科技视野 ２６ 钢橱广裔２０１０年第２３期 Ｓ ｉ ｎｎｄ Ｔｅ…ｈ Ｏｕｔ！ ，＾ 钙蛋臼酶系统及其与肉质关系的研究 崔岩 张 勇 近年来．人们对畜禽肉的品质要求越来越 高．而嫩度作为肉品质的重要指标之一．已越来 越引起人们的重视。酶处理法、机械处理法以及 电刺激法等嫩化方法得以广泛应用．并取得了一 定的效果．但是相关机制研究还需要进一步探 讨。随着生物技术和相关监测手段的发展。从分 子和细胞水平上对肉嫩度的形成和改善机制进 行研究已成为现实．研究发现．钙蛋白酶系统在 肉的嫩化、改善肉品质中起着重要的作用。本文 即对钙蛋白酶系统及其与肉质之间的关系作一 简要阐述 １钙蛋白酶系统 钙蛋白酶系统包括钙蛋白酶（ｃａｌｐａｉｎ）、钙蛋 白酶抑制蛋白（ｃａｌｐａｓｔａｔｉｎ）和钙蛋白酶激活蛋白 （ｃａｌｐａｉｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ）３部分，是高度可调的、且为依 赖Ｃａ２＋的蛋白质水解酶系统．３者之间相互作用， 对肌纤维生长发育进行影响，调节肌肉的嫩度。 其中钙蛋白酶是１９５４年由Ｇｕｒｏｆｆ首次发现的， １９７２年Ｂｕｓｃｈ等首先在骨骼肌中确认．１９８３年 Ｇｏｌｌ等提出钙蛋白酶在骨骼肌肌丝蛋白降解过 程中起关键作用 目前．已证明它广泛地分布于 绝大多数动物的细胞中。 １．１钙蛋白酶 钙蛋白酶是存在于所有脊椎动物细胞中的 一种钙激活中性半胱氨酸内肽酶．在肌原纤维 的Ｚ盘附近浓度最高。目前，在哺乳动物中已经 鉴定了１４个钙蛋白酶，广泛存在的有ｃａｌｐａｉｎ １ （ 一ｃａｌｐａｉｎ）、ｃａｌｐａｉｎ ２（ｍ－ｃａｌｐａｉｎ），还有ｃａｌｐａｉｎ ３ （ｐ９４）。前两者都是由两个亚基组成，分子量相 近．二者活化所需的Ｃａｚ＋浓度不同，但二者的生化 崔 岩：沈阳农业大学畜牧兽医学院。 张勇：单位同第一作者。 特性和催化性质几乎完全相同。 一ｃａｌｐａｉｎ活化所 需的Ｃａ２＋浓度为微摩尔级ｆ达到半最高活性需要 ５～６５ Ｉ．￣ｍｏｌ／Ｌ）．ｉｎ—ｃａｌｐａｉｎ活化所需的Ｃａ２＋浓度为 毫摩尔级（３００～１ Ｏ００ｐ￣ｍｏｌ／Ｌ）。由于细胞内Ｃａｚ＋的 波动在微摩尔浓度水平以下，所以认为 一ｃａｌｐａｌｎ 可能在正常生理条件下发挥功能．而ｍ—ｃａｌｐａｉｎ 则可能在细胞内钙超载等病理条件下被激活。对 这两种钙蛋白酶进行氨基酸组成及肽谱分析发 现，他们的小亚基相同，分子质量约３０ ｋｕ，由两 个结构域组成（ＤＶ和ＤⅥ）：而大亚基分子质量 约８Ｏ ｋｕ，是由４个结构域组成（Ｄ Ｉ、ＤⅡ、ＤⅢ、 ＤⅣ）， 一ｃａｌｐａｉｎ和ｍ—ｃａｌｐａｉｎ的大亚基６０％的氨 基酸残基相同．两种大亚基之间存在一定的免疫 交叉反应（Ｃｒｏａｌｌ和Ｄｅｍａｒｔｉｎｏ。１９９１）。ｐ９４是由 Ｓｏｒｉｍａｃｈｉ等首先发现的．也是钙蛋白酶组织特异 性存在的第一例．又称ｎ—ｃａｌｐａｉｎ．主要在骨骼肌 表达。少量存在于心肌和平滑肌．其结构与前两 种相似．只是多了３个插入序列，即ＮＳ、ＩＳ１和 ＩＳ２．其中ＮＳ序列由２Ｏ～３Ｏ个氨基酸组成．位于 第１域Ｎ末端．ＩＳ１和ＩＳ２序列分别位于第Ⅱ和 第Ⅲ域的Ｃ末端。 在一定浓度的Ｃａ２＋￣用下．钙蛋白酶主要作 用于细胞骨架蛋白、蛋白激酶和磷酸酶，还参与 细胞内的信号传递 １．