维普资讯 http://www.cqvip.com 重庆医学２００７年１１月第３６卷第２２期 ２３３１ ・经验交流・ 免疫组织化学染色技术的应用体会 宋 容 （重庆市肿瘤研究所病理科４０００３０） 摘 要：目的 探讨免疫组织化学染色技术的应用。方法 免疫组织化学染色技术是一种多步骤、多因素决定的实验方法， 有很多干扰因素，无论是组织取材、固定、制片、抗原暴露及修复、液体及抗体的配制、修复温度、显色等等因素都会影响免疫组织 化学染色。结果 提高免疫组织化学染色技术，是为了制作出优良的免疫组织化学切片，提高病理诊断水平。结论 免疫组织化 学染色技术特异性强、灵敏度高、定位准确等优点应得到最为广泛的推广和应用。 关键词：免疫组织化学染色；技术与方法 中图分类号：Ｒ３６１．２ 文献标识码：Ｂ 文章编号：１６７１－８３４８（２００７）２２—２３３１－０２ 免疫组织化学（ＩＨＣ）染色技术作为病理实验室的常规工 断，还容易在染色过程中发生脱片。常规制片过程中要特别注 作以及科研工作的常规技术，是在组织化学的方法上结合免疫 学的理论和技术发展起来的一门新技术，也是近年发展很快的 一意组织切片薄、完整、无刀痕，烤片的温度和时间要适度，烤片 温度对组织内抗原有不同程度影响，烤片时温度过高，可造成 组织内抗原的破坏。温度低，时间不足，染色时易发生脱片。 门学科，以其特异性强、灵敏度高、定位准确，并可直接定性 和定量的形态学观察等优点得到了最为广泛的推广和应用。 它不仅提高了病理诊断的准确性，也渗透到了基础和临床学 科，在疾病的诊断、判断预后、指导临床治疗、了解发病机制和 检测病原体等方面起到了不可估量的作用。但是免疫组化染 色技术是一种多步骤、多因素决定的实验方法，存在很多干扰 因素ｌ１ｌ，甚至会出现不理想的染色结果，从而易造成判断的错 误。为了制作出优良的免疫组织化学切片，提高病理诊断水 所以在制片时，将蜡膜熔化后放人６Ｏ℃的烤箱内烤片过夜。 这样不仅可避免抗原破坏，而且还可防止染色过程中脱片现 象。 ４抗原暴露及修复 免疫组化染色的成败与组织切片中抗原物质的暴露和抗 原性的恢复方法有着十分密切的关系。目前在免疫组化实验 中，抗原修复是影响染色结果的最关键因素。大多数采用酶消 化法或加热抗原修复两种方法。酶消化法是最早的抗原修复 方法，消化酶的作用在于能够暴露因组织固定而导致的抗原决 定簇的封闭，以增加染色效果。此法应特别注意｝肖化酶最佳浓 度（０．０３ ）、染色时间（１０ｍｉｎ）。使用阻断液时严格掌握适当 的浓度、时间。消化酶浓度高（＞０．０３ ），时间长（超过 １０ｍｉｎ），会破坏组织抗原性，同时增加背景染色，给诊断增加难 度；单纯加热抗原修复方法操作简单、经济，但对于封闭牢固的 抗原决定簇暴露得不够理想；高压加热抗原修复方法比较简 单，消耗时间短，价格便宜、经济实用，但是也发现高压加热的 温度和时间掌握不当，会发生非特异性抗原暴露，增加背景染 色。微波加热抗原修复方法目前应用也比较广泛，微波方法使 平，作者回顾了近年来所进行免疫组织化学染色，现将体会介 绍如下。 １组织损伤 组织的损伤包括机械损伤、组织变干。组织的机械损伤可 发生在多个环节，如手术钳取活检造成的挤压、制片过程造成 切片的划痕等。病理技术人员在整个制片过程中应细心操作， 避免损伤组织；组织变干是由于组织固定不及时或组织没有完 全浸泡在固定液中，致使组织变干。另外，在免疫组化染色过 程中，由于试剂没有完全覆盖组织也是组织变干的原因。组织 变干后蛋白变性，抗原性丧失，表现为不着色或一片棕色。