４０ 实验动物与比较医学Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１６７４—５８１７．２０１７．０１．００９ 小鼠剪尾出血模型的优化 田靖，崔庆华，郭平，张志晓，冯子良，郑颖，范泉水 （成都军区疾病预防控制中心，昆明６５００３２） ［摘要］目的 探讨小鼠剪尾出血模型在凝血药物体内评价过程中应用的可行性。方法对传统 鼠尾出血模型实验过程进行考察和比较分析，对小鼠剪尾模型制备方法进行优化，建立了一种可 快速准确检测鼠尾出血量和出血时间的方法。并利用商品化凝血酶药物苏灵验证了该方法在凝血 药物药效学评价中的有效性，对鼠尾出血量（出血时间）与小鼠凝血时间指标的敏感性比较也显示 了此模型的优越性。结果 优化后的鼠尾出血模型可对小鼠出血量进行低至微升级的精确检测， 通过一定时间间隔的出血量来确定出血终点的方法，很大程度上消除了实验中的人为误差。该模 型操作简便、易于使用，可以敏感且有效模拟体外创伤的动物模型，在评价凝血药物的药效中发 挥作用。结论小鼠剪尾出血模型可以敏感反应凝血药物的体内作用，可作为凝血药物初步筛选 和评价的有效工具。 ［关键词］小鼠剪尾出血模型；创伤模拟；出血量；出血时间 ［中图分类号］Ｑ９５—３３［文献标识ｔｉ－＿ｑ］Ａ［文章编号】１６７４．５８１７（２０１６）０６．００４０—０６ 鼠尾出血模型造模简单方便、易于观察，在 动植物凝血活性成分的评价以及白血病药物的研发 出血量，以出血量值判定出血时间，弥补出血时 终点判定模糊等人为误差，从而使该模型能够有效 反应药物对小鼠出血量和出血时间的影响。本文通 过对小鼠鼠尾出血模型的造模过程以及研究方法的 中发挥着重要作用。然而，小鼠尾部出血模型使 用４Ｏ多年来，不同实验室在小鼠出血模型的制备 方法上存在一些差异，这些差异体现在造模和检测 的各个细节，由于没有统一标准来说明这些操作的 合理性和必要性，使得该模型制备缺乏规范，限 制了鼠尾出血模型的广泛应用。 本文作者认为，小鼠尾部出血造模这一过程 实际上对小鼠尾部静脉、动脉和组织均造成损伤， 优化，使其能够很好模拟生物创伤出血过程，以 探讨该模型在凝血药物筛选和评价中的作用。 １材料与方法 １．１实验动物 可视为一种较为理想的体外创伤模型。作者试图在 小鼠清醒状态下剪尾造模，确保室温条件下鼠尾平 放、血液自由流动，用滤纸采集血液，准确检测 ［收稿日期】２０１６—０８—０８ ［基金项目］全军医学科技青年培育项目（１４ＱＮＰ０５５） ［作者简介】田 靖（１９８２．），女，博士，主治医师，从事生物毒素 及其机制的研究。 Ｅ—ｍａｉｌ：ｔｉａｎｊｉｎｇ１９８０ｓ＠１２６．ｃｏｍ ＳＰＦ级ＫＭ小鼠，４～５周龄，体质量１８～２２ ｇ， 购白中国人民解放军第三军医大学实验动物中心 【ＳＣＸＫ．２０１２—００１ １］；饲养于昆明医科大学ＳＰＦ动物 实验室［ＳＹＸＫ（滇）Ｋ２０１５—０００２１。 １．２药物、试剂和仪器 苏灵，代号Ｓａｃｕｌｉｎ，购白北京康辰药业有限公一Ｊ； ＮａＯＨ，购白广东光华化学厂有限公司：ＥＤＴＡＮａ ，购 自美国Ｓｉｇｍａ公司；生理盐水，购自昆明南疆制药 ： 【通讯作者】郑颖，女，博士，主任医师，研究方向：药学和生 ＳｔａｔＦｌ舣 ２１００型酶标仪，购自美国Ａｗａｒｅｎｅｓｓｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ 公司；ＮａｎｏＤｒｏｐ２０００超微量分光光度计（型号 ＮＤ２０００），购白美国Ｔｈｅｒｍｏ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ公司；水浴锅， 购自金坛市杰瑞尔电器有限公司，型号ＨＨ一２Ｊ；舟４ 物毒素学。