２钙蛋白酶抑制蛋白 钙蛋白酶抑制蛋白是一种随机缠绕的卷曲 蛋白．是细胞内专一抑制钙蛋白酶活性的蛋白 质．分子质量约为１２０ ｋｕ，它可以识别钙蛋白酶 与钙结合引起的构象变化并与之特异性结合。钙 蛋白酶抑制蛋白由Ｎ末端引导序列（Ｌ区）和４ 个重复的抑制功能域Ｉ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ，共５个结构域 构成 每个抑制功能域含３个保守的亚域Ａ、Ｂ和 Ｃ。保守区Ｂ含有３０个氨基酸，其中，Ｔｈ －Ｉｌｅ－Ｐｒ０一 Ｘ—Ｔｖ卜Ａｒｇ组成的七肽序列十分保守，可能是钙蛋 广参２０１０年第２３期 ２７ 科技视野 Ｊ白酶抑制蛋白起抑制作用的关键部位：保守区Ａ 和Ｃ决定着钙蛋白酶抑制蛋白与钙蛋白酶中的 ＣａＭ类似结构域ＤⅣ和ＤⅥ的结合，Ｂ与钙蛋白 酶的ＤⅡ结构域结合。Ａ和Ｃ能够形成 一螺旋。 当钙蛋白酶被Ｃａ 激活后．如果附近有钙蛋 白酶抑制蛋白存在．钙蛋白酶抑制蛋白将与钙蛋 白酶特异结合而抑制其的活性．从而保证钙蛋白 酶对底物只进行局部特定位点的水解．产生大的 多肽片段．而不是把蛋白质分解成小肽或氨基 酸 钙蛋白酶抑制蛋白是通过抑制钙蛋白酶的自 溶作用而发挥作用的，且这种抑制作用不受ｐＨ 的影响。Ｃａｌｐａｉｎ—Ｃａｌｐａｓｔａｔｉｎ的相互作用是借助于 钙蛋白酶的Ｃａ２＋结合特性的．Ｃａｌｐａｉｎ—Ｃａ１．ｐａｓｔａｔｉｎ 的结合是可逆的．即在无Ｃａｚ＋时两者分离．钙鳌合 剂也可以破坏这种结合 １分子的钙蛋白酶抑制 蛋白可以抑制４个分子的ｉｎ一或 一Ｃａｌｐａｉｎ，但对 ｐ９４没有作用 １．３钙蛋白酶激活蛋白 钙蛋白酶激活蛋白是钙蛋白酶系统近２０年 新发展的一个成员．是细胞内存在的一个钙蛋白 酶调节因子。Ｇｅｏｒｇｅ等（１９８１）在从牛脑中分离 ＣａＭ（ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ，钙调素）时，首次发现一种相对 分子质量特别小（约２０ ｋｕ）的热稳定性蛋白质， 它能提高钙蛋白酶的水解速率约２５倍．但不改 变其对Ｃａ 的敏感度。随后Ｔａｋｅｙａｍａ等（１９８５）在 牛脑细胞骨架蛋白中也分离得到此激活蛋白．并 指出它可以激活 一ｃａｌｐａｉｎ和ＩＴｌ－ａａｌｐａｉｎ，其分子 量约为１５ ｋｕ。Ｍｅｌｌｏｎｉ等（１９９８）报道指出钙蛋白 酶激活蛋白的相对分子质量为３０ ｋｕ．其分子结 构为二聚体 Ｐｏｎｔｒｅｍｏｄｉ等自１９９８年以来对其进 行不断的深入研究，已经测得其氨基酸顺序．其 氨基酸顺序与羊肝脏蛋白ＵＫ１ １４几乎一样：与小 鼠ＨＲ１２蛋白很相似：与流感嗜血杆菌和枯草芽 孢杆菌获得的ＹＪＧＦ和ＹＡＢＧ两种热稳定蛋白有 很大相似点。常泓等（２００２）利用ＰＣＲ的方法．根 据已报道的ＵＫ１１４的ｃＤＮＡ序列克隆了钙蛋白 酶激活蛋白ｃＤＮＡ序列 钙蛋白酶激活蛋白可以明显提高钙蛋白酶 的活性，降低钙蛋白酶激活所需的Ｃａｚ＋浓度．减弱 钙蛋白酶抑制蛋白的抑制作用．提高钙蛋白酶对 膜的吸附性 从不同动物细胞中提取的激活蛋白 对钙蛋白酶的激活作用不同 Ｓ（ ｔ（ ｍ— （ｔ ７），ｃｔｉ… ｛（・ Ｏｕｔｌ（＇ｆ｝ Ｉ２钙蛋白酶系统与肉品质的关系 国内对钙蛋白酶系统的研究主要集中在人 类医学上．在动物营养上的研究较少。