*CN102192960A*
(10)申请公布号 CN 102192960 A(43)申请公布日 2011.09.21
(12)发明专利申请
(21)申请号 201110032540.4(22)申请日 2011.01.24
(66)本国优先权数据
201010004942.9 2010.01.22 CN(71)申请人上海医药工业研究院
地址200040 上海市北京西路1320号申请人江苏正大天晴药业股份有限公司(72)发明人冯军 张喜全 薛春佳 赵伟
徐宏江 吴勇 马宇旋 路建光(51)Int.Cl.
G01N 30/06(2006.01)
权利要求书 1 页 说明书 6 页 附图 3 页
(54)发明名称
多黏菌素E甲磺酸钠的分析方法(57)摘要
本发明属于药物分析技术领域，具体涉及多黏菌素E甲磺酸钠的分析方法。本发明提供了一种操作简单、重现性好、灵敏度高、准确性强，易于标准化操作的多黏菌素E甲磺酸钠中各个组份的分析方法，即提供一种多黏菌素E甲磺酸钠的组份组成分析方法。该分析方法特征在于：采用酸化后高温水解的方法将多黏菌素E甲磺酸钠溶液转变为多黏菌素E溶液，然后以多黏菌素E的组分组成来表征多黏菌素E甲磺酸钠的组份组成。
CN 102192960 ACN 102192960 ACN 102192967 A
权 利 要 求 书
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1.一种多黏菌素E甲磺酸钠的组份分析方法，其特征在于：采用酸化后高温水解的方法将多黏菌素E甲磺酸钠溶液转变为多黏菌素E溶液，然后以多黏菌素E的组分组成来表征多黏菌素E甲磺酸钠的组份组成。
2.权利要求1所述的分析方法，具体包括如下步骤：(a)将多黏菌素E甲磺酸钠加水溶解，制成一定浓度的溶液；(b)采用酸化后高温水解的方法将多黏菌素E甲磺酸钠溶液转变为多黏菌素E溶液；(c)采用反相高效液相色谱分析多黏菌素E的组成；(d)以多黏菌素E的组分组成来表征多黏菌素E甲磺酸钠的组份组成。
3.权利要求2所述的分析方法，其中步骤(a)中制成的多粘菌素E甲磺酸钠浓度，以较适合随后的反相高效液相色谱分析分析浓度为宜，优选为0.005-5mg/ml，更优选为0.05-3mg/ml，最优选0.1-2mg/ml。
4.权利要求2、3所述的分析方法，其中步骤(b)中所使用的酸化、高温水解方法，是指用酸溶液，调节多粘菌素E甲磺酸钠溶液至酸性，使溶液的pH为1.0-3.5，优选pH为1.5-3.2，最优选pH为2.0-3.0，然后将酸化后的溶液置于高温环境中。
5.权利要求4所述的分析方法，其中酸溶液是无机酸或有机酸，优选为无机酸，更优选为盐酸、硫酸或磷酸，再优选为硫酸，最优选0.1-1mol/L的硫酸溶液。
6.权利要求2、3所述的分析方法，其中在高温环境中放置的时间在2个小时以内，优选为0.5-1小时。
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说 明 书
多黏菌素E甲磺酸钠的分析方法
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技术领域
[0001]
本发明属于药物分析技术领域，具体涉及多黏菌素E甲磺酸钠各组分含量的分析
方法。
背景技术
[0002] 多黏菌素E(colistin)是一个由多种组份组成的多肽类抗生素，主要由E1和E2组成(或称为A或B)。在20世纪50年代，多黏菌素E就应用于临床，主要用于革兰氏阴性菌引起的感染，特别是由多重耐药绿脓杆菌(P.aeruginosa)、鲍氏不动杆菌(Acinetobacter baumannii)等引起感染的治疗。临床使用的多黏菌素E有两种，一种是口服或局部使用的硫酸多黏菌素E(也称硫酸黏菌素)，另一种是供注射用的多黏菌素E甲磺酸钠(ColistimethateSodium)。这两种药物都是多组份药物，在硫酸多黏菌素E中，含有包括E1、E2、E3等至少5种组份(参见欧洲药典5.0)。同样，多黏菌素E甲磺酸钠也至少含有多黏菌素E1甲磺酸钠和多黏菌素E2甲磺酸钠等5种组份。[0003] 多黏菌素E的结构通式见式I
