泸州医学院2012级临床

泸州医学院

本科学生设计性实验报告

专业 临床 年级 2012 班级 4 课程名称 医学遗传学

时 间 2014-06-09

实验设计方案：

实验名称 21三体综合征产前诊断 指导教师 赵娇 总体设计思路： 一、遗传咨询：在病史、体检、家系分析的基础上，进行详细的遗传咨询。 二、羊膜穿刺：羊水中有一定胎儿脱落细胞多为成纤维细胞和上皮细胞，经体外培养后，可进行染色体分析、酶和蛋白质检测、性染色质检查和提取DNA作基因分析，也可不经培养，用微量技术作酶和蛋白质分析或者直接提取DNA做基因诊断 三、核型分析：胎儿脱落的细胞，经体外培养后，制片、显带，在显微镜下进行核型分析（鉴别完全型、易位型、嵌合型三体）。

具体设计方案： 1．实验目的 掌握遗传病的产前诊断过程，通过对21三体综合征的诊断设计，培养运用遗传学现代技术解决医学实际问题的能力。 2．实验原理 羊水中有一定数量胎儿脱落细胞，通过羊膜穿刺获取羊水中的胎儿细胞，经体外培养后通过G显带实验进行核型分析，判断染色体是否畸形，诊断是否患有21三体综合征。 3．实验材料、试剂及器材 3.1 材料 离心管、离心机、天平、37℃温箱、载玻片、盖玻片、酒精灯、恒温水浴锅、光学显微镜、标本表、玻璃铅笔、定时钟、染色缸、直柄虹膜镊、滴管。 3.2 试剂 PH6.8 PBS，Giemsa，0.025﹪胰蛋白酶（取NS 100ml加入0.25﹪胰蛋白酶）、 3.3 主要仪器 离心装置、显微镜、标本板 4．实验方法及注意事项 4.1 方法步骤 4.1.1取材 4.1.1.1：腹部备皮，排光膀胱，平卧位常规消毒后铺无菌洞巾。 4.1.1.2:麻醉（一般不需要，神经紧张者可用普鲁卡因或者利多卡因麻醉） 4.1.1.3：选择穿刺部位，经B超定位后胎盘后，避开胎盘 4.1.1.3.1:中期妊娠时，一般选择在耻骨联合约3横指处，相当于子宫下段处，于腹中线或其左右侧旁，扪及囊样感的部位做穿刺，也可于宫底与耻骨联合连线中点或左右任何一侧做穿刺。 4.1.1.3.2：晚期妊娠时，先扪及胎先露，然后上推先露部，在先露部下方穿刺；也可在胎儿颈背部空隙处或者胎儿肢体侧空隙处做穿刺 4.1.1.4：确定穿刺部位后，用20—21号腰椎穿刺针垂直刺入腹壁，通过腹壁及宫壁两次阻力，当有落空感时即进入羊膜腔，抽出芯针，见羊水溢出，脸上注射器，顺利抽得清亮羊水。 4.1.1.5：穿刺完成后拔出穿刺针，局部压迫不低于5分钟，穿刺部位敷以无菌纱布，用胶布固定 4.1.2：细胞体外培养 4.1.2.1：将抽得的羊水离心，去上清液，取沉淀，沉淀即为胎儿脱落的细胞（大多数为成纤维细胞和上皮细胞） 4.1.2.2：将取得的沉淀，接种到液体培养基（无菌、必需的营养物质，合适的PH值，适当的温度）中，进行原代培养，当细胞的浓度达到X×10e5或者以上时即可 4.1.3：制片 4.1.3.1：取1ml细胞培养液，加入适量PBS和秋水仙素（使细胞分裂处于中期，染色体形态稳定，易于观察），混匀，静置于37℃水浴锅30分钟。 4.1.3.2：蘸取预处理后的细胞培养液，单向单次均匀涂布于载玻片上（约 1cm²大小） 4.1.3.3：待玻片自然风干，点燃酒精灯，将玻片以钟摆速度，在酒精灯外焰处来回摆动三次，固定 4.1.4：显带 4.1.4.1：将制得的染色体标本，置于72℃-75℃烤箱中烤片3h 4.1.4.2：烤片后，将玻片放入预热到37℃的0.025﹪胰蛋白酶液中（PH=7.2）消化1min左右（每次作用时间不完全相同，可根据一张片子的显带效果，调节作用时间） 4.1.4.3：在Giemsa染液中，染色10min，自来水冲洗干净，干燥，即可镜检 4.1.5：核型分析 4.1.5.1：在显微镜高倍目镜下镜检，若染色体上出现清晰的深浅相间的条纹，即为可取标本 4.1.5.2：将制得的标本参照标本板进行比对，进一步确诊（也可用FISH技术辅助诊断） 4.2 注意事项 4.2.1：穿刺时在B超监视下进行，以免伤及胎儿 4.2.2：细胞体外培养时，要求无菌操作，选择正确的培养基，以及适当的培养条件 4.2.3：图片时，单向单次图片，以免细胞重叠，影响观察效果 4.2.4：核型分析时，要细心，耐心。可以加以FISH（荧光原位杂交技术）确诊 4.2.5：胰蛋白酶浓度和处理时间随气温高低和标本新鲜程度有所不同。（一般地，气温高，胰蛋白酶浓度可以适当降低；存放时间越长的标本，处理时间越长，太新鲜的标本，染色体会出现毛绒现象，太久的标本，会导致斑点状的染色体） 4.2.6：胰蛋白酶温度：温度越高，反应越快，一般为室温，但必须得维持至少20min 4.2.7：以蛋白酶处理时间：若细胞呈蓝紫色，则处理时间不够；若为桃红色，则处理时间刚好 5．实验预期结果及遗传指导 5.1：预期结果 5.1.1：核型正常，为46，XX或者46，XY 5.1.2：完全型21三体综合症，核型为 47，XX（或XY） +21 5.1.3：易位型21三体综合症，核型为 46，XX -21 +t（q21:p21）或者46，XY -21 +（q21:p21) 5.1.4:嵌合型21三体综合征，核型为 46XX（或XY）/47，XX(或XY） +21 5.2：遗传指导 5.2.1：如果核型为46，XX（或XY）则可以选择生产 5.2.2：如果产前诊断为21三体综合症，则建议终止妊娠 6．参考文献 6.1：医学遗传学第2版 案例版 6.2：医学形态学实验分册 6.3： 6.4：临床儿科杂志2001年第19卷第6期 教师评分及意见 评分： 对实验设计方案的意见： 签 名： 年 月 日