流行性造血器官坏死病毒焦磷酸测序方法研究

:/DOI１０．１６３７８．cnki．１００３Ｇ１１１１．２０１９．０５．０２０j

FISHERIES　SCIENCE

水产科学

Vol．３８No．５

Se．２０１９p

流行性造血器官坏死病毒焦磷酸测序方法研究

王　娜１,张　旻１,张　舟１,景宏丽１,任　彤２,张利峰２,吴绍强１

(中国检验检疫科学研究院,北京１北京海关技术中心,北京１１．００１７６;２．０１１１３)

摘　要:为建立流行性造血器官坏死病毒的焦磷酸测序检测方法,本研究针对流行性造血器官坏死病毒O设计扩增引物及测序引物,经PRF６５基因的保守区域进行分析,CR扩增后对PCR产物进行焦磷酸测序,通过对反应条件和反应体系的优化,成功建立了该检测方法.试验结果显示,该方法扩增基因,,片段长度为１焦磷酸测序长度为３能够特异性检测出流行性造血器官坏死病毒,最低核酸３７b８bpp/检测限为０．与常规P５pL,CR检测方法的符合率达１００％.本研究建立的流行性造血器官坏死病gμ毒焦磷酸测序检测方法特异性强、灵敏度高、重复性好,为流行性造血器官坏死病毒的快速检测提供了一种可行方法.

关键词:流行性造血器官坏死病毒;焦磷酸测序;检测PCR;中图分类号:S９４１．８

文献标识码:A

()文章编号:１００３Ｇ１１１１２０１９０５Ｇ０７２１Ｇ０５

　　流行性造血器官坏死病是有鳍鱼类一种全身

性的临床或亚临床的感染性疾病.世界动物卫生组织将流行性造血器官坏死病列入必须报告的疫病名录,我国将其列为«中华人民共和国进境动物一、二类传染病、寄生虫病名录»的二类传染病.流(Eizootichaematooieticnecrosisvirus,EHNV)pp引起,流行性造血器官坏死病毒是一种双链DNA鳍鲈(Percafluviatilis)和虹鳟(Oncorhnchusy是仅有的天然感染的两种硬骨鱼类.虹鳟mkiss)y因流行率很低,虽然死亡率高,６０％~８０％的濒死鱼或死亡鱼中都可以分离出流行性造血器官坏死病毒,而未出现临床症状的鱼中,只有不到４％的鱼中可以分离到病毒,所以虽然死亡率很高,但仍然

]１Ｇ５

.各年龄阶段的虹鳟和红不易被怀疑或被检出[

检测的标准方法主要是基于细胞培养的病毒分离,

[]

操作繁琐,诊断时间长,抗原捕PCR等手段鉴定５,

获E但敏感性仅为LISA可以有效鉴定该病毒,

然后用组织病理、免疫荧光、电镜技术和ELISA、

行性造血器官坏死病由流行性造血器官坏死病毒

且难以区分流行性造血器官坏死病毒和蛙病６０％,

]６

;毒属的其他成员[但仍会有PCR方法虽然灵敏,假阳性出现的可能,需要通过测序进行确诊,延长了确诊时间;其他方法无法满足在分子水平上快速确诊病原的需求.

焦磷酸测序技术不需要荧光标记引物或核酸探针,不需要凝胶电泳,具有分析快速、准确、灵敏度高和实时检测的特点,适于对已知短序列的测序

７Ｇ９]

,分析[广泛应用于细菌、真菌和病毒的分型,突１０Ｇ１４]

.该变位点的检测及单核苷酸多态性分析等[

.红病毒,属于虹彩病毒科、蛙病毒属(Ranavirus)

方法在普通P对PCR的基础上,CR产物进行测序,提高了检测的特异性,且给出了分子诊断的黄金标准—基因序列,减少了由于PCR敏感性高而出现的假阳性结果,提高了检测的准确性,目前该技术已经逐渐成为实验室非常重要的DNA分析新手

１５Ｇ１６]

.本研究针对流行性造血器官坏死病毒段[

鳍鲈均易感,虹鳟的感染率低、死亡率高;而红鳍鲈

]３Ｇ４

.我国是鲈鱼和虹的感染率和死亡率均非常高[

鳟养殖大国,如果发生流行性造血器官坏死病毒感染会给我国水产养殖业造成巨大经济损失,因此加强流行性造血器官坏死病的监测和流行病学调查是目前比较有效的预防措施;同时进行快速精确诊断方法的研究,是当前我国流行性造血器官坏死病防控的迫切需要.目前,流行性造血器官坏死病毒

