肉类研究 ＭＥＡＴ ＲＥＳＥＡＲＣＨ 中＿冉羹童ａ●音习ｒ竞中ＲＣＨＩＮＡＭＥＡＴ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＣＥＮＴＥＲ ＷＷＷ．ｃｍｒｃ．Ｃ０ｒｎ．ｃｎ ２０１０．５ 钙激活酶对肉嫩度的影响 黄镭，熊汉国 （华中农业大学食品科技学院，武汉４５００７０） 摘要：宰后肌肉嫩度的变化是在多种酶的协同作用下完成的，其中一个重要部分是钙激活酶。本 文主要论述了钙激活酶的分子结构特征，影响酶活性的因素、以及对肌肉嫩化的作用机理等方面的 内容。 关键词：钙激活酶；嫩度；分子结构 Ｒｏｌｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｃａｌｐａｉｎ ｉｎ Ｍｅａｔ Ｔｅｎｄｅｒｎｅｓｓ ＨＵＡＮＧ Ｌｅｉ，ＸＩＯＮＧ Ｈａｎｇｕｏ （Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆＦｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｈｕａｚｈｏｎｇ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｗｕｈａｎ ４３００７０，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ ｉｎ ｍｅａｔ ｔｅｎｄｅｒｎｅｓｓ ｄｕｒｉｎｇ ｐｏｓｔ ｓｔｏｒａｇｅ ｏｆ ｃａｒｃａｓｓｅｓ ｍａｉｎｌｙ ｃａｕｓｅｄ ｂｙ ｃａｌｐａｉｎ． Ｔｈｅ ｍａｉｎ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ ｔｈｉｓ ｐａｐｅｒ ｗｅｒｅ：ｔｈｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｃａｌｐａｉｎ，ｆａｃｔｏｒｓ ａｆｆｅｃｔｉｎｇ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ，ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｔｏ ｍｅａｔ ｔｅｎｄｅｍｅｓｓ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｃａｌｐａｉｎ；ｔｅｎｄｅｒｎｅｓｓ；ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ 中图分类号：ＴＳ２５１．４１ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００１－８１２３（２０１０）０５－００４７－０４ Ｏ引言 肉的嫩度（Ｔｅｎｄｅｒｎｅｓｓ）是一种综合感觉，是肌原 纤维蛋白和结缔组织蛋白物理及生化状态的反应，是 评价食用肉品质的重要指标之一，也是消费者十分重 视的感官特征（刘鹭和李洪军，２００１）。动物宰杀后，肌 肉发生僵硬，持续一定时间后，肉的硬度降低，逐渐 体。