Ｅ—ｍａｉｌ：ｚｈｅｎｇｙｉｎｇｃｄｃ＠１６３．ｃｏｍ 范泉水，男，博士，主任医师，研究方向：病毒学和 生物毒素学。Ｅ—ｍａｉｌ：ｆｑｓ１６８＠１２６．ｃｏｍ 实验动物与比较医学Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ４１ 滤纸，购白美国Ｗｈａｔｍａｎ公司；２．５ ｍＬ注射器， 有２ ｍＬ质量浓度１０％ＮａＯＨ溶液的玻璃试管中， 购自江西洪达医疗器械集团有限公司；９６孔板，购 自广州洁特生物过滤制品有限公司。 １．３血液样品最大吸收波长测定 小鼠眼眶内眦取血法采集小鼠新鲜血液１ ｍＬ， 用质量浓度为４％ＥＤＴＡＮａ２抗凝，取２Ｏ Ｌ小鼠抗 凝血液溶解于２ ｍＬ质量浓度为１０％的ＮａＯＨ裂解 液中，震荡试管，使血细胞充分裂解３０ ｍｉｎ，得血 稍微震荡，待滤纸片上血液完全溶解后，静置３０ ｍｉｎ 后加入９６孔板，用分光光度计检测４５０ ｎｍ／６３０ ａｍ 吸光度，对照标准曲线，计算出每分钟内的流血 量（ Ｌ），以累积出血量计算出每只小鼠的出血总 量。当每２ ｍｉｎ流出血液少于１ Ｌ判定为出血终 止，记录出血终止前２ ｍｉｎ时间点为出血时间。同 时按照常规方法记录小鼠实际出血时间，以滤纸片 液裂解样品。取２ ｕＬ裂解液，用ＮａｎｏＤｒｏｐ对其 进行蛋白吸收波长进行扫描，将明显吸收峰处波长 确定为最大吸收波长。 １．４血液裂解标准品吸光度曲线绘制 分另０取／Ｊ、鼠抗凝血２ Ｌ、４ Ｌ、６ Ｌ、８ Ｌ、 １Ｏ Ｌ、１２ Ｌ、１４ Ｌ、１６ Ｌ和１８ Ｌ加入至０ ２ ｍＬ 质量浓度为１０％ＮａＯＨ溶液中，充分裂解３０ ｍｉｎ，以 质量分数１０％ＮａＯＨ溶液为空白对照，用ＮａｎｏＤｒｏｐ 依次测定其在４１８ ａｍ处吸光值，绘制拟合曲线，计 算Ｒ２值。将各样品依次加入到９６孔板中，２００ 孔， 每个浓度重复三孔，用酶标仪测定样品在４５０ ｎｍ、 ４０５ ｎｍ、４９２ ａｍ波长以及双波长４０５ ｎｍ／６３０ ｎｍ、 ４５０ｎｒｎ／６３０ｎｍ处吸光值，绘制拟合曲线，计算Ｒｚ值。 １．５出血量检测方法建立以及回收率检测 将｝｝４滤纸剪成１５ ｍｍ×１５ ｍｍ方块，在滤 纸上分别滴加抗凝血３ Ｌ、９ Ｌ和ｌ８ Ｌ，使滤纸 片充分吸收血液后将滤纸片放入含有２ ｍＬ质量浓度 为１０％ＮａＯＨ裂解液的试管中，室温下充分震荡， 观察滤纸片纤维完全松散，滤纸片上血液完全溶解 为止。静止试管３０ ｍｉｎ，取上清２００ Ｌ／孔测定 ４５０ ｎｍ／６３０ ｎｍ处的吸光值，利用标准曲线计算回 收血液量，计算回收率。同以上方法，检测微量 血液（０．４ Ｌ～１．８ Ｌ）的回收血液量，计算回收率。 １．６小鼠出血量与出血时间检测 小鼠２Ｏ只，雌雄各半，按照体质量随机分为 ２组，每组１０只，尾静脉给药，样品组给予生理 盐水配制的苏灵（０．６２ Ｕ ｇ），对照组给予相应体积 的生理盐水。用药３０ ｍｉｎ后将小鼠用固定器固定， 用含有乙醚的棉球对小鼠进行吸入性麻醉，使其减 少自主行动后将鼠尾平放于桌面上，用体积分数７０％ 乙醇消毒鼠尾，待酒精挥发后在鼠尾末端５ ｍｍ处 用灭菌的手术刀片割断，立即用１５ ｍｍ×１５ ｍｍ 定量滤纸片吸取断尾处血液（不要直接接触到尾部） 并开始计时，每２ ｍｉｎ将吸取血液的滤纸片放入装 上肉眼未见血点为出血终止。 １．７小鼠凝血时间检测 小鼠４０只，雌雄各半，随机分为４组，每组 １０只。每组小鼠分别静脉给予剂量为０．１６ Ｕ／ｋｇ、 ０．６４ Ｕ／ｋｇ和２．４８ Ｕ／ｋｇ生理盐水稀释的苏灵溶液， 对照组给予生理盐水。给药３０ ｍｉｎ后小鼠ＩＩＩＩ！