近些年有 研究表明．钙蛋白酶系统在促进动物肌肉生长、 提高瘦肉率、改善肌肉嫩度等方面作用显著，其 在改善动物肉品质方面的作用已开始被人们所 关注。 ２．１钙蛋白酶系统与肌肉生长的关系 试验发现．改变肌肉组织的生物学特性（如 肌纤维、胶原蛋白、脂肪和酶等）能影响肉品质， 尤其是肌纤维特性 肌肉的生长速度取决于３个 因素：肌细胞的数量、肌蛋白的合成速度和降解 速度 肌细胞的数量主要由其遗传性状，即胚胎 受肌蛋白的降解速度影响 骨骼肌蛋白降解速度 相对降低会导致骨骼肌生长速度的增加．也会提 高摄人营养物质的肌肉转化效率 肌原纤维蛋白是骨骼肌的主要蛋白质组成 成分．占成熟骨骼肌蛋白质总量的５０％～６０％。肌 蛋白降解的途径主要有３个：溶酶体组织蛋白酶 途径、钙蛋白酶途径和ＡＴＰ的蛋白质代谢途径。 哺乳动物的肌原纤维呈圆柱状．其直径和长度均 大于溶酶体或胞质蛋白酶的直径和长度．因此肌 原纤维无法进入溶酶体中．所以肌原纤维蛋白质 降解的第一步是肌原纤维降解装配成肌丝．这一 步骤可能是肌原纤维蛋白质降解过程中的限速 步骤。大量研究表明，钙蛋白酶系统参与这一过 程的调节．降解肌丝所需要的特殊剪切只能由钙 蛋白酶系统提供 骨骼肌钙蛋白酶存在于细胞内部．在Ｚ线中 浓度最高。体外试验表明，肌原纤维用纯 一ｃａｌ— ｐａｉｎ或ｍ—ｃａｌｐａｉｎ并在Ｃａ ＋存在的条件下培养．Ｚ 线完全消失．肌原纤维释放出肌丝．在钙蛋白酶 抑制剂存在下．释放出的肌丝比率下降 钙蛋白 酶引发肌原纤维蛋白质降解的可能机制如下：钙 蛋白酶使ｚ线（使细肌丝固着于肌原纤维）和肌 联蛋白、伴肌动蛋白（使粗肌丝和细肌丝固着于 肌原纤维）降解，肌原纤维释放出肌丝。细肌丝的 肌原蛋白和原肌球蛋白以及粗肌丝的Ｃ一蛋白降 解。粗肌丝和细肌丝分别解离出肌球蛋白和肌动 蛋白．释放出的粗肌丝和细肌丝可与母体或其他 肌原纤维重新装配，也可被胞质蛋白酶或溶酶体 组织蛋白酶降解成氨基酸：肌原纤维残余部分功 科技视野 ２８ 例纠广萄２０１０年第２３期 ＿Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｔｅ㈣ｈ。ｌ。毋，Ｏｕｔｌ。。ｋ 能完整，收缩力量减弱。通过钙蛋白酶系统可以 调节肌肉的发育，从而提高瘦肉率，改善肉品质。 Ｋｒｉｓｔｅｎｓｅｎ等研究指出．ｍ－ｃａｌｐａｉｎ涉及猪肉 类。Ｉｌｉａｎ等（２００１）和Ｐｒｉｎｇｌｅ等（１９９９）研究也表 明， 一ｃａｌｐａｉｎ活性与嫩度具有相关性。然而， Ｄｅｌｇａｄｏ等（２００１）研究发现．肉的嫩化与钙蛋白酶 抑制蛋白活性及降解速度有关，而与 一ｃａｌｐａｉｎ和 ｍ—ｃａｌｐａｉｎ的活性及降解速度没有明显的关系 张 生长。杨晓静等试验发现．对猪注射重组生长激 素后．背最长肌ｃａｌｐａｉｎ ３ ｍＲＮＡ的表达有上升趋 势，半腱肌中ｃａｌｐａｉｎ ３ ｍＲＮＡ的相对丰度显著上 升．在肌肉生长的过程中ｃａｌｐａｉｎ ３也可能参与蛋 增荣等通过 一ｃａｌｐａｉｎ基因多态性与鸡肉嫩度的 相关性研究表明， 一ｃａｌｐａｉｎ基因可以提高肌肉的 白质的降解 ２．２钙蛋白酶系统与肌肉嫩度的关系 肌肉嫩度是评价肉品质的重要指标之一．也 是越来越多消费者所关注的热点之一 影响肌肉 嫩度的主要因素有肌节的长度、结缔组织的含量 及肌肉结构蛋白的水解敏感性、ｐＨ值等。