其中一个重要部分是钙激活酶对骨骼细胞和肌原 纤维蛋白的水解。 钙激活酶（Ｃａｌｐａｉｎ）是钙蛋白酶系统中的一个类 别，是存在于细胞质中的依赖于Ｃａ 的中性半胱氨酸 内肽酶。钙蛋白酶系统是高度可调的复杂系统，包括 钙激活酶、钙激活酶抑制蛋白和钙激活酶激活蛋白， 变得柔嫩多汁，具有较好的风味，适于加工食用。影 三者相互作用，共同调控宰后肉的嫩化（常泓和南庆 响肉嫩度的主要因素有肌原纤维节的长度、结缔组织 的含量和肌原纤维蛋白的降解程度（刘兴余和闫雪， ２００６）。目前研究表明宰后肌肉嫩度的变化是在多种 酶的协同作用下完成，随着肉的成熟，肉中的非蛋白 氮含量上升，于是认为肉嫩度的增加是内源蛋白酶所 贤，２００１）。钙蛋白酶系统对肌肉在成熟过程中的嫩 化起一定的调控作用，是肌原纤维蛋白降解的限速步 骤。本文将具体介绍钙激活酶的结构、功能以及其影 响肉嫩度的作用机理。 １ Ｃａｌｐａｉｎ的分子结构 Ｃａｌｐａｉｎ为巯基内切酶，根据钙激活中性蛋白酶 表现半最高活性所需的Ｃａ２＋浓度的不同，可以将钙激 致。而对肉嫩化有关的内源蛋白酶的研究一直是肉品 学科研究的热点之一。目前所发现的与肉嫩度有密切 关系的内源酶有三类：钙激活酶、组织蛋白酶和蛋白酶 收稿日期：２０１０－０５－０４ 活中性蛋白酶（Ｃａｌｐａｉｎ）分为两种： 作者简介：黄镭（１９８４一），女，内蒙古自治区人，主要从事食品安全检测研究。武汉通讯作者：熊汉国，男，博士，教授，从事食品安全检测与生物质材料研究多年。武汉华中农业大学，４５００７０ Ｅ－－ｒｔｋｌ，ｉｌ：Ｎ０５０９＠ｗｅｂｍｅｄ１．ｈｚａｕ．ｅｄｕ．ｃｎ 华中农业大学。 ２０１０耳第５期总第７ ３５期 钙蛋白酶Ｉ（ＣＡＰＮ Ｉ，又称－ｃａｌｐａｉｎ） 钙蛋白酶Ⅱ（ＣＡＰＮⅡ，又￣ｍ－ｃａｌｐａｉｎ）。 它们都由两个亚基组成，其中３０ｋＤｕ亚基在两种 ｃａｌｐａｉｎ中是相同的，是单个基因的产物，而８０ｋｕ大 ｐ—瑚ｌｐａｉｎ和ｍ＿＿（ａｌ田ｉｎ为同工酶，由＝Ｆ－ｍ－－￣ｆｌｍｉｎ 需要较高浓度Ｃａ 激活，而宰后肌肉很难达到较高的 Ｃａ 浓度，所以许多人认为 －ｃａｌｐａｉｎ在肉嫩化中起 更重要的作用。 亚基则是不同基因的产物（Ｋａｗａｓａｋｉ ｅｔ ａ１．，１９８６）。他 们催化作用的最适Ｐｈ都为７．５，但当以酪蛋白为第 五时，两者表现半最高活性所需的ＣａＨ浓度不 同， －ｃａｌｐａｉｎ所需的Ｃａ ２＋为１～２０ ｍｏｌ／Ｌ， 而ｍ－ｃａｌｐａｉｎ为２５０～７５０ ｍｏｌ／Ｌ（Ｃｒｏａｌｌ ａｎｄ Ｍａｒｔｉｎｏ，１９８４）。 分析克隆的ｃａｌｐａｉｎ ｃＤＮＡ序列发现其大亚基由 四个结构域组成（图Ａ）。其中结构域Ⅱ是表现水解活性 ２钙激活酶对肌肉嫩化的作用机理 肉类质地改善的根本原因是横纹肌肌原纤维小片 化，肌肉纤维丧失完整性，Ｚ盘的崩解是肌肉变嫩的 主要过程，它使得肌原纤维易于破碎，通常用肌原纤 维小片化指数（ＫＦＩ）来表示。科学家已经证明，Ｚ盘的 崩解主要是由于肌肉中蛋白水解酶作用的结果，尤其 是钙激活酶（张英君和陈有亮，２０００）。通过离体实验 证实钙激活酶能引起ｚ盘的崩解。