内 眦取血并计时，丢弃第一滴血，取两滴血液滴于 ３７℃水浴保温的玻片上，用针尖垂直挑动血液， １０ Ｓ挑动一次，待出现第一丝纤维蛋白时停止计 时，即为小鼠凝血时间。 １．８统计方法 采用ＳＡＳ ９．２软件采用相应的统计学分析方法 进行显著性差异分析，Ｐ＜０．０５为差异有统计学意义。 ２结果 ２．１血液裂解样品最大吸收波长确定 将溶解在质量分数１０％ＮａＯＨ中的小鼠抗凝血 样品进行全波长扫描后发现该血液样品在４１８ ｎｍ处 具有最大吸收峰，扫描结果见图１。 ２．２酶标仪检测波长对吸光度的影响 血液标准样品吸光度检测及拟合曲线如图２Ａ 和图２Ｂ所示。通过比较同一样品在不同检测波长 图１血液裂解样品的蛋白广谱扫描图 ４２ 实验动物与比较医学Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｆｅｂ２０１７．３７（１） ．下吸光值拟合曲线显示，酶标仪４５０ ｎｍ／６３０ ｎｍ吸 光值曲线（Ｒ２＝０．９８４８５）具有良好的线性关系，而在 ４５０ ａｍ、４０５ ｎｍ、４９２ ｎｍ和４０５ ｎｍ／６３０ ｎｍ波 ２．３酶标仪４５０ ｎｍ／６３０砌波长检测血液样品的回 收率 对血液量检测方法进行了回收率验证，血液量 小于１ ＢＬ的微量血液样本（Ｏ＿４ ＵＬ一０．８ ＢＬ）的回收率 在７６．９６％～９３．２８％，血液量大于１ ＢＬ（１．０ ｇＬ～１８ ＢＬ） 时，样品回收率在９５．１５％～１１３．４９％，表明本方法可 以较为准确检测小鼠实际出血量，并且对大于１ ｕＬ 的血液样本检测准确率更接近于真实值。 长下检测则线性不佳。与ＮａｎｏＤｒｏｐ分光光度计检 测到的４１８ ｎｍ吸光值曲线（Ｒ ＝０．９９４３４）相比，酶标 仪４５０ ｎｍ／６３０ ｎｍ吸光值曲线也最为接近，因此， 可以用酶标仪４５０ ｎｍ／６３０ ｎｍ处吸光值代替４１８ ｎｍ 处吸光值，进行大量样品的吸光度检测。 Ａ Ａ：表格显示在４０５ ａｍ、４１ ８ ａｍ、４５０ ｎｍ、４９２ ｎｍ以及双波长４０５ ｎｍ／６３０ ｎｍ和４５０ ｎｍ／６３０ ｎｍ检测条件下的吸光度 （Ａ）拟合曲线。Ｒ２值代表拟合系数。Ｂ：标准血液样品在不同吸光度条件下的吸光值曲线图。 图２血液样品标准品在不同波长检测条件下的吸光度值 表１模拟血液样品的回收率 小鼠尾部出血总量（图３）、显著缩短出血时问（图４）， 凝血效果显著。出血准确时间检测直接统计，按 ●厶■ａ ● ｏ 一 一 一 一 一 一 蛆封 照原方法进行统计分析（表２），结果也显示与改进 后的出血时间统计方法得出结论一致。 躲 ２．４鼠尾出血模型出血量和出血时间检测的有效性 验证 为了验证鼠尾出血时间和出血量检测是否可以 有效评价药物的止血效果，评价了商品化药品苏灵 给药对这两个指标的影响。结果显示，０．６２ Ｕ／ｋｇ剂 量苏灵（Ｓａｃｕｌｉｎ）（由临床使用剂量换算）可以显著缩短 注：苏灵（０．６２）表示苏灵使用剂量为Ｏ．６２ Ｕ／ｋｇ，利用 ＳＡＳ９．２软件进行单因素多水平非参数检验（Ｋｒｕｓｋａｌ—Ｗａｌｌｉｓ检 验１，Ｐ＝０．０１４＜０．０５。 图３剪尾后小鼠出血量检测 ＝１０） 实验动物与比较医学Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ４３ ．．．生 ・苏灵（０．６２） 丑 警 茁 Ｏ ＇Ｏ ∞ 加 时闻［ｍｌｌｒｌ 注：苏灵（０．６２）表示苏灵使用剂量为０．６２ Ｕ／ｋｇ，本实验 设计为成组资料一元生存分析。利用ＳＡＳ９．２软件对断尾后小鼠 出血率进行乘积极限法（ｋａｐｌａｎ—ｍｅｉｅｒ法）估算，Ｐ＝０．０２８３＜０．０５ 图４剪尾后出血小鼠出血百分比与时间曲线 ＝１０） 表２精确测定小鼠出血时间 生理盐水 ２６．２９±８．８７ 苏灵（０．６２） １５＿３５±６．