利用焦磷酸测序软件设计ORF６５基因的保守区域,

通过对反应条件PCR扩增引物及焦磷酸测序引物,与体系的优化,建立流行性造血器官坏死病毒为流行性造血ORF６５基因的焦磷酸测序检测方法,

收稿日期:２０１８Ｇ０１Ｇ０４;　修回日期:２０１８Ｇ０９Ｇ１７．

)基金项目:国家科技部“十二五”科技支撑计划项目(２０１３BAD１２B０２．

—),,,;::作者简介:王娜(女副研究员博士研究方向水生动物疫病．通讯作者:吴绍强１９８５EＧmailwanna８５＠yeah．net．g

(,:男,研究员;研究方向:动物疫病．１９７０—)EＧmailswu＠sina．com．q

７２２

水　产　科　学

第３８卷

器官坏死病的监测和防控提供新的检测手段.

１　材料与方法

１．１　病毒株

流行性造血器官坏死病毒、斑点叉尾

病毒

冷却至９６孔板放入８０℃烘箱中加热２min后,

室温.

物A荧光素PS、dNTP和酶混合物(DNA聚合酶、;酶、然后将ATP硫酸化酶和三磷酸腺苷双磷酸酶)试剂舱和PSQ９６板放入ProMarkQ９６MD测序y仪中进行焦磷酸测序反应,在２所采用０~２８℃下,(,的碱基加入顺序为１每轮测序检测运行５ATGC),时间为６引物链随着不同d５minNTP的加入而延伸,随着核酸的结合,CCD摄像机检测到发出的光根据仪器的软件说明在试剂舱中分别加入底

１．２　主要试剂及仪器

(、、中华鳖虹彩病毒(大鲵虹彩病毒CCV)STIV)

(、玻勒虹彩病毒(等由本实验室保存.ADRV)BIV)DNeaslood&TissueKitDNA提取试剂yB

、盒、ProMarkPCRKitProMarkGoldQ９６SQAyy

购自eage公司;QnIts及焦磷酸测序仪AGEN公司;链霉亲和素包被磁珠购自Py

roMarkQ９６MD等均GEa公司５００b.

pD

NAMarker等其他试剂购自TaKaＧ．３　引物设计

根据GenBank中公布的流行性造血器官坏死

病毒aORF６５基因的特异区域序列,利用PSQA和′ＧyBiDoetsiingＧnSCTW软件设计PCR扩增引物EHNVＧFsＧ

:CEAAHNAＧG３′V及测序引物ＧRC:A５A′ＧGTATCCAAGAAGGCCATAAＧ３′AGTＧ３′,并在ETEHTHNCNVGVＧＧSGF:A５′CATGCTCTTCTＧ扩ＧC增T引TC物TCG端A进TG行Ｇ

生物素标记,预期扩增片段长度为５成和测序由生工生物工程(上海１)３股７b份p有.′限引物合公司完成.

．４　病毒DNA的提取

按照病毒取核酸,立即用于DNA提取试剂盒说明书操作步骤提

.

PCR扩增或置－２０℃冰箱保存备用．５　P以病毒CR反应

行inP;C９４R扩增D并NA为模板,用优化反应条件Py

为ro:M℃３０s,６０℃３０s,７２℃３９０s５arkP℃预CRK变性it进,４５次循环１５

;２℃１０min.PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定后,将其送往公司进行测序.剩余的PCR产物用于焦磷酸测序反应.

．６　单链制备及测序反应

根据焦磷酸测序反应操作说明制备单链模板.

将００２０μgμL的链霉亲PC和R产物与素包被的３０磁μ珠Ld混d合H２,

室O混合后与

温下结合的/min振荡孵育PCR产物１５,然后依次通过min,用真空吸附泵吸附与磁珠１４００７０％乙醇(性缓冲液(S)和冲洗缓冲液()清洗５s)、变L/Q９５s５s

,最后移至孔含有６孔板上方释放磁珠,０．３mol/L测序引物的结合缓９６孔板中预先加入冲液,４将５信号.

１．７　敏感性试验

将模板流行性造血器官坏死病毒μ

L)依次进行１０倍梯度稀释,PCR扩增后进行焦磷DNA(５ng/酸测序反应,确定用于焦磷酸测序的最低检测限.１．８　特异性试验分别以提取的流行性造血器官坏死病毒、斑点叉尾

病毒、中华鳖虹彩病毒、大鲵虹彩病毒和玻勒

虹彩病毒的DNA样品为模板,进行,鉴定扩增引物的特PCR扩增.将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳异性.采用测序结果利用１．６中建立的方法进行焦磷酸测序,对１．９　重复性试验

BLAST鉴定测序引物的特异性.