钙激活酶对肌肉嫩 的关键部位，对其研究也最为深入，它约占大亚基氨 基酸残基数的３５％左右，其催化活性中心由Ｃｙｓｌ０５， Ｈｉｓ２６２和Ａｓｎ２８６Ｚ个氨基酸残基组成。结构域Ⅳ， 位于羧基端，占氨基酸残基数的２０％，是钙离子结合 部位。结构域Ⅲ，占氨基酸残基数的３５％，此结构域 很可能与抑制蛋白或激活蛋白的结合有关，起活性调 节作用；结构域Ｉ，位于氨基端，占氨基酸残基数的 １０％，与已知蛋白质的序列都不相同，当ｃａｌｐａｉｎ激活 后，结构域Ｉ会发生自溶，因此推测其可能起活性调 化作用主要是对肌肉细胞中的蛋白质分解作用。通过 上述分析，我们可以粗略地将钙激活酶在肉成熟中的 作用机理概括为钙激活酶水解了肌原纤维中起联接支 架作用的蛋白质，使细胞结构弱化，从而使肉嫩度提 高。 钙激活酶是一种中性蛋白酶，它存在于肌纤维Ｚ 盘附近及肌质网膜上。在动物被屠宰后，随着ＡＴＰ的 消耗，肌质网小泡体内积蓄的钙离子被释放出，激活 钙激活酶，分解肌原纤维蛋白促进了肉的嫩化。体内 节作用（Ｍｃｃｌｅｌｌａｎｄ ｅｔ ａ１．，１９８９）。小亚基由２６６个氨 基组成，含有两个结构域，两个结构域之间有一段富 含脯氨酸的序列连接（７１—８０个氨基酸残基）。结构域Ｖ 富含甘氨酸，主要由疏水性氨基酸组成，它很可能与 该酶的膜吸附特性有关。 ｌ ８０ ｋｕ Ⅱ 蛋白酶活性结构 Ⅲ Ⅳ 钙结合结构域 钙蛋白酶（ｃａｌｐａｉｎ）通过Ｃａ２＋激活及自溶而表现出蛋白 水解酶的活性，并通过钙蛋白酶抑素调节活性表达。 活体中Ｃａ 大部分贮存在肌浆网，游离的Ｃａ 浓度仅 为０．２ｍｍｏｌ／Ｌ，不能激活钙蛋白酶。但宰杀后，随着 尸体中ＡＴＰ逐渐耗尽，肌浆网失去保留Ｃａ 的能力， 所以Ｃａ抖外泄，当肌浆中Ｃａ 浓度最终达到０．２ｍｍｏｌ／ Ｌ时，钙蛋白酶被激活，大小亚基分离：８０ｋｕ的大亚 基先转化成７８ｋｕ再降解为７６ｋｕ的自溶形式ｌ ３０ｋｕｄ￣ 亚基迅速降解为１ ７ｋｕ而失去酶活性，发挥水解作用。 罔ＰＩＦＩ－烙钰 ｔ．＊１Ｕ１－Ｊ出－白酶活性 略作晶学挥 证椎田的 、Ｊ Ｕ Ｈ ｌｕ Ｌ ｌＩｒ／ｖ，＾Ｊ十／Ｊ、盯Ｉｒ，ＩＪ Ｈ Ｖ ＹＩ 钙结合结构域 （李兰会等， 在 年 。这是 一 的酶假说。同时 提出了钙理论。研究发现当不存 图Ａ ｃａｌｐ ｉ 的结构示意图 图Ｂ三维结构的预测图 尸僵条件下，肌肉的ｐＨ值为５・一・ ， 一 …训 一 －巍纛 ２ ……一… ｏ－ｖ 。Ⅵ瀚 。 。年第 期总第 期 黩 从Ｉ带延伸到Ａ带，起着使粗丝、细丝和Ｚ盘的牢因 连接的功能。Ｔａｙｌｏｒ等实验发现宰后肌肉在４０１２下存 解，但也不排除其它酶类对它们的降解。 ３．３化学因素 放７２ｈ，伴肌动蛋白几乎完全降解，部分肌联蛋白也 由分子量约为２６００－２８００ＫＤａ的Ｔ１型降解为分子量约 为１２００～２４００ＫＤａ的Ｔ２型。Ｔ２缺乏和Ｚ盘相边的Ｎ末 端，从而丧失了和Ｚ盘连接的功能。以上两种变化， 明显弱化了细丝和Ｚ盘的相互作用，促进了肌原纤维 Ｃａｌｐａｉｎ的激活需一定的Ｃａ 浓度，为使Ｃａｌｐａｉｎ 充分激活，可采用动脉注射或肌肉注射ＣａＣＩ 溶液的办 法提高肉中Ｃａ抖浓度，从而激活Ｃａｌｐａｉｎ｝／ｌ速肉的成熟 过程。