[0004]
[0005]
对于多黏菌素E的组份分析，在美国药典和欧洲药典都收录有HPLC法测定多黏菌
素E的各组份组成。不过遗憾的是，尽管多黏菌素E甲磺酸钠也被这些药典所收录，但是却
[0006]
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没有相应HPLC法来分析该产品中各组份的组成，仅仅是用硅钨酸显色法来控制多黏菌素E甲磺酸钠中不含有多黏菌素E。
[0007] Li Jian等报道了使用强碱阴离子交换HPLC分析多黏菌素E甲磺酸钠。(参见Li J，Milne RW，Nation RL，et al.Stability of Colistin and ColistinMethanesulfonate in Aqueous Media and Plasma as Determined byHigh-Performance Liquid Chromatography.ANTIMICROBIAL AGENTS ANDCHEMOTHERAPY；2003，47(4)：1364-1370.)虽然使用这种方法也分出7个色谱峰，但是并不能表征出这7个色谱峰分别是何种组份。同时，他们也报道了在水、磷酸盐溶液或者血浆中多黏菌素E甲磺酸钠能转化为多黏菌素E，但是并不能完全转化，用了72小时最高也只转化了79.6％。
[0008] Li Jian等也报道使用硫酸酸水解的方法把大鼠血浆中的多黏菌素E甲磺酸钠转化为多黏菌素E，再反相HPLC法测定多黏菌素E的组成。(参见Li J，MilneRW，Nation RL，et al.Simple Method for Assaying ColistinMethanesulfonate in Plasma and Urine Using High-Performance LiquidChromatography.ANTIMICROBIAL AGENTS AND CHEMOTHERAPY；2002，46(10)：3304-3307)这种方法仅局限在较低浓度的多黏菌素E甲磺酸钠(0.025mg/ml)并需要有血浆的存在才能转化，而且也没有证明能完全转化为多黏菌素E。
发明内容
[0009] 本发明的目的在于提供一种操作简单、重现性好、灵敏度高、准确性强，易于标准化操作的多黏菌素E甲磺酸钠中各个组份的分析方法，即提供一种多黏菌素E甲磺酸钠的组份组成分析方法。
[0010] 本发明提供的多黏菌素E甲磺酸钠的组份分析方法，其特征在于：采用酸化后高温水解的方法将多黏菌素E甲磺酸钠溶液转变为多黏菌素E溶液，然后以多黏菌素E的组分组成来表征多黏菌素E甲磺酸钠的组份组成。[0011] 本发明提供的组份分析方法，具体包括如下步骤：(a)将多黏菌素E甲磺酸钠加水溶解，制成一定浓度的溶液；(b)采用酸化后高温水解的方法将多黏菌素E甲磺酸钠溶液转变为多黏菌素E溶液；(c)采用反相高效液相色谱分析多黏菌素E的组成；(d)以多黏菌素E的组分组成来表征多黏菌素E甲磺酸钠的组份组成。[0012] 上述的组份分析方法中：步骤(a)中制成的多粘菌素E甲磺酸钠浓度，以较适合随后的反相高效液相色谱分析分析浓度为宜，优选为0.005-5mg/ml，更优选为0.05-3mg/ml，最优选0.1-2mg/ml。
