维普资讯 http://www.cqvip.com 宁夏医学杂志２００８年４月第３０卷第４期ＮｉｎｇｘｉａＭｅｄ Ｊ，Ａｐｒ．２００８，Ｖｏｌ ３０，Ｎｏ．４ 文章编号：１００１—５９４９（２００８）０４—０２９８—０２ 一・论著・ 种磨损颗粒诱导的骨溶解模型的制作 张亮，陈志荣，吴兴临，金群华 ２０只ＢＡＬＢ／Ｃ小鼠随 探讨用磨损颗粒诱导小鼠颅骨发生骨溶解，建立骨溶解模型。方法［摘要］ 目的机分为两组，Ａ组为空白对照组，接受假手术；Ｂ组为钛颗粒骨溶解模型组，将钛颗粒置入小鼠颅顶骨，ｌ０天后取出 颅骨，进行病理学分析。结果ＨＥ染色中Ｂ组骨吸收明显增加，骨小梁结构紊乱及骨质疏松；计算颅骨正矢状线 骨破坏溶解面积Ａ组为（０．０７５±０．０１２）ｍｍ ，Ｂ组为（０．３７２±０．０ｌ１）ｍｍ ；ＴＲＡＰ染色中破骨细胞数目Ａ组为 （１０．１±１．１）个，Ｂ组为（３２．３±４．２）个。与Ａ组相比，Ｂ组可明显增加骨溶解（Ｐ＜０ ００１）及破骨细胞生成（Ｐ＜ ０．ＯＯ１），ＴＲＡＰ染色与ＨＥ染色结果相符。结论将钛颗粒置入小鼠颅顶骨建立骨吸收模型的方法，实验证实具有 可行性，町为人丁关节无菌性松动的研究提供实验基础。 ［关键词］ 磨损颗粒；骨溶解；动物模型 ［中图分类号］ Ｒ３３２ ［中图分类号］ Ａ Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｉｎｇ ｏｆ ａｎｉｍａＩ ｍｏｄｅＩ ｏｎ ｗｅａｒ ｄｅｂｒｉｓ—ｉｎｄｕｃｅｄ ｏｓｔｅｏｌｙｓｉｓ ＺＨＡＮＧ Ｌｉａｎｇ，ＣＨＥＮ Ｚｈｉ—ｒｏｎｇ， 凡ｇ—ｌｉｎ，ｅｔ ａ１．（Ｔｈｅ Ａｆｉｆｌｉａｔｅｄ Ｈｏｓｐ．ｏｆ Ｎｉｎｇｘｉａ Ｍｅｄ．Ｃｏｉｌ．，Ｙｉｎｃｈｕａｎ ７５０００４，Ｃｈｉｎａ） ［Ａｂｓｔｒａｃｔ］ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ ｗｅａｒ ｄｅｂｒｉｓ—ｉｎｄｕｃｅｄ ｏｓｔｅｏｌｙｓｉｓ ｉｎ ａｎｉｍａｌ ｍｏｄｅｌ ａｎｄ ｐｒｏｖｉｄｅ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｂａｓｅ ｉｎ ｔｈｅ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ａｓｅｐｔｉｃ ｌｏｏｓｅｎｉｎｇ ｏｆ ｐｒｏｓｔｈｅｓｉｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０ ＢＡＬＢ／Ｃ ｍｉｃｅ ｗｅｒｅ ａｌｌｏｃａｔｅｄ ｉｎｔｏ ２ ｇｒｏｕｐｓ：ｇｒｏｕｐ Ａ ｗａｓ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ ｒｅｃｅｉｖｅｄ ｓｈａｍ ｏｐｅｒａｔｉｏｎ；ｇｒｏｕｐ Ｂ ｗａｓ ｏｓｔｅｏｌｙｓｉｓ ｍｏｄｅｌ ｗｈｉｃｈ ｗｅｒｅ ｉｍｐｌａｎｔｅｄ Ｔｉ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｏｎｔｏ ｔｈｅ ｃｒａｎｉａｌ ｏｆ ｔｈｅ ｍｉｃｅ．Ｔｅｎ ｄａｙｓ ｌａｔｅｒ，ｍｉｃ，ｅ ｃａｌｖａｒｉａｅ ｗｅｒｅ ｈａｒｖｅｓｔｅｄ ｆｏｒ ｐａｔｈｏｌｏｇｙａｎａｌｙｓｉｓ．Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｉｎ ＨＥ，ｂｏｎｅ ｒｅｓｏｒｐｔｉｏｎ ｉｎ ｇｒｏｕｐ Ｂ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｏｂｖｉｏｕｓｌｙ ａｎｄ ｔｈｅ ．ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｂｏｎｅ ｔｒａｂｉｃｕｌａｒ ｓｈｏｗｅｄ ｄｉｓｔｕｒｂａｎｃｅ ａｎｄ ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓｉｓ．Ｍｉｄｄｌｅ ｓｕｔｕｒｅ ａｒｅａ ｉｎ ｇｒｏｕｐ Ａ ｗａｓ ０．０７５ｍｍ ±０．０１２ｍｍ ．ｇｒｏｕｐ Ｂ ｗａｓ ０．３７２ｍｍ ±０．０ｌ１ｍｍ ：ｉｎ ＴＲＡＰ，ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔ ｎｕｍｂｅｒｓ ｉｎ ｏｓｔｅｏｌｙｓｉｓ ａｒｅａ ｏｆ ｇｒｏｕｐ Ａ ｗｅｒｅ １０．１±１．１，ｇｒｏｕｐ Ｂ ｗｅｒｅ ３２．３±４．２． Ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ（ｇｒｏｕｐ Ａ），Ｔｉ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｓｉｇｎｉｉｆｃａｎｔｌｙ ｏｓｔｅｏｌｙｓｉｓ（Ｐ＜０．００１）ａｎｄ ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔｏｇｅｎｅｓｉｓ（Ｐ＜ ０．００１）．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔ ｏｆ ＴＲＡＰ ｗａｓ ｉｎ ａｇｒｅｅｍｅｎｔ ｗｉｔｈ ＨＥ ｓｔａｉｎ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｉｍａｌ ｍｏｄｅｌ ｂｙ ｉｍｐｌａｎｔａｔｉｎｇ Ｔｉ—ｄｅｂｒｉｓ ｏｎｔｏ ｔｈｅ ｃｒａｎｉａｌ ｏｆ ｔｈｅ ｍｏｕｃｅ ｉｓ ａ ｆｅａｓｉｂｌｅ ｍｅｔｈｏｄ．ｗｈｉｃｈ ｃａｎ ｐｒｏｖｉｄｅ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｂａｓｅ ｔｏ ｓｔｕｄｙ ｗｅａｒ ｄｅｂｒｉｓ—ｉｎｄｕｃｅｄ ｏｓｔｅｏｌｙｓｉｓ． ［Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ］ Ｗｅａｒ ｄｅｂｒｉｓ；Ｏｓｔｅｏｌｙｓｉｓ；Ａｎｉｍａｌ ｍｏｄｅ１ 人工关节置换是治疗终末期关节疾患的有效方 金属一金属假体是现在关节研究的热点，故选择钛 法，晚期关节假体周围的骨溶解及松动是影响其疗 颗粒具有很好的代表性。钛（Ｔｉ）颗粒形态不规则， 效的主要因素，有报道表明其术后２０年的松动率可 说明介绍平均直径２—５ ｍ，我们将样品送北京钢铁 达２０％ 。本实验采用将钛颗粒置人小鼠颅顶骨的 研究所复检，结果示颗粒直径范围０．５—６ ｍ， 方法，建立骨溶解模型，探讨其可行性，从而为人工 ９９．９９％＜６ ｍ。将颗粒悬于１８０℃恒温箱６小时， 关节无菌性松动的研究提供实验基础。 １材料及方法 ７０％乙醇浸泡４８小时后除去乙醇。再将颗粒用无 水乙醇浸泡过夜，沉淀４８小时后去除无水乙醇，干 １．１ 主要试剂及材料：钛金属颗粒（美国Ｚｉｍｍｅｒ公 燥后每３０ｍｇ分装，１５ｋｐａ高压蒸汽锅再次消毒３０分 钟，３７℃恒温箱烘干后备用。