７８ 注：利用ＳＡＳ９．２软件进行单因素多水平非参数检验 （Ｋｒｕｓｋａｌ—Ｗａｌｌｉｓ检验），Ｐ＝Ｏ．００６５＜０．０５ ２．５鼠尾出血量和出血时间检测与小鼠凝血时间指 标敏感性的比较 为了评价出血量和出血时间指标在检测药物药 效中的敏感性方面是否具有优势，将这两个指标与凝 血时问指标进行比较。结果显示，引起小鼠出血时 问显著缩短的苏灵剂量（０．６２ Ｕ／ｋｇ）对小鼠凝血时间并 没有显著性影响，随着给药剂量增加４倍（２．５６ Ｕ／ｋｇ）， 凝血时间有缩短的趋势，但与对照组比较无显著性 差异（图５）。 注：苏灵（０．１６）、苏灵（０．６２）和苏灵（２．４８）表示苏灵使 用剂量为０．１６Ｕ／ｋｇ、０．６２Ｕ／ｋｇ和２．４８Ｕ／ｋｇ。本实验资料属 于单因素多水平一元定量资料，利用ＳＡＳ９．２软件进行单因素 ４水平设计定量资料的方差分析（ＳＮＫ检验），Ｐ＝０．１３７０＞０．０５， 说明组间均值无显著性差异。 图５小鼠凝血时间（ｎ＝ｌＯ） ３讨论 从模拟创伤的角度去看待小鼠尾部出血模型是 本研究的出发点，作者对模型进行了必要改进， 在检测方法上也有所创新。 国内在制作小鼠剪尾模型时通常不进行麻醉， 而国外剪尾模型中使用最多的麻醉剂如异氟醚 （ｉｓｏｆｌｕｒａｎｅ）ｔ”、氯氨酮（ｋｅｔａｍｉｎｅ）／美托咪定［２】、氯氨 酮（ｋｅｔａｍｉｎｅ）／甲苯噻嗪『３】、戊巴比妥钠（ｐｅｎｔｏｂａｒｂｉｔａｌ ｓｏｄｉｕｍ）［４１等在静脉给药麻醉时通常会导致动物体温 降低［ｓ】或导致收缩压改变ｌ ６Ｉ等情况而影响鼠尾出血 量，本方法在满足动物福利的基础上采用乙醚对 小鼠进行吸入麻醉，以最大限度减少麻醉剂对凝 血参数的影响。鼠尾切口的选择常按照距离尾尖 ２ ｍｍ一２０ ｍｍ［ －７＿ 、鼠尾直径（３ ｍｍ）［１Ｏｌ处剪断，或 是只选择性切断尾部静脉…】，本方法通过严格控 制小鼠体质量达到尽量缩小鼠尾个体间差异，而 ５ ｍｉｌｌ剪尾位置的确定可以保证小鼠具有足量可供检 测的出血量外，不会对其生命或者健康造成影响。 剪尾后观察出血情况是将鼠尾平放于桌面或是将其 垂直放入３７℃生理盐水『ｌ２，¨］中，除了维持一个恒 定的环境温度外，还利于血液的收集，３７℃水浴 条件下观察与室温平放鼠尾观察相比，前者可显著 缩短出血时间…】，因此在室温条件下收集血液、 观察出血时间可能比较接近自然创伤后出血和止血 的生理过程。 采用滤纸浸润面积＿ｌ５】和滤纸称重法来估算［１６］出 血量比较粗略。本实验检测小鼠血液裂解液样品在 ４１８ ｒｉｍ吸光度值的方法可以大大提高检测精确性， 并不同于文献报道［１７，１８】的在５５０ ａｍ左右进行吸光度 检测的方法。为了达到出血量的大样本检测，降低 方法对实验仪器设备的要求，作者探索了利用９６孔 板酶标仪的现有波长组合酶标仪４５０ ｎｍ／６３０ ｎｍ双 波长来代替４１８ ｎｍ检测的吸光度值，标准样品在两 个吸光度条件下标准曲线可以较好重叠，并达到良 好线性结果，使血液检测量可以达微升级。究其原 因，４５０ ａｍ波长与４１８ ｎｍ波长相接近，用６３０ ｎｍ 波长抵消一部分背景之后，恰好能满足４１８ ｎｍ波 长检测的需要，这一推测已在实验中验证。 各研究者判定出血终点以出血时间不长于 ３０ ｍｉｎｔ 、６０ ｍｉｎｔ１９］或者３０ Ｓ内不出现反复出血为 出血终止，而绝大多数实验方法中并没有对出血终 实验动物与比较医学Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｆｅｂ２０１７．３７（１） 止的判定方法加以准确说明。实际操作中，对出血 终点的判定往往不是特别清晰，小鼠由于个体差异 会出现停止出血后再出血，甚至多次反复出血的情 况，使出血时间指标浮动性变大，对实验结果造成 影响。