重复进行果,确定试验的重复性和稳定性３次试验,比较每次测得的序列结

.１．１０　样品检测

将实验室保存的流行性造血器官坏死病毒感

染的虹鳟肝、脾、脑等造血器官坏死病毒的１虹０份组织、鳟组织及５份未感染流行性提取核酸进行焦磷酸测序检测,并与世界动物卫生５０份监测样品,

组织«水生动物疫病诊断手册»中推荐的检测方法进行比较.

２　结１　P　果

２．以流行性造CR反应

血器官坏死病毒用本研究设计的流行性造血器官坏DN死A为模板,

使病毒扩增引物及优化的反应条件进行PCR检测.结果显示,扩增出的特异性片段符合预期大小,没有非特异性扩增产物,满足进行焦磷酸测序反应的需要(图公司测序结果表明,该目的条带与流行性造血器官１)

.坏死病毒２．２　焦磷酸测序反应

ORF６５基因片段同源性为１００％.

流行性造血器官坏死病毒酸测序结果为CCATGAGGAOARFA６T５基因的焦磷ATCTTACC

RR１s５TC１１m７１２rPμ

第５期

王　娜等:流行性造血器官坏死病毒焦磷酸测序方法研究

７２３

即焦磷酸测序结果与普通测序结果完１００％基因,

全一致,该序列能够作为流行性造血器官坏死病毒).快速鉴定的靶序列(图２

CTCTCAAACTGTCTGTCG.将该序列利用

与目的基因序列符合率为BLAST软件进行比较,

的序列片段符合率为１其他病毒核酸未获得００％;任何序列结果.因此表明,本研究方法特异性较好.

图M．DL５１０　流行性造血器官坏死病毒ORF６５基因PCR扩增结果

;２．

０D阴性对照NAMa．rker;１．流行性造血器官坏死病毒ORF６５基因片段图２　流行性造血器官坏死病毒ORF６５基因焦磷酸测序结果

．３　敏感性试验结果

试验结果显示,流行性造血器官坏死病毒

NA模板１０倍系列稀释至－４

时均扩增出与目的条带大小相符的特异性片段１０

(图序反应,模板稀释至性造血器官坏死病毒１０－４

时,

测定的序列均与３);经焦磷酸流测

行ORF６５基因的目标序列一致,为AAACCTCAGTTGCTAGGTGCAGA.A结果表明TATCTT该试验方法最ACCCTCTＧ

低核酸检测限为此为模板扩增得０到．５的pgP/CμRL(产稀释度为,

物可以用１０－４

时),以于焦磷酸测序.

．４　特异性试验结果

以流行性造血器官坏死病毒、斑点叉尾

病毒、

中华鳖虹彩病毒、大鲵虹彩病毒和玻勒虹彩病毒的NA为模板进行焦磷酸测序反应,

结果显示,仅流行性造血器官坏死病毒得到预期大小扩增片段及相应峰型.将该序列进行BLAST分析,

结果与目图M．．５nDLg５/００D３L、０N　流行性造血器官坏死病毒敏感性试验结果

．０A５nMga/rkeLr、;１~７．流行性造血器官坏死病毒５pg/L、０．５pg/L、０．０５pg/５nLg、５f/μ

L、L;８．/阴性对照μ．μμμμ

g．５　重复性试验结果重复进行表明该方法具有很好的重复性与稳定性３次试验,一致,PCR扩增结果及测得序列.．６　样品检测

利用本研究建立的焦磷酸测序检测方法对实验室保存的品检测结果为阳性６５份样品进行检测.(包括１份弱阳１０份阳性组织样性)、５份阴性组织样品检测结果为阴性,为阴性,与世界动物卫生５０份监测样品检测结果均组织«水生动物疫病诊断手册»中推荐的PCR检测结果一致,符合率为　１００％.

讨　论

本试验通过优化反应条件,成功建立了流行性造血器官坏死病毒焦磷酸测序检测方法.该方法为国内外首次建立流行性造血器官坏死病焦磷酸检测技术.目前该技术已经逐渐成为实

验室非常重要的究人员针对施马D伦N贝A分析新手段[１２Ｇ１８]

格病毒[１５]

.国内研官坏死病毒[１６]、传１７染性造血器米虫[１８]

等病毒和寄生虫建立了焦磷酸测序检测方

、鲤春病毒血症病毒[]

