 ● 静脉抽血；
● 穿刺要一针见血，避免淤血，气泡，溶血和组织液污染；
● 若是利用真空收集管，以第二或第三管样品为佳； 若是从导管取样，则需用生理盐水冲洗管道，前面5ml血不能利用；
● 采血后当即与抗凝剂充分混合，尽快送往实验室； ● 采血量必需准确，若是少于计划量的90%，则不能利用； ● 不能在静脉穿刺部位或周围部位采样。 样品处置
● 利用%或%(W/V)枸橼酸钠溶液作为抗凝剂；
● 血样与抗凝剂的比例为9：1，若是血球压积﹤20%或﹥55%，则需调整这个比例，
方式是：血液毫升数X(100-压积)=抗凝剂毫升数； ● 血浆分离（若是不能当即测试，应尽快分离血浆）； ——采样后60分钟内进行； ——离心速度为1000g/10分钟
● 盛血浆容器应加塞，避免PH改变； ● 血浆应保留在2-8℃； ● 血浆寄存时间不能太久； 温度 2
有效时间 -
室温 2-8℃ ≤2 hr ≤4hr -20℃ -70℃
≤2weeks ≤6months ● 低温保留的样品，要在37℃迅速解冻，减低凝血因子的消耗，并当即测试。
● 与样品接触的所有器材（注射剂，样品管，检测杯等）必需采用塑料袋或硅化玻璃材质。
● 全数器材均不得含去污剂或清洗液。 影响测定结果的几种因素
● 抗凝剂：草酸钠、EDTA、肝素不适于作抗凝剂； ● 黄疸，脂血，重度溶血和冰冻血浆影响测定结果不准； ● 利用纤溶药物，如双香豆素，链激酶，尿酶等可使凝固时间延长；
● 超过医治试剂量的肝素使凝固时间延长； ● FDP增加使凝固时间延长；
● 某些药物，如口服避孕药，雌激素，天门冬酰胺酶，钠络酮等影响测试结果；
● 样本收集和处置不妥，都会使凝固时间缩短或延长； ● 怀胎和急性炎症会影响某些测试结果。 干粉试剂及血浆溶解 ● 保证干粉完全溶解； 3
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● 溶解时，轻轻转动容器，避免猛烈震荡；
● 确认溶剂种类，一般溶解液包括：蒸馏水/生理盐水/缓冲液/厂家特定溶解液，按说明书选择；
复溶后，室温放置5-10分钟后方可利用
二．具体项目操作注意事项
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凝血酶原时间
I. 概述
凝血酶原时间(Prothrombin Time)测定用来作为外科手术前对某一凝血因子的评价，和用于监视抗凝医治，当进行凝血酶原时间测试时，对于正常结果需有二、3级所有因子。因此，该实验对因子I、II、V、VII和X的量减少或不足是很灵敏的。
除因子IX，凝血酶原时间测试对于其它所有因子缺乏是灵敏的，它已被证明在监视抗凝医治是有效手腕。
凝血酶原时间测定也用于因子II、V、VII和X的定量分析(因子分析)。 II. 试剂
干粉试剂需复溶，液体试剂直接利用，利用前轻轻混合，可利用一些备件如搅拌。利用期间维持适当的悬浮液状态。如质控结果在范围之外，或试剂颜色发生转变，可能表明产品变质。但是，差的性能、结果也可能是由于其他因素包括实验系统引发的。
警告：PT-DS试剂含有叠氮钠，勿服、勿接触皮肤和黏膜。 III. 样本搜集
%(0.109M)枸橼钠做为抗凝剂。避免溶血和其他组织液的污染。样本体积不得少于所需体积的90%。在3000×g下离心10分钟，如样本在22—24℃下，须在2小时内测定。有关样本搜集和贮存的详细资料，请参见NCCLS文件。
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IV. 步骤 提供材料PT试剂 另需材料： ① 纯化水 ② 适合的计时器 ③ 精密移液管：和
④ 正常和异样质控物，（凝血质控血浆三个水平) PT适合于手工、仪器、光度计和其它凝固的测定方式。 手工方式
A：在37℃预热PT试剂；
B：加血浆到比色杯中，在37℃下预热；
C: 使劲加预热的PT试剂到血浆中凝结形成，并记录时间建议至少利用一正常和一异常对照血浆，每40份病人样品至少一次轮换，逐日测定对照血浆，建议每一个实验室应做好室内质控范围。
V. 结果
用最近的秒报告每一个血浆的凝固时间，所得PT时间结果与正常参考范围值一路列入报告。(勿报告相对于商业质控血浆凝结时间的病人比值。质控仅仅是为了保证明验系统的准确性。)
VI. 局限性
血凝生物化学包括一系列受许多预实验条件影响的反映。这些变异性必需被控制，以取得好的结果：
样本搜集
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勿延迟血液与抗凝剂的混合； 避免样本产生泡沫； 用塑料或硅硼酸盐玻璃容器；
混浊、溶血、脂血或黄疸的样本，可能会引发错误结果； 冷冻和解冻包括残留细胞血浆，会裂解细胞膜而影响结果； 急性炎症反映由于纤维蛋白原的升高，会缩短PT结果； 红细胞压积在20—55%范围之外，所加抗凝剂需调整比例。 技术：