因 此，在整个组织处理制片的过程中应避免组织变干。 ２ 固 定 抗原决定簇充分暴露，并使组织的通透性提高，反应加快，使变 性的抗原得到修复而取得良好的染色效果。这就是微波能促 进免疫组化反应的原理ｌ３］。在实际工作中，作者发现微波处理 时间不同，对免疫组化反应有影响，为此，作者采用将切片插人 ２４片塑料架上放在２５０ｍｌ塑料盒中，另加人０．０ｌｍｏｌ／Ｌ柠檬 免疫组化染色技术要求组织离体后立即固定，理想的组织 固定是制作良好染色切片的先决条件ｌ２］。如果固定不及时，会 造成组织变干和自溶，造成抗原损失。因此，组织固定应该越 快越好，对大标本和有包膜的标本应切开固定。作者常用 １Ｏ 福尔马林作为病理标本常规固定剂，固定剂应用要掌握浓 度和固定时间。适合的浓度对酶的活性没有明显影响，相反会 酸盐缓冲液２００ｍｌ，ｐＨ值６．０，微波炉中加热至微沸（９８～ １００℃），微波调到中挡，９２℃，１０ｍｉｎ，然后将微波炉调至低档， 使组织的抗原性降低或消失，影响抗原的表达，出现阴性结果。 另外，要掌握适当的固定时间，固定时间短会使组织固定不充 分，抗原没有得到充分保护；时间长会形成更多抗原交联，影响 ９２℃，１０ｍｉｎ，取出后静置室温冷却。因此，延长微波的修复作 用，可以增加组织阳性表达，提高免疫组化诊断的准确性。 注意事项：微波抗原修复方法不能使组织切片干燥；加热 必须达到规定的温度Ｉ力Ⅱ热后应放置足够的时间使之冷却，否 则会严重影响免疫组化染色结果。 ５液体及抗体的配制 抗原和抗体的结合。小标本固定时间为４～６ｈ，大标本为１２～ １６ｈ。 ３制 片 切片也是免疫组化染色的重要环节，要求切片薄而完整， 一０．０１ｍｏｌ／Ｌ磷酸盐缓冲液（ＰＢＳ）ｐＨ值７．４及０．０１ｍｏｌ／Ｉ 柠檬酸盐缓冲液，ｐＨ值６．０配制，必须严格按照要求配制，否 般厚度为３～４ ｍ，切片太厚会影响免疫组化染色结果和判 维普资讯 http://www.cqvip.com ２３３２ 重庆医学２００７年１１月第３６卷第２２期 则也会影响到染色结果。抗体的稀释，关键是必须使用高质量 ７显 色 的抗体稀释液稀释一抗，或者使用商品化的工作液。因二者均 ＤＡＢ显色剂一定要新鲜配制，使用前要过滤，否则未溶的 含有抗体保护剂和稳定剂，最好不要使用普通ＰＢＳ缓冲液稀 ＤＡＢ颗粒会沉积在切片上，影响结果的观察；ＤＡＢ的浓度不 释抗体。稀释的抗体不能长时间保存，４℃冰箱可存放１～３ｄ， 宜太高，否则会增加背景染色。Ｈ ０ 浓度也不宜太高，否则 否则效价会明显降低。近年国内外一些公司开发出即用型抗 会加速反应，也可能增加背景染色。免疫组化染色后，常用苏 体，由于采取了特殊的稳定性处理，一般４℃保存效价稳定在１ 木素复染，更能衬托出组织形态结构，使形态与功能密切相关， 年以上，且可反复使用。由厂商提供标准试剂盒，它具有第一 便于对结果进行分析。 抗体和第二抗体的特异性和敏感性及选择合适的稀释度、稀释 ８染色结果的判断 剂、孵育温度和时间等。因而购试剂盒时要观察日期，积压过 良好的免疫组化染色应为背景清晰，阳性细胞呈现棕黄一 久的试剂盒会使抗体效价下降，导致显色欠佳。发生此现象应 棕褐色颗粒，阳性颗粒应定位于抗原所在的部位上，如果阳性 积极采取补救措施。一般在正规操作方法基础上，稍微延长反 颗粒不在抗原的特定部位上，则为阴性。总之，要提高免疫组 应及显色时间即可。 化染色技术，不但要注意标本的固定、切片、染色等环节的规范 ６温 度 操作，而且还要在实际工作中不断摸索，完善免疫组化技术，只 温度对固定影响极小，但对抗原和抗体的有效结合会产生 有这样才能更好地解决实际工作中的问题，给正确的病理诊断 影响。