[0013] 步骤(b)中所使用的酸化、高温水解方法，是指用酸溶液，调节多粘菌素E甲磺酸钠溶液至酸性，使溶液的pH为1.0-3.5，优选pH为1.5-3.2，最优选pH为2.0-3.0，然后将酸化后的溶液置于高温环境中。所述的酸溶液，可以是无机酸或有机酸，优选为无机酸，更优选为盐酸、硫酸或磷酸，再优选为硫酸，最优选0.1-1mol/L的硫酸溶液，如0.5mol/L的硫酸溶液。所述的高温优选温度在50-150℃，更优选为65-120℃，最优选为75-115℃。在高温环境中放置的时间在2个小时以内，优选为0.5-1小时。
[0014] 步骤(c)中采用反相高效液相色谱分析多黏菌素E的组成，所述的反相高效液相色谱分析为本领域技术人员所公知的方法，例如可以参照欧洲药典(5.0版)或美国药典
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(29版)所公布的多黏菌素E有关物质的HPLC分析方法，优选的使用欧洲药典公布的方法。[0015] 具体的分析方法也可以按照如下进行：[0016] 组分测定色谱条件：[0017] 仪器：Waters公司高效液相色谱仪(Waters 2489，紫外检测器，alliancee2695)[0018] 色谱柱：Waters XBridge C18(5μm，4.6×250mm)；流动相：硫酸钠溶液(取无水硫酸钠4.46g，加水900ml，用磷酸调节pH值至2.5，加水定容至1000ml，混匀)：乙腈(体积比为78∶22)；[0020] 检测波长选择：215nm；[0021] 流速：1.0ml/min；柱温：30℃；进样体积：20μl。
[0022] 步骤(d)中所述的以多黏菌素E的组分组成来表征多黏菌素E甲磺酸钠的组分组成是基于多黏菌素E甲磺酸钠可以完全转变为多粘菌素E，且多黏菌E在上述酸化和高温条件下稳定，同时多黏菌素E甲磺酸钠各组分之间不会相互转化。
[0023] 本发明提供了一种多黏菌素E甲磺酸钠中各个组分的含量分析方法，该方法巧妙的将多黏菌素E甲磺酸钠完全的转变为多黏菌素E，通过对多粘菌素E各个组分的含量分析得出多黏菌素E甲磺酸钠各个组分的含量。该方法具有如下的优点：(1)本发明提供的将多黏菌素E甲磺酸钠转变为多黏菌素E方案简单易行、便于标准化操作，在该转变条件下，多黏菌素E甲磺酸钠可以完全的转变为多黏菌素E且各个组分不会相互转化，而多黏菌素E在此条件下能保持稳定。(2)本发明采用了现有经过验证的高效液相分析方法来测定各个组分的含量，这样可以保证测试的结果真实有效。
[0019]
附图说明
[0024] 图1：硫酸多黏菌素E1 HPLC分析结果；[0025] 图2：硫酸多黏菌素E2 HPLC分析结果；[0026] 图3：硫酸多黏菌素E在室温条件下的HPLC分析结果；[0027] 图4：硫酸多黏菌素E酸化、高温条件下的HPLC分析结果；[0028] 图5：多黏菌素E甲磺酸钠在酸化和高温水解后的HPLC分析结果；[0029] 图6：多黏菌素E1甲磺酸钠在酸化和高温水解后的HPLC分析结果；[0030] 图7：多黏菌素E2甲磺酸钠在酸化和高温水解后的HPLC分析结果；具体实施方式
下面用具体实施例来进一步说明本发明的内容，但并不以任何方式意味着对本发明进行限制。
[0032] 实施例1：硫酸多黏菌素E的制备[0033] 称取工业级硫酸多黏菌素E适量，加水溶解，制成每1ml含100mg的溶液，上色谱柱分离，色谱条件如下：[0034] 层析填料：聚苯乙烯/二乙烯苯为骨架并键合苯基，型号为NM-100，产自苏州纳微生物科技有限公司[0035] 柱规格：45×400mm，[0036] 柱体积(CV)：635.9ml
[0031]