若是血浆暴露到空气中pH将升高；
PT工作要求37℃±0.5℃。常常检查加热部份的温度。在4—8℃维持的血浆可能会引发冷激活而致使PT缩短；
所有的实验器皿必需清洁，没有脏物痕迹； 依照仪器供给商的要求，保养仪器。 影响物质：
草酸钠，EDTA和肝素不适合做抗凝剂；
口服避孕药物、天门冬氨酰胺酶、皮质酮、EDTA、红霉素、酒精、四环素和抗凝剂如肝素和华法令可能引发PT延长。
抗组织胺药、布塔巴比妥、咖啡因、口服避孕药、苯巴比妥、维生素K.可能引发PT缩短。
VII. 期望值
PT对正常人评估可取得以下结果 平均 仪器
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±2SD范围
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可见光度计 —
这些值仅作为一个指导，每一个实验室应成立自己的正常参考范围。试剂、仪器操作、血样搜集技术或抗凝剂的改变，都应从头成立新的正常参考范围。
有关性能特征、因子分析精密度等详见英文说明书。
测定试剂
I. 概述
APTT(Activated partial Thromboplastin time)测试普遍应用已有数年，用作外科手术对某些凝结因子的评价，和监视肝素医治。当测定APTT时，所有内途径因子对于正常结果是必需的。但是它主腹地用于检测2级因子的不足，即因子VIII、IX、XI和XII，和Fletcher因子(4)。
APTT测试也用于监视肝素医治，测定结果显示延长单位以上(5)。 此实验也用在因子VIII、IX、XII和Fletcher因子的定量测度(因子分析)。
II. 摘要与原理
APTT的延长直接与肝素量的增加成正比。APTT时间测定就是加入APTT试剂混合物在此37℃孵育3分钟“激活”，再加CACl2计数凝块形成时间。
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III. 试剂
试剂在2—8℃保留，勿冷冻，开瓶后在2—8℃可稳定30天。长时间贮存后，可能会出现黄色沉淀。在利用前轻轻混合。不稳定值、超出质控范围之外的值或产品颜色转变，可能表明试剂变质。但是其它因素包括实验系统也可能引发这些误差。
IV. 样本搜集
%(0.105M)或%(0.109M)柠檬酸作抗凝剂，避免溶血和其它组织液体污染。样本体积不得少于所需体积的90%。在3000×g离心10分钟，如样本放在22—24℃下，需在2小时内测定。有关样本搜集和贮存的详细资料，请参见NCCLS文件。
V. 步骤
提供材料： APTT试剂。 另需材料：
① 美创公司提供的CaCl2(0.025M)，高纯度、高质量； ② 适当的计时器(秒表和时间表)； ③ 精密移液管：；
④ 正常和异样质控，(凝血质控血浆，1、2、3、三个水平)APTT是适用于手工、仪器、光度计和其它凝结测定的方式。
手工方式：
A：在37℃预热CACL2(0.025M)；
B：加测定血浆到比色杯中，在37℃预热； C：加预温过的APTT试剂入测定血浆中，混合；
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D：在37℃下孵育血浆试剂混合物3分钟。(激活时间)，为了实验的一致性，用一样的激活时间，测定所有血浆；
E：使劲加预热的CACL2，凝结形成，注意凝块形成时间。用正常、异样质控血浆(如美创公司的质控三个水平1、2、3)与病人血浆结合起来测定。建议至少用一个正常和一个不正常血浆，至少每测20份病人样本轮换一次。
VI. 结果
用最近的秒报告每一个血浆的凝结时间，所得APTT时间结果与正常参考范围值一路列入报告。(勿报告相对于商业质控血浆凝结时间的病人的值。质控仅仅是为了保证明验系统的准确性。)
VII. 局限性
血凝生物化学包括一系列受许多预实验条件影响的反映。这些变异性必需被控制，以取得好的结果。
样本搜集：
勿延迟血液与抗凝剂的混合； 避免样本产生泡沫； 用塑料或硅硼酸盐玻璃容器；
混浊的溶血、脂血或黄疸的样本，可能引发错误结果； 反复冷冻和解冻血浆，会损伤细胞膜，会影响结果； 血胞压积在22—25%范围之外，所加抗凝剂需调整比例； 技术：
若是血浆暴露到空气中pH值将升高；
APTT工作要求37℃±0.5℃，常常检查所有加热部份的温度；
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所有的实验器皿必需被清洁，没有赃物痕迹； 依照仪器供给商的要求，保养仪器。 影响物质：
草酸钠，EDTA和肝素不适合作抗凝剂；