本方法将出血量与出血时间检测相结合， 以出血量判定出血时间。由于血液定量方法在检 Ｎ＞Ｉ ｇＬ血液样品时准确性较高，因此人为规定将鼠 尾间隔２ ｒａｉｎ内出血量＜１ ｕＬ的阶段判定为出血终 止，并用生存分析法对小鼠出血时间进行显著性差 异分析。此方法可以很好代替传统精确测量出血时 间的方法，统计学处理方法的调整也可以更科学分 析出血时问不属于正态分布的时间相关数据。 动物实验中曾证实【２０】苏灵可以使小鼠剪尾出血 时间和兔凝血时问显著缩短，因此苏灵可作为阳性 药物进行方法学比较。结果显示，能够显著缩短 出血量和出血时间剂量的苏灵并不能显著缩短小鼠 凝血时间，因此凝血时间指标和出血时间（出血量） 指标的敏感性显而易见。 然而，动物实验方法只能是对药物药效进行 一个初步的预判，不能代表药物在人体的真实作 用。因此应该谨慎对待动物实验的结果，从实验 动物的种属类别、检测指标、检测方法等多方面 进行考虑和实验设计，以求最大限度预测药物对人 体的作用。 参考文献： 【１】ＭｅｉＢ，ＰａｎＣ，ＪｉｎａｇＨ，ｅｔａ１．Ｒａｔｉｏｎａｌｄｅｓｉｇｎｏｆａｆｕｌｌｙ ａｃｔｉｖｅ， ｌｏｎｇ—ａｃｔｉｎｇ ＰＥＧｙｌａｔｅｄ ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩＩ ｆｏｒ ｈｅｍｏｐｈｉｌｉａ Ａ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ 【Ｊ】．Ｂｌｏｏｄ，２Ｏ１Ｏ，ｌ１６（２）：２７０—２７９． ［２】Ｂｒｏｚｅ ＧＪ Ｊｒ，Ｙｉｎ ＺＦ，Ｌａｓｌ（ｙ Ｎ．Ａ ｔａｉｌ ｖｅｉｎ ｂｌｅｅｄｉｎｇ ｔｉｍｅ ｍｏｄｅｌ ａｎｄ ｄｅｌａｙｅｄ ｂｌｅｅｄｉｎｇ ｉｎ ｈｅｍｏｐｈｉｌｉａｃ ｍｉｃｅ［Ｊ］．Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ，２００１，８５（４）：７４７・７４８． 【３】Ｍａｒｏｎｅｙ ＳＡ，Ｃｏｏｌｅｙ ＢＣ，Ｆｅｒｒｅｌ ＪＰ，ｅｔ ａ１．Ａｂｓｅｎｃｅ ｏｆ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｔｉｓｓｕｅ ｆａｃｔｏｒ ｐａｔｈｗａｙ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｍｉｔｉｇａｔｅｓ ｂｌｅｄ— ｉｎｇ ｉｎ ｍｉｃｅ ｗｉｔｈ ｈｅｍｏｐｈｉｌｉａ［Ｊ］．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ． ２０１２．１０９（１０）：３９２７．３９３１． ［４】Ｔｒａｎｈｏｌｍ Ｍ， ｓｔｅｎｓｅｎ Ｋ，Ｋｒｉｓｔｅｎｓｅｎ ＡＴ，ｅｔ ａ１．Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ．ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓ ｗｉｔｈ ｓｕｐｅｒａｃＵｖｅ ａｎａｌｏｇｓ ｏｆｆａｃｔｏｒ ＶＩＩａ ｉｎ ａ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ ｏｆｈｅｍｏｐｈｉｌｉａ Ａ【Ｊ１．Ｂｌｏｏｄ，２００３，１０２（１０）：３６１５—３６２０． ［５］Ｔａｙｌｏｒ ＤＫ．Ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｔｗｏ ｄｅｖｉｃｅｓ ｕｓｅｄ ｔｏ ｍａｉｎｔａｉｎ ｎｏｒｍｏｔｈ— ｅｎｎｉａ ｉｎ ｒａｔｓ ｎａｄ ｍｉｃｅ ｄｕｒｉｎｇ ｇｅｎｅｒａｌ ｎａｅｓｔｈｅｓｉａ［Ｊ］．