经此处理后根据商业 司提供），抗酒石酸酸性磷酸酶染色试剂盒（ＴＲＡＰ、 ３８７一Ａ，美国Ｓｉｇｍａ公司提供），ＢＡＬＢ／Ｃ小鼠由北京 检测试剂盒（厦门鲎试剂有限公司）检测，颗粒内毒 维通利华动物有限公司提供，使用德国ＬｅｉｃａＲＭ２１３５ 素小于０．２５Ｅｕ／ｍｌ。 切片机。 １．２ 方法 １．２．２体内骨吸收模型的制作：选用北京维通利华 动物有限公司的ＢＡＬＢ／Ｃ小鼠（４—６周、雌雄不分、 １．２．Ｉ磨损颗粒的检测及制备：实验用磨损颗粒采 均重１８ｇ）２０只。同一实验条件下随机分为两组，每 用钛颗粒。钛金属假体目前在临床中应用广泛，而 组ｌ０只，Ａ组为空白对照组，Ｂ组为钛颗粒模型组。 ［基金项目］教育部基金资助项目（２０６１６１） ［作者单位］宁夏医学院附属医院，宁夏银川７５０００４ ［作者简介］张亮，男（１９７５一），满族，主治医师，在读研究生，从事 人工关节研究。 将小鼠用６．５％水合氯醛按４０Ｏｒｅ＃ｋｇ剂量腹腔注射 麻醉，无菌条件下取颅顶正中矢状切口，长约０．８ｃｍ。 分离皮下组织，显露出１ｃｍ ｘ １ｅｍ颅骨正矢状线区 域。Ａ组行原位缝合，Ｂ组在颅顶正矢状线区域放置 ［通讯作者］金群华 维普资讯 http://www.cqvip.com 宁夏医学杂志２ｏｏ８年４月第３Ｏ卷第４期ＮｉｎｇｘｉａＭｅｄ Ｊ，Ａｏｒ．２ｏｏ８，Ｖｏｌ ３０，Ｎｏ．４ ３０ｍｇ钛（Ｔｉ）粒后缝合皮肤，防止颗粒外溢。小鼠清 映软组织对磨损颗粒的反应，可以容易地进行炎性 醒后放人笼中，置于清洁动物房中，动物自由摄取食 细胞因子的分析。但这个模型对于反映骨溶解破坏 物及水。第ｌ０天引颈处死小鼠，无菌条件下取出颅 不易做出定量测定，无法考虑骨自身的修复作用 。 顶骨。此项操作中要求取出的颅顶骨以正中矢状线 正常骨重建中破骨细胞性骨吸收与成骨性骨形成紧 为中心的方形区域，取出标本用ＰＢＳ液冲洗，１０％中 性甲醛固定，脱钙液脱钙３天后石蜡包埋。 密关联，是动态平衡的 。有研究表明，只有直径＜ １０１ｘｍ的金属颗粒才能被巨噬细胞吞噬并产生一系 １．２．３骨溶解的观察及计算：组织蜡块用德国Ｌｅｉ— 列的生物学效应，最终导致骨溶解及假体松动 。 ｃａＲＭ２１３５切片机切片，连续三层切片，层厚３．５ ｍ。 钛颗粒导致骨溶解和关节松动的机制，可能是颗粒 行常规ＨＥ染色，１０×、２０×及４０×条件下观察，４０× 刺激了假体周围细胞产生生物学效应造成局部生化 条件下摄像。图像用Ｍａｔｉｃ ｉｍａｇｅｓ２．０软件处理，计 算正中矢状线区域骨吸收溶解面积，结果用均数± 标准差表示。 １．２．４破骨细胞计数：抗酒石酸酸性磷酸酶染色 （ＴＲＡＰ）是破骨细胞的特异性染色。组织蜡块用德 国ＬｅｉｃａＲＭ２１３５切片机切片，连续三层切片，层厚 ３．５ ｍ。按说明书操作，将切片浸泡，避光３７ｃ【＝温箱 温育９０分，着色完全后移去反应液，脱水干燥后明 胶封片。Ｏｌｙｍｐｕｓ电子显微镜２０×、４０×及１００×条 件下观察，１００×条件下摄像计算正中矢状线区域的 ＴＲＡＰ＋细胞数量，结果用均数±标准差表示。 １．３统计学处理：所有数据采用ＳＰＳＳ１１．５统计软 件包进行单因素方差分析，检验水准为：Ｏｆ．＝０．０５， Ｐ＜０．０５为差异有显著意义。 ２结果 ２．１ ＨＥ及特殊染色：ＨＥ染色提示在置人钛颗粒 后，小鼠颅骨的结构较空白对照组均发生了明显的 变化。具体表现在颅顶骨的骨吸收明显增加，骨小 梁结构紊乱及骨质疏松，破骨细胞的形态变大。计 算颅骨正矢状线骨破坏溶解面积，Ａ组为（０．０７５± ０．０１２）ｍｍ ，Ｂ组为（０．３７２±０．０１１）ｍｍ 。Ｂ组的颅 骨正矢状线骨破坏溶解面积明显大于Ａ组，有显著 性差异（Ｐ＜０．