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流速：30.0ml/min[0038] 上样量：500ml[0039] 洗脱条件：[0040] 洗涤流动相：先用含8％乙醇的硫酸稀溶液(用0.05mol/L硫酸调溶液的pH值为2.4。)洗涤10CV。[0041] 洗脱液：再用含30％乙醇的硫酸稀溶液(用0.05mol/L硫酸调溶液的pH值为2.4。)洗脱10CV。收集洗脱液，减压蒸馏除去乙醇后，真空干燥得到33克硫酸多黏菌素E。[0042] 实施例2：硫酸多黏菌素E1和E2的制备[0043] 称取工业级硫酸多黏菌素E适量，加水溶解，制成每1ml含100mg的溶液，上色谱柱分离，色谱条件如下：[0044] 色谱柱：C18 SunFire Prep OBD(10μm)；19×150mm，购自美国WATERS公司[0045] 柱体积(CV)：42.5ml[0046] 流速：10.0ml/min[0047] 洗脱条件：用含30％的乙醇硫酸稀溶液(用0.05mol/L硫酸调溶液的pH值为2.3。)等度洗脱30CV。[0048] 上样量：50ml[0049] 收集：10ml/管
[0050] 收集样品的分析及处理：用分析型HPLC分析(色谱条件参见欧洲药典5.0中关于多黏菌素E的纯度测定)，分别合并纯度在95％以上多黏菌素E1和E2的组分，然后进行减压蒸馏除去乙醇后，低温冷冻干燥即得。
[0051] 结果得到的单组份1.5克硫酸多黏菌素E1，0.5克硫酸多黏菌素E2，它们的HPLC分析图见图1和图2。[0052] 实施例3：多黏菌素E甲磺酸钠的制备
[0053] 称取10.0g实施例1方法制备得到的硫酸多黏菌素E，加水溶解并定容至50ml，然后加甲醛溶液6.2ml，搅拌并用10mol/L NaOH溶液调节pH至7.0，维持反应30min后，向其中加入40％的亚硫酸氢钠溶液28ml，然后再用NaOH溶液调节pH至7，并在搅拌下反应10h后停止反应。取此反应液，用截流分子量为3000的超滤膜(为美国MILLIPORE公司的产品，为醋酸纤维素膜)超滤至约20ml，然后加水至约100ml，再超滤浓缩至20ml，如此反复5次，得超滤截留液约15ml。在整个反应和超滤期间控制温度在20～25℃。取超滤截留液，用低温冷冻干燥法，进行样品的干燥，得到多黏菌素E甲磺酸钠样品7.5g。[0054] 实施例4：多黏菌素E1甲磺酸钠的制备
[0055] 称取1.0g实施例2方法制备得到的硫酸多黏菌素E1，加水溶解并定容至5ml，然后加甲醛溶液0.5ml，搅拌并用1mol/L NaOH溶液调节pH至7.0，维持反应30min后，向其中加入40％的亚硫酸氢钠溶液2ml，然后再用NaOH溶液调节pH至7，并在搅拌下反应10h后停止反应。取此反应液，用截流分子量为3000的超滤膜(为美国MILLIPORE公司的产品，为醋酸纤维素膜)超滤至约3ml，然后加水至约20ml，再超滤浓缩至3ml，如此反复5次，得超滤截留液约5ml。在整个反应和超滤期间控制温度在20～25℃。取超滤截留液，用低温冷冻干燥法，进行样品的干燥，得到多黏菌素E1甲磺酸钠样品0.8g。[0056] 实施例5：多黏菌素E2甲磺酸钠的制备
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称取1.0g实施例2方法制备得到的硫酸多黏菌素E2(多黏菌素E2的含量为82％)，加水溶解并定容至5ml，然后加甲醛溶液0.5ml，搅拌并用1mol/L NaOH溶液调节pH至7.0，维持反应30min后，向其中加入40％的亚硫酸氢钠溶液2ml，然后再用NaOH溶液调节pH至7，并在搅拌下反应10h后停止反应。取此反应液，用截流分子量为3000的超滤膜(为美国MILLIPORE公司的产品，为醋酸纤维素膜)超滤至约3ml，然后加水至约20ml，再超滤浓缩至3ml，如此反复5次，得超滤截留液约5ml。在整个反应和超滤期间控制温度在20～25℃。取超滤截留液，用低温冷冻干燥法，进行样品的干燥，得到多黏菌素E2甲磺酸钠样品0.7g。
[0058] 实施例6：硫酸多黏菌素E稳定性条件摸索