Ｊ Ａｍ Ａｓｓｏｃ Ｌａｂ Ａｎｉｍ Ｓｃｉ，２００７，４６（５）：３７—４１． 【６］Ｆｌｅｃｋｎｅｌｌ Ｐ．Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ａｎａｅｓｔｈｅｓｉａ，Ｆｏｕｒｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ 【Ｍ】．Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，２０１６：５０． ［７］许火龙，李冲，韦晓慧，等．核桃叶提取液对小鼠出血时间 和凝血时间的影响【Ｊ】＿中外医学研究，２０１６，１４（１２）：２．４． ［８】刘萍，刘文波，张婧，等．仙脉通胶囊对小鼠出血时间和凝 血时间的影响［Ｊ１．中医药信息，２０１２，２９（６）：４０—４１． ［９吴晓宁，余陈欢，徐静红．乌蕨总黄酮及水提液的药理实验 ９］［Ｊ］．康复学报，２００４，１４（１）：１３—１４． ［１０】Ｉｖａｎｃｉｕ Ｌ，Ｔｏｓｏ Ｒ，Ｍａｒｇａｒｉｔｉｓ Ｐ，ｅｔ ａ１．Ａ ｚｙｍｏｇｅｎ—ｌｉｋｅ ｆａｃｔｏｒ Ｘａ ｖａｒｉａｎｔ ｃｏｒｒｅｃｔｓ ｈｔｅ ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ ｄｅｆｅｃｔ ｉｎｈｅｍｏｐｈｉｌｉａ［Ｊ］． ＮａｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２０１１，２９（１１）：１０２８—１０３３． ［１ １】Ｊｏｈａｎｓｅｎ ＰＢ，Ｔｒａｎｈｏｌｍ Ｍ，Ｈａａｎｉｎｇ Ｊ，ｅｔ ａ１．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｔａｉｌ ｖｅｉｎ ｔｒａｎｓｅｃｔｉｏｎ ｂｌｅｅｄｉｎｇ ｍｏｄｅｌ ｉｎ ｆｕｌｌｙ ａｎａｅｓｔｈｅｔｉｚｅｄ ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉａ Ａ ｍｉｃｅ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｗｏ ｎｏｖｅｌ ＦＶＩＩＩ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ［Ｊ］．Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉａ，２０１６，２２（４）：６２５—６３１． ［１２］祝晓雯，宋娥，金若敏，等．水蛭超细粉及水煎液活血化 瘀作用的比较研究【Ｊ】．中药新药与临床药理，２０１１，２２（１）： ３３．３７． ［１３】聂牧，王云，郭守东，等．板栗多糖抗动脉血栓形成的作用 食品科学【Ｊ１．２０１５，３６（１１）：１８７ １９０． 【１４１ Ｄｅｊａｎａ Ｅ，Ｃａｌｌｉｏｎｉ Ａ，Ｑｕｉｎｔａｎａ Ａ，ｅｔ ａ１．Ｂｌｅｅｄｉｎｇ ｔｉｍｅ ｉｎ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ａｎｉｍａｌｓ．ＩＩ—Ａ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ａｓｓａｙ ｃｏｎ— ｄｉｔｉｏｎｓ ｉｎ ｒａｔｓ［Ｊ］．Ｔｈｒｏｍｂ Ｒｅｓ，１９７９，１５（１—２）：１９１—１９７． ［１５］刘彬，张海涛，刘慧明，等．鲎素对小鼠出血时间和凝血时 间的影响【Ｊ］．