００１，图１，见目录后）。 ２．２ ＴＲＡＰ染色：ＴＲＡＰ染色实验表明在置人钛颗粒 后的Ｂ组，破骨细胞数目均较空白对照组明显增加。 ＴＲＡＰ染色中破骨细胞数目，Ａ组为（１０．１±１．１）个， Ｂ组为（３２．３ ４－４．２）个。与Ａ组相比，Ｂ组可明显增 加破骨细胞生成，有显著性差异（Ｐ＜０．００１），其结 果也进一步印证了ＨＥ染色所见（图２，见目录后）。 ３讨论 寻找到一种合理有效的动物模型作为基础研究 的平台，成为研究工作的关键。既往研究磨损颗粒 对组织的反应多采用小鼠体内背部气囊模型，即在 小鼠的背部皮下注射无菌空气，形成一个皮下气囊 （ａｉｒ ｐｏｕｃｈ），将磨损颗粒注射到气囊中，可以诱发明 显的炎症反应。这个模型的优点是能够比较好地反 环境变化致骨代谢失衡。具体表现在钛颗粒引起巨 噬细胞活化，释放前炎症因子，增强破骨细胞的活 性，由活化的破骨细胞完成骨吸收。此外，钛颗粒使 局部组织的细胞浸润增强，浸润的单核细胞作为破 骨细胞的前体，进一步分化为破骨细胞 ’。 ，从而完 成骨吸收。本实验选用的钛颗粒直径２—５１ｘｍ，符合 生物学要求。实验中用小鼠颅骨溶解模型来定量评 价磨损颗粒诱发的骨溶解，通过ＨＥ及ＴＲＡＰ染色来 分析颅骨正中矢状缝区域骨破坏溶解面积及该区域 内ＴＲＡＰ阳性染色的破骨细胞数目变化。本研究表 明在钛颗粒诱导的小鼠骨溶解模型中，置人钛颗粒 后，经过ＨＥ、及ＴＲＡＰ等染色提示小鼠颅骨发生了明 显的骨溶解吸收表现，这与人体内磨损颗粒诱导的 骨溶解吸收表现相似。说明本实验模型的设计可 靠，结果合理，可信度高，克服了小鼠体内背部气囊 模型中不能定量反映骨溶解破坏的缺点。 ［参考文献］ ［１］Ｋｉｍ ＹＨ，Ｋｉｍ ＪＳ，Ｃｈｏ ＳＨ．１９９９ Ｐｒｉｍａｒｙ ｔｏｔａｌ ｈｉｐ ａｒｔｈｒｏｐｌａｓｔｙ ｗｉｔｈ ａ ｃｅｍｅｎｔｌｅｓｓ ｐｏｒｏｕｓ—ｃｏａｔｅｄ ａｎａｔｏｍｉｃ ｔｏｔｌａ ｈｉｐ ｐｒｏｓｔｈｅｓｉｓ：１０一ｔｏ１２一 ｙｅａｒ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ ａｎｄ ｃｏｎｓｅｃｕｔｉｖｅ ｓｅｒｉｅｓ［Ｊ］．Ａｒｔｈｒｏｐｌａｓｔｙ， １９９９，１４（５）：５３８—５４８． ［２］Ｒｅｎ Ｗ，Ｗｕ Ｂ，Ｐｅｎｇ Ｘ，ｅｔ ａ１．Ｅｒｙｔｈｒｏｍｙｃｉｎ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｗｅａｒ ｄｅｂｒｉｓ—ｉｎ． ｄｕｃｅｄ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｏｓｔｅｏｌｙｓｉｓ ｉｎ ａｍｕｒ／ｎｅｍｏｄｅｌ［Ｊ］．Ｊ Ｏｒｔｈｏｐ Ｒｅｓ， ２００６，２４（２）：２８０—２９０． ［３］Ｈａｒｒｙ Ｃ，Ｂｌａｉｒ，Ｌｉｓａ Ｊ．ｅｔａ１．Ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔ ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇｐａｔｈｗａｙｓ［Ｊ］．Ｂｉｏ． ｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，２００５，３２８（３）： ７２８—７３８． ［４］Ｄｉｐｔｅｎｄｕｓ Ｓ，Ｒａｋｓｈｉｔ ＰＨＤ，Ｋｈａｎｈ Ｌｙ，ｅｔ １ａ．