肌肉嫩 化是尸僵发生后一定时间内肌纤维破裂．肌肉重 新变软，嫩度增加的过程。Ｒａｍｉ等的试验证明，钙 蛋白酶系统是重要的蛋白质降解体系．在肉的成 熟嫩化过程中发挥着至关重要的作用 ２．２．１钙蛋白酶对肌肉嫩化的影响 动物活体内大部分Ｃａｚ＋贮存在肌浆网内．游 离的Ｃａ２＋浓度仅为０．２ ｐ，ｍｏｌ／Ｌ。但宰杀后体内 ＡＴＰ逐渐耗尽．肌浆网失去保留Ｃａ２＋的能力，使 Ｃａ２＋外泄．肌浆中Ｃａｚ＋的浓度升高，钙蛋白酶被激 活。Ｙｏｓｈｉｋａｗａ等（２０００）发现，Ｃａ２＋激活钙蛋白酶 后．大小亚基分离。小亚基可能主要起调节作用， 大亚基起催化调节作用 分离后３Ｏ ｋｕ的小亚基 迅速降解为１７ ｋｕ．这一变化可能是钙蛋白酶发 挥水解特性的前提。８０ ｋｕ的大亚基一般不具有 活性．当其先转化为７８ ｋｕ．再变为７６ ｋｕ的自溶 形式时方具有活性．且迅速降解而失去酶活性， 钙蛋白酶活性下降是其发挥水解作用的体现。当 钙蛋白酶变为自溶状态时被激活．便开始作用于 肌原纤维．此时肌纤维减少。自由氨基酸增多，肌 肉剪切力减小．肉的嫩度便会增加。试验中发现 钙蛋白酶缺乏必要的残基．说明钙蛋白酶的有些 功能不需要蛋白水解活性。但嫩化作用必需蛋白 水解活性 Ｓｕｚｕｋｉ等发现钙蛋白酶表达量的减少 以及钙蛋白酶抑制蛋白表达量的增加．都会导致 肌肉蛋白水解率及宰后肉嫩度的下降，这表明钙 蛋白酶水解作用是导致肉嫩化的主要因素。 Ｋｏｃ．ｈｍａｒａｉｅ等（１９９５）试验证实．肌肉在成熟 嫩化过程中．钙蛋白酶是唯一有关的蛋白酶水解 系统，后来又证实 一ｃａｌｐａｉｎ是肉嫩化的基本酶 密度，使鸡肉的剪切力减小．嫩度增加。因此究竟 是哪种酶与肉嫩度相关性最大还有待进一步研 究．目前最具有说服力的是钙蛋白酶抑制蛋白与 一ｃａｌｐａｉｎ的活性比值与嫩度具有最高相关性。 ２．２．２钙蛋白酶抑制蛋白对肌肉嫩化的影响 在活体中．钙蛋白酶抑制蛋白基因通过参与 肌肉生长过程中蛋白质的代谢更新来影响肌肉 的嫩度．而屠宰后是通过抑制钙蛋白酶的活性而 影响肌肉嫩度的。在猪的遗传育种研究中，钙蛋 白酶抑制蛋白基因被视为猪肉质性状的候选基 因．其抑制钙蛋白酶的大致过程为：钙蛋白酶抑 制蛋白的第Ⅱ到第Ｖ结构域中的Ａ和Ｃ保守区． 与钙蛋白酶的第Ⅳ和第Ⅵ结构域紧密结合。然后 Ｂ保守区与钙蛋白酶的第Ⅱ结构域结合而发挥作 用。Ｄｅｌｇａｄｏ等研究表明，牛、羊宰后其肉嫩化同 宰后钙蛋白酶抑制蛋白降解率有关。另外他们还 发现降解后的钙蛋白酶抑制蛋白同样具有抑制 钙蛋白酶活性的作用。以前对钙蛋白酶系统的研 究主要集中在钙蛋白酶抑制蛋白基因ｃＤＮＡ序 列克隆、部分内含子的酶切及其与肉质性状关系 等方面。近些年来，国内外学者的研究逐渐集中 于钙蛋白酶抑制蛋白多态性与肉质性状尤其是 嫩度的相关。 ３小结 肌肉嫩度是衡量肉品质的一个重要感官特 征．也是衡量其食用质量与商业价值的重要依 据 要想找到改善肌肉嫩度的方法，就要从根本 上了解调节肌肉嫩度的机制。钙蛋白酶系统是参 与宰后肉成熟嫩化过程的主要内源酶之一。可以 通过激活钙蛋白酶或者降低钙蛋白酶抑制蛋白 的活性来提高宰后肉的嫩度，改善肉品质。但是， 钙蛋白酶系统在肌肉嫩化过程中的具体调控机 制还不是很清楚．还需要利用分子生物学等先进 技术手段深入研究．为实际生产提供理论依据。●