广东医学院学报，２０１５，３３（１）：４９—５１． ［１６］张家铨，邹节明．血伤宁的药理研究［Ｊ］．中成药，１９８０（２）： ４３４６． ［１７］王继生，李惠芝，邱宗荫，等．茅莓总皂苷的主要药效学研 究【Ｊ］．中药药理与临床，２００７，２３（１）：３４—３６． ［１ ８】Ｓｈａｗ ＳＴ Ｊｒ，Ａａｒｏｎｓｏｎ ＤＥ，Ｍｏｙｅｒ ＤＬ．Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｅｎｓｔｒｕａｌ ｂｌｏｏｄ ｌｏｓｓ—ｆｕｒｔｈｅｒ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ａｌｋａｌｉｎｅ ｈｅｍａｔｉｎｍｅｔｈｏｄ［Ｊ］．Ｃｏｎｔｒａｃｅｐｔｉｏｎ，１９７２，５（６）：４９７—５１３． 【１ ９］Ｗａｒｎｅｒ ＲＬ，ＭｃＣｌｉｎｔｏｃｋ ＳＤ，Ｂａｒｒｏｎ ＡＧ，ｅｔ ａ１．Ｈｅｍｏｓｔａｔｉｃ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ａ ｖｅｎｏｍｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ ｒａｔ ｏｒｇａｎ ｒｔａｕｍａ［Ｊ］．Ｅｘｐ Ｍｏｌ Ｐａｔｈｏｌ，２００９，８７（３）：２０４—２１ １． 【２０】沈稚琴，黄稚萍．月经血量测定的方法学和临床应用【Ｊ］． 现代检验医学杂志，１９９５，１０（２）：５。７． Ｆｅｂ．２０１７，３７（１） 实验动物与比较医学Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ４５ Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ ｏｎ Ｔａｉｌ Ｔｉｐ Ｂｌｅｅｄｉｎｇ Ｍｏｄｅｌ ｉｎ Ｍｉｃｅ ＴＩＡＮ Ｊｉｎｇ。ＣＵＩ Ｑｉｎｇ—ｈｕａ，ＧＵＯ Ｐｉｎｇ，ＺＨＡＮＧ Ｚｈｉ—ｘｉａｏ，ＦＥＮＧ Ｚｉ—ｌｉａｎｇ，ＺＨＥＮＧ Ｙｉｎｇ，Ｉ Ｑｕａｎ—ｓｈｕｉ ｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆＭｉｌｉｔａｒｙ Ｍｅｄｉｃａｌ，Ｃｈｅｎｇｄｕ Ｍｉｌｉｔａｒｙ Ｒｅｇｉｏｎ＇ｓ Ｃｅｎｔｅｒｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ＆Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ，Ｋｕｎｍｉｎｇ ６５００３２，ＣｈｉｎａＪ 【Ａｂｓｔｒａｃｔ】Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｈｅ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔａｉｌｔｉｐ ｂｌｅｅｄｉｎｇ ｍｏｄｅｌ ｉｎ ｍｉｃｅ ｗａｓ ｅｘｐｌｏｒｅｄ ｔｏ ｅｖａｌｕａｔｅ ｔｈｅ ｈｅｍｏｓｔａｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｓｏｍｅ ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ．Ｍｅｔｈｏｄ Ｔｈｉｓ ｔａｉｌ ｔｉｐ ｂｌｅｅｄｉｎｇ ｍｏｄｅｌ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｔｏ ｂｅ ｕｓｅｄ ａｓ ａ ｔｒａｕｍａ ｍｏｄｅｌ ｉｎ ｔｈｅ ａｓｐｅｃｔ ｏｆ ｃｏａｇｕｌａｎｔ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｗａｓ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ ＯｐｅｒａｔｉＯｎ ｐｒｏｃｅｓｓ．