在免疫组化染色中，为了增强抗体的敏感度和降低组织 提供有力的技术保障。 切片的染色背景，多采用一抗４℃冰箱内过夜的措施。但对某 些效价低的单克隆抗体或不易与抗原结合的抗体而言，４℃冰 参考文献： 箱内过夜有时效价并不理想。究其原因可能是孵育温度过低， ［１］周小鸽．免疫组织化学染色的干扰因素及其处理［Ｊ］．临 影响了抗体的生物活性，妨碍了抗原抗体特异性结合的速度。 床与实验病理学杂志，２００６，２２（４）：３８９． 适当地提高抗体的孵育温度，能非常有效地强化抗原抗体的特 Ｅ２］马大烈，王伯云．卫生专业技术资格考试指导（病理学与 异性结合。因为前者使提高抗体孵育温度成为现实。具体步 病理学技术）［Ｍ］．济南：山东大学出版社，２００４．２５４． 骤是在加完一抗后，把组织切片置于密封度较好的湿盒内，室 Ｉ－３］陆风珍．微波一用于组织固定和染色的新技术［Ｊ］．中华 温１８～２２℃过夜或使用恒温培养箱更为适宜，这样可比较精 病理学杂志，１９９１，２０：２３２． 确地控制实验温度，保持免疫组化染色条件的稳定。要注意二 抗、三抗的孵育时间需严格控制在１Ｏ～１５ｍｉｎ之内，无须采用 （收稿日期：２００７—０７ ０２） 微波幅射加温或３７℃温箱孵育，以免染色背景过深。 ・经验交流・ 生物可吸收材料治疗关节部位骨折６１例报道 杨徐松，于虎 （浙江省桐乡市第二人民医院３１４５１１） 摘 要：目的 总结生物可吸收材料治疗关节部位骨折的临床应用经验。方法 材料采用成都迪康公司ＰＤＬＬＡ产品和日 本刚子ＰＬＬＡ可吸收钉棒系统以及美国生产的ＭＡＸＯＮ聚甘醇碳酸可吸收线，手术治疗关节部位骨折６１例。结果 ６１例平均 随访５个月，功能评估以关节功能恢复和影像学检查综合判断，优４７例，良１３例，差１例，优良率为９８．３ 。结论 生物可吸收 性材料治疗关节部位较大撕脱性骨折，劈裂骨折等相对简单损伤的治疗效果比较满意，无须二次取出，避免了再次损伤关节。 关键词：生物可吸收材料；关节；骨折 中图分类号：Ｒ６８３；Ｒ３１８．０８ 文献标识码：Ｂ 文章编号：１６７１—８３４８（２ＯＯ７）２２—２３３２ ０２ 随着意外伤害事故的增多，骨折患者明显增多，尤其以关 例，内处髁骨折５例，股骨头骨折３例。材料采用成都迪康公 节部位骨折常见。传统方法需用克氏针钢丝或螺丝钉作内固 司ＰＤＬＬＡ产品和日本刚子ＰＬＬＡ可吸收钉棒系统以及美国 定。骨折愈合后需行第２次手术取出内固定物，给患者造成额 生产的ＭＡＸＯＮ聚甘醇碳酸可吸收线。螺钉直径为３．５、４．５ 外的经济、生理及心理负担。本院白２００１年１月～２００６年１Ｏ ｍｍ，长度２Ｏ～７０ｍｍ，固定棒直径为２、３、４．５ｍｍ，长度４Ｏ～ 月，采用生物可吸收材料治疗关节部位骨折６１例，取得良好的 ７０ｍｍ。 治疗效果，现报道如下。 １．２手术方法 在麻醉下取相应切口，显露骨折部位，充分清 ｌ临床资料 理关节腔及骨折端瘀血及嵌入软组织，行骨折解剖复位，以克 １．１一般资料本组共６１例，其中男４４例，女１７例，年龄８ 氏针、布巾钳作临时固定。若关节面骨块下方的压缩缺损必须 ～６７岁，平均２３岁。骨折均为新鲜骨折，其中髌骨骨折１５ 植骨填充支撑。根据骨折块的部位、骨块的大小、形状、质地选 例，尺骨鹰嘴骨折８例，肱骨大结节撕脱性骨折５例，胫骨髁间 择相应长度、直径、根数的可吸收钉棒，以配套钻头垂直骨折面 骨折３例，内后踝骨折１７例，距骨折１例，股骨髁冠状骨折４ 钻孔、攻丝，并进行钉道冲洗，以减少钉棒固定时的阻力。从关