、贝类包纳法.国外研究人员针对新城疫病毒、流感病毒H３

２等病毒也建立了针对不同毒株变异位点的焦磷酸测序方法并通过大量的临床样品检测验证了方法的有效性,有助于进行病毒学监测和流行病学

调查[

１４,１９

]．１　靶序列的筛选

.欧洲鲇病毒和欧洲

病毒是目前已发现的与流

行性造血器官坏死病毒相似的病毒种,感染不同的宿主,流行性造血器官坏死病毒目前仅发生于澳大

０μ

２２３２DC２ND３７２４

水　产　科　学

病毒和欧洲鲇病毒仅在欧洲检测病毒和欧洲鲇病毒主要引起欧洲鱼

第３８卷

利亚,欧洲

]２０

.欧洲到[

样本含量的要求,因而不能进行有效测序,参照世界动物卫生组织«水生动物疫病诊断手册»的规定,由于不能进行有效测序,因而不能作为疫病阳性检出确诊的依据.而焦磷酸测序方法对于弱阳性样品样本可以直接给出基因序列,且检测结果与PCR完全一致,因而说明焦磷酸方法的高灵敏度是有效的,从而避免了假阳性检出.

本研究所建立的流行性造血器官坏死病毒焦磷酸测序检测方法具有准确性高、重复性和稳定性好,特异性强等优点,从基因序列水平上对流行性类的发病死亡,在欧洲有很高的发病率和死亡率.通过病毒核酸序列比对,筛选出流行性造血器官坏死病毒的特异序列为ORF６４、ORF６５和ORF８７基

２１]

.经美国国立生物技术信息中心数据库因序列[

ORF８７L的基因序列与欧洲鲇病毒的相应序列同

源性极高,且覆盖率均为１００％.而流行性造血器

比对,流行性造血器官坏死病毒的ORF６４R和

官坏死病毒的ORF６５R与欧洲鲇病毒的ORF８９R基因序列的同源性也较高,但覆盖率低,其中欧洲鲇病毒的ORF８９R基因序列中不存在流行性造血器官坏死病毒ORF６５R的５５７~７３０位核苷酸,其中６２５~６７９位核苷酸序列除与２０１６年新分离到的一株短鳍鳗蛙病毒具有同源性以外,与其他基因序列同源性非常低,因此选取核苷酸序列作为靶序列设计引物ORF６,５从而通过焦磷酸R６２５~６７９位测序方法进行流行性造血器官坏死病毒的快速鉴定.

．２　焦磷酸测序引物的设计

焦磷酸测序技术要求选择的序列在p

１００~２００

R,F本６５研基因的究选取核编酸码序流列,行利性用造软血件器进官行坏序死列病分毒析后,设计了符合焦磷酸引物设计要求的扩增引物和测序引物,PCR扩增后将其产物进行焦磷酸测序反应,将获得的特异性序列作为流行性造血器官坏死病毒鉴定的靶序列.通常情况下,焦磷酸测序反应准确测出的碱基数为序反应后,准确测出的碱基序列达２０~３０bp.证明待测样品是否为流行性造血３本研究经优化测８b器官p,坏完全满足死病毒

RF６５基因序列的确诊要求,

具有很好的特异性.与普通测序方法相比,检测效率提升,检测结果更加准确,适用于对流行性造血器官坏死病毒的大规模检测和流行病学调查.

．３　与PCR检测方法的比较

根据世界动物卫生组织«水生动物疫病诊断手

册»[５]

中规定的本研PC究R产物需通过测序才能最终确定

病毒种类.建立的流行性造血器官坏死病毒焦磷酸测序方法耗时短,一般基因序列,从而大大减少了病原确诊时间３~４h就可以得到.利用该方法对实验室保存的６５份样品进行检测,并与世界动物卫生组织«水生动物疫病诊断手册»中推荐的常规PCR方法进行对比,结果显示,焦磷酸测序方法与,P常规CR方法检测结果一致.对于其中的弱阳性样品PCR虽能检出但由于不能满足测序对

造血器官坏死病毒进行精准检测鉴定,为流行性造血器官坏死病毒的快速检测和流行性造血器官坏死病的确诊及流行病学调查提供了一种可行方法,对保障我国鲈鱼及虹鳟等鱼类养殖业的健康发展具有重要意义.

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９６Ｇ１０２．

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,,thePCRproductwascomrisedof１３７bandseuencinlenthof３８bindicatinecificidentificaＧppqggpgasp１００％withconventionalPCRdetectionmethod．Themethodestablishedinthisstudashihsensitivityhgy

andstabilitordetectionofEHNV,whichisalicableforfastdetectionofEHNVandhelfultoeizoＧyfppppotichematooieticnecrosiscontrol．p

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