口服避孕药物，雌激素，怀孕，氧杂萘邻酮类的药物，肝素，天门冬氨酰胺酶和naloxone已有报导报告会影响APTT结果。
VIII. 期望值
APTT-LS正常人可取得下面结果： 平均 仪器
±2SD范围
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可见光度计
这些值仅作为一个指导，每一个实验室应成立自己的正常参考范围。试剂、仪器操作、血样搜集技术或抗凝剂的改变，都应从头成立新的正常参考范围。
3 .纤维蛋白原
采用clauss法，即在待检稀释血浆中加入高浓度的凝血酶，血浆凝固
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时间与血浆纤维蛋白原浓度成反比。
二、试剂及材料准备
1. 冻干牛凝血酶(100NIH Unit/ml)干粉或液体 2. 纤维蛋白原参比血浆 瓶，3瓶/盒
该制剂系人枸橼酸钠抗凝血浆，加入稳定剂缓和冲液后冻干而成。利用前用蒸馏水溶解，轻轻摇动至完全溶解。2—8℃寄存可以稳定一周，也可-20℃冻存，避免反复冻溶。
3. 咪唑缓冲盐水± 135ml/瓶，1瓶/盒
该缓冲液以叠氮钠为防腐剂，叠氮钠如遇酸将产生有毒化合物，因此，含有该剂的容器、试管及抛弃的试剂均应用大量流水冲洗。另外，亦应避免该试剂在金属管道内沉积。
4. 塑料试管(自备)
5. 移液器100μl、200μl(自备) 6. 正常及异样质控血浆(自备) 7. 双对数坐标纸 三、方式
(一) 标准曲线的制备
1. 稀释的纤维蛋白原参比血浆的制备
将已知浓度的纤维蛋白原参比保留浆用咪唑缓冲盐水稀释成1∶五、1∶10、1∶1五、1∶20、1∶40，5个浓度。
2. 每稀释度各取、37℃预热5分钟，然后加入室温的凝血酶，记录各
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稀释度的血浆凝固时间。每稀释度重复2—3次测定，取平均值。
3. 以各稀释度纤维蛋白原的浓度为纵坐标，对应的血浆凝固时间的平均值为横坐标，在双对数坐标纸上绘制标准曲线，每条标准曲线至少应包括所做的5个稀释度中的持续3个以上的点。不然结果不予接受，应从头绘制。
(二) 标本的测定
1. 标本收集：%或%的枸橼酸钠1∶9抗凝全血，以RCF3000×g离心10分钟，分离血浆待检。在室温条件下，标本寄存不该超过2小时，2小时不能完成检测，应冻存。
2. 测定步骤
① 待检标本用咪唑盐水1∶10稀释。
② 取1∶10稀释的血浆、37℃预热5分钟，然后加入已预热的凝血酶试剂，记录血浆凝固时间。
③ 按照血浆凝固时间在标准曲线上查得标本的纤维蛋白原浓度。 ④ 若血浆凝固时间超出标准曲线的范围，若太长将标本作1∶5稀释,太短改作1∶20稀释，从头测定凝固时间，如标本作1∶5稀释，将从曲线上查得结果除2，如标本作1∶20稀释，将从曲线上查得结果乘2，取得最终结果。
四、参考范围2.0g～4.0g/l(200～400mg/dl) 五、注意事项
1. 分离的血浆中不该含有细胞成份；
2. 纤维蛋白原含量低于1.5g/l，而血浆FDP含量明显增高时，可致标本的测定结果较实际结果低；
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4. TT测定
一、样本搜集
A. 抗凝细胞压积剂：%枸橼酸钠血样与枸橼酸盐的比例为9∶1。但是，对于个别病人血细胞压积低于20%或高于55%，须调整这个比例以保证取得结果。下面公式用来计算调整抗凝剂的量。
×血液 (ml) × (100-血细胞压积) = 抗凝剂(ml)
B. 样本搜集：血样可用针刺或其它方式取得。针刺是非损伤性的，避免溶血或其它组织液的污染。
C. 样本处置：血液搜集后当即用抗凝剂轻轻混合，用RCF3000×g离心10分钟，过量血小板污染的血浆可能会引发一些因子水平假性升高，包括纤维蛋白原(因子1)，分离血浆勿使红细胞混入，或当即做实验。盖好样品以避免样品pH值转变而影响实验结果。样本在22—24℃下, 可稳定2小时，在-20℃下稳定2周，在-70℃下稳定6个月，样本在37℃下快速解冻并当即测定。
二、试剂
TT试剂在2—8℃下保留。 三、凝血酶凝结时间步骤
37℃孵育未稀释的血浆3分钟，加 TT试剂，测定凝结形成时间。 四、解释
像其它实验一样，正常范围按如实验室，和所利用的仪器的不同，会有所不同。但是，当利用TT试剂如上面步骤三所提到的实验时，正常的
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个人将凝血酶原时间一般地约为10-18秒。
五、参考文献(略)
肝素可致本方式测定结果减低。
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