Ｔｈｅ ｎｅｗ ｍｅｔｈｏｄ ｗａｓ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ｆｏｒ ｆａｓｔ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｂｌｏｏｄ ｌｏｓｓ ａｎｄ ｄｅｃｉｄｅｄ ｔｈｅ ｂｌｅｅｄｉｎｇ ｔｉｍｅ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｓｔａｒｔｉｎｇ ｐｏｉｎｔ ｗｈｅｎ ｔｈｅ ｔａｉｌ ｗａｓ ｃｕｔ ｏｆｆ ｔｏ ｔｈｅ ｅｎｄ ｐｏｉｎｔ ｗｈｅｎ ｔｈｅ ｂｌｏｏｄ ｌｏｓｓ ｗａｓ ｌｅｓｓ ｔｈａｎ １ ｇＬ ｉｎ ｔｗｏ ｍｉｎｕｔｅｓ ｉｎｔｅｒｖａｌｓ．Ｓａｃｕｌｉｎ ａｐｐｒｏｖｅｄ ａｓ ａ ｃｏａｇｕｌａｎｔ ｄｒｕｇ ｏｎ ｓａｌｅ ｉｎ ｄｏｍｅｓｔｉｃ ｍａｒｋｅｔ ｗａｓ ｕｓｅｄ ｔｏ ｖｅｒｉｆｙ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｎｅｓｓ ｏｆ ｔｈｉｓ ａｓｓａｙ．Ｔｈｅ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｂｅｔｗｅｅｎ ｃｏａｇｕｌａｔｅ ｔｉｍｅ ａｎｄ ｂｌｏｏｄ ｌｏｓｓ ｆｏｒ ｂｌｅｅｄｉｎｇ ｔｉｍｅ）ｉｓ ａｌｓｏ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｉｎ ｍｉｃｅ．Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｔｈｅ ａｄｖａｎｃｅｄ ｔａｉｌ ｔｉｐ ｂｌｅｅｄｉｎｇ ｍｏｄｅｌ ｉｎ ｍｉｃｅ ｃａｎ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｂｌｏｏｄ ｌｏｓｓ ａｎｄ ｂｌｅｅｄｉｎｇ ｔｉｍｅ ｉｎ ｏｒｄｅｒ ｔｏ ｒｅｄｕｃｅ ｔｈｅ ｐｅｒｓｏｎａｌ ｅｒｒｏｒ ｔｏ ａ ｇｒｅａｔ ｅｘｔｅｎｔ．Ｔｈｉｓ ｍｏｄｅｌ ｉＳ ｅａｓｙ ｔｏ ｕｓｅ ａｎｄ ｃａｎ ｓｉｍｕｌａｔｅ ｔｈｅ ｐｒｏｃｅｓｓ ｏｆ ｔｒａｕｍａ ｐｒｏｐｅｒｌｙ・ Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ Ｔｈｅ ｔａｉｌ ｔｉｐ ｂｌｅｅｄｉｎｇ ｍｏｄｅｌ ｉｎ ｍｉｃｅ ｃａｎ ｒｅｆｌｅｃｔ ｔｈｅ ａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｅ ｃｏａｇｕｌａｎｔｔ ｄｒｕｇ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅｌｙ， ｗｈｉｃｈ ｉｓ ａ ｕｓｅｆｕｌ ｔｏｏｌ ｏｒｆ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ａｎｄ ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ ｃｏａｇｕｌａｎｔｓ． ｆＫｅｙ ｗｏｒｄｓ】Ｔａｉｌ ｔｉｐ ｂｌｅｅｄｉｎｇ ｍｏｄｅｌ；Ｍｉｃｅ；Ｓｉｍｕｌａｔｅｄ ｔｒａｕｍａ；Ｂｌｏｏｄ ｌｏｓｓ；Ｂｌｅｅｄｉｎｇ ｔｉｍｅ