Ｗｅｒａ ｄｅｂｒｉｓ Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎｔｉ一０ｓｔｅｏｃｌａｓｔｏｇｅｎｉｃ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｂｙ ＩＬ一６ Ａｎｄ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ— ［Ｊ］．ＪＢＪＳ，２００６，８８：７８８—７９９． ［５］Ｘｉｎｇ Ｌ，Ｂｕｓｈｎｅｌｌ Ｔ，Ｃａｒｌｓｏｎ Ｌ，ｅｔ １ａ．ＮＦ—Ｂ ｐ５Ｏ ａｎｄ ｐ５２ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｓ ｎｏｔ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ＲＡＮＫ—ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｂｕｔ ｉｓ ｅｓｓｅｎｔｉｌａ ｆｏｒ ＲＡＮＫ ａｎｄ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔｏｇｅｎｅｓｉｓ ［Ｊ］．Ｊ Ｂｏｎｅ Ｍｉ ｎｅｒ Ｒｅｓ，２００２，１７：１２００—１２１０． ［６］Ｖａａｎａｎｅｎ ＨＫ，Ｚｈａｏ Ｈ，Ｍｕｌａｒｉ Ｍ，ｅｔ ａ１．Ｔｈｅ ｃｅｌｌ ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｏｓｔｅｏ— ｃｌａｓｔ ｆｕｎｃｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｊ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ，２０００，１１３（２）：３７７—３８１． ［收稿日期］２００７—１１—１３ ［责任编辑］杨自革 维普资讯 http://www.cqvip.com ■麟筏熬蕊‰魏瀛㈥霾鑫羹黼蕊鬈醚g，#i10j。ijjjj0jjj。j誉jjjjj。。jjijij拳j譬jjjjjjojjj≥jjjjjLDPI天20％组e+疆EH翻_摧韬iAp140—组LDPl0天20％组+AB140—组Z田明匪翻翰匿鲺Ⅱ画雕潘f疆瞬融ll噩∞形态和d7nAChR阳性表达的影响鬻磐秽缨燃鬻震震鬻然躁辫熏濑懑鬻髑麟溷ll■■囊图1正常脊髓前角超微结构(×10HD00)藕图4干预后脊髓前角TuNEL染色(x400图2核膜内陷和凋亡小体(×5000)图3正常脊髓前角TuNEL染色(×400)隰鋈)图1对照组中c阳性染色细胞aspase一8图2实验组中ca阳性染色细胞，spase一8胞膜及胞浆无棕黄色染色细胞核出现棕色颗粒图1cD44V6在膀胱移行细胞图2MIⅧP_9在膀胱移行细胞图3对照组中caspase9图4实验组中ca。pase9阳性染色细胞阳性染色细胞胞膜及胞浆无棕黄色染色细胞核出现棕色颗粒一一，图3cD44v6在膀胱移行细胞癌中的中等强度表达f×1001图4MMP-9在膀胱移行细胞癌中的中等强度表达(×100)隆萝B组为钛颗粒模型组图1(HEx20)A组为空白对照组B组骨吸收明显增加骨小梁结构紊乱及骨质疏松；图中红线区为骨吸收破坏区其面积为骨吸收溶解面积，，，阚耀为空白对照组TRAP染色中破骨细胞数目A组为1042个B组破骨细胞生成明显增加图2(TRAP．图1右肾单纯性包膜下血肿，×20)A组B1±．组为钛颗粒模型组11个B组为32-3±．图2左肾盂输尿管连接部破裂Ct增强延时扫描显示造影剂外溢，图3左侧输尿管上段断裂尿液外溢形成巨，大尿液囊肿、。。