[0059] 称取实施例1方法制备的硫酸多黏菌素E适量，加水溶解，制成每1ml含2mg多黏菌素E的溶液。分别取此溶液5ml，用0.5mol/L的硫酸溶液调节pH值为1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、。把这些不同pH值的多黏菌素E溶液，分别置于50℃、75℃、100℃、125℃、150℃、200℃的烤箱中，放置2小时，取出后用HPLC法测定含量变化。在上述条件作用后硫酸多黏菌素E含量仍大于等于95％即分解小于等于5％的测试条件认为稳定，反之认为该条件下硫酸多黏菌素E不稳定。
[0060]
试验结果表明：硫酸多黏菌素E在pH值1.0-3.5时，于50-150℃放置2小时均稳
定。典型HPLC分析层析图见附图3、4。[0062] 实施例7：多黏菌素E甲磺酸钠酸化和高温水解条件的摸索[0063] 称取实施例3方法制备的多黏菌素E甲磺酸钠适量，加水溶解，制成每1ml含1mg的溶液。分别取此溶液5ml，用0.5mol/L的硫酸溶液调节pH值为1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0。把这些不同pH值的溶液，分别置于50℃、75℃、100℃、125℃、150℃、200℃的烤箱中，放置2小时，取出后用HPLC法测定多黏菌素E甲磺酸钠转化为多黏菌素E的程度。在上述条件作用后多黏菌素E甲磺酸钠转化为多黏菌素E的转化率大于等于95％测试条件认为转化完全，反之认为该条件下转化不完全。
[0061]
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[0064]
试验结果表明：多黏菌素E甲磺酸钠在pH值1.0-3.5时，在50-150℃时能完全转化为多黏菌素E。
[0066] 多黏菌素E甲磺酸钠在酸化和高温水解后的典型HPLC图谱见附图5。[0067] 实施例8：多黏菌素E1甲磺酸钠酸化和高温水解实验[0068] 称取多黏菌素E1甲磺酸钠适量，加水溶解，制成每1ml含5mg的溶液。取此溶液5ml，用0.5mol/L的硫酸溶液调节pH值为2.0，然后加水稀释，并定容至10ml，制成2.5mg/ml的溶液。取此溶液于玻璃安瓿中，熔封后置于120℃烤箱中，放置30min，然后取出、放凉，用HPLC法测定多黏菌素E1甲磺酸钠转化为多黏菌素E1的程度。[0069] HPLC测定表明溶液中多黏菌素E1的浓度为1.67mg/ml，与完全转化为多黏菌素E1的理论值相符，这表明在该条件下多黏菌素E1甲磺酸钠能完全转化为多黏菌素E1。[0070] 多黏菌素E1甲磺酸钠在酸化和高温水解后的HPLC图谱见附图6。[0071] 实施例9：多黏菌素E2甲磺酸钠酸化和高温水解实验[0072] 称取多黏菌素E2甲磺酸钠适量，加水溶解，制成每1ml含5mg的溶液。取此溶液5ml，用0.5mol/L的硫酸溶液调节pH值为1.5，然后加水稀释，并定容至10ml，制成2.5mg/ml的溶液。取此溶液于玻璃安瓿中，熔封后置于115℃烤箱中，放置30min，然后取出、放凉，用HPLC法测定多黏菌素E2甲磺酸钠转化为多黏菌素E2的程度。[0073] HPLC测定表明溶液中多黏菌素E2的浓度为1.66mg/ml，与完全转化为多黏菌素E2的理论值相符，这表明在该条件下多黏菌素E2甲磺酸钠能完全转化为多黏菌素E2。[0074] 多黏菌素E2甲磺酸钠在酸化和高温水解后的HPLC图谱见附图7。
[0065]
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说 明 书 附 图
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说 明 书 附 图
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