很多学者的研究证明，向肌肉提供外源性ＣａＨ 是加速肉成熟的行之有效的途径之一。Ｚｎ 可以抑制 Ｃａｌｐａｉｎ活性，离体实验发现，５０ ｍｏｌ／Ｌ的ＺｎＣｌ２对 小片化指数（ＭＦＩ）的增加，从而有助于提高肉的嫩度 （Ｋｏｏｈｍａｒａｍ，１９９０）。 Ｃａｌｐａｉｎ的抑制率为１００％，但Ｚｎ 对Ｃａｌｐａｉｎ的抑制具 有可逆性，当采用透析法除去Ｚｎ 后，Ｃａｌｐａｉｎ可恢 复原来活性。对牛胴体注射５０ ｍｏｌ／Ｌ胴体重１０％的 ＺｎＣ１ 溶液，会停滞嫩化过程。ＥＧＴＡ、ＥＤＴＡ等螯合 剂由于结合了Ｃａ２＋对Ｃａｌｐａｉｎ有抑制作用，而巯基乙醇 等巯基实际对Ｃａｌｐａｉｎ有保护作用（黄明等，１９９９）。 细胞支架蛋白（Ｃｏｇｔｎｍｅｒｅｓ）、肌间蛋白（ｄｅｓｍｉｎ） 和丝蛋白（ｉｆｌａｍｉｎ）的降解 细胞支架蛋白起着连接肌原纤维和肌膜的作用。 在骨骼肌肌细胞中，位于肌膜附近的肌原纤维在每一 Ｉ带水平上都有细胞支架蛋白结构。细胞支架蛋白起 着稳定肌细胞结构的功能。Ｔａｙｌｏｒ等通过电镜发现在 ４０１２下存放的牛股二头肌（ＢＦ）和半膜肌（ＳＭ）的肌纤维 中细胞支架蛋白在２４ｈ内部分已被破坏，７２ｈ￣Ｉ完全被 破坏（Ｒｉｃｈａｒｄ ｅｔ ａ１．，１９９５）。肌原纤维间连接蛋 白有肌间蛋白和丝蛋白，起着固定肌原纤维，保持整 个肌细胞内肌原纤维排列的有序性等作用，而肌间蛋 白和丝蛋白也会被ｃａｌｐａｉｎ￣快降解，使肌原纤维的有 序结构受到破坏，对细胞支架蛋白结构的破坏和对肌 ３．４高压 从１９７３年以来，很多学者报道了高压有利于提高 肉的嫩度，但关于高压对肉的嫩化机理还很不完善。实 验发现，高压可以瞬间提高肌浆中Ｃａ 浓度，这些Ｃａ 可能来源于肌浆网和线粒体，从而激活了Ｃａｌｐａｉｎ，加 速了肉的成熟。 ４展望 钙激活蛋白酶在肉成熟嫩化中是重要的内源蛋白 酶之一，对其进行深入的研究并发现其作用规律是形 间蛋白、丝蛋白的降解明显有利于肉嫩度的增加。 肌钙蛋白Ｔｍｐｏｒｔｉｎ的降解 Ｔｒｏｐｏｎｉｎ由三个亚基构成，即钙结合亚基ＴｎＣ、 成内源蛋白酶嫩化理论的主要内容。而此理论对我们 提高肉的品质有重要的指导意义。（１）钙激活蛋白酶在 肉中含量因品种而异，所以可以优化品种；（２）可以预 测宰后肌肉成熟状况、嫩度变化和肉的品质；（３）可 以改进肉制品加工工艺，提高肉的品质。所以对钙 抑制亚基ＴｎＩ和原肌球蛋白结合亚基ＴｎＴ，其中ＴｎＴ分 子量为３０５００－３７０００，能结合原肌球蛋白，起联结作 用。ＴｎＴ的降解弱化了细丝结构，有利于肉嫩度的提 高（苏永杰等，２００６）。 激活蛋白酶的研究有助于肉品加工业的发展。虽然 很多实验研究已经证明钙蛋白酶是引起肌肉中蛋白 质水解，导致宰后肌肉嫩化的主要原因。但是由于 目前的研究主要限于体外实验，其真正的机理还不 很清楚，而且也还有部分研究结果与酶假说机制的 部分结论相反。可见关于肌肉宰后嫩化机理还有必 要进行更深入的研究。 ３影响Ｃａｌｐａｉｎ活性的因素 ３．１温度与ｐＨ值 Ｃａｌｐａｉｎ有很宽的ｐＨ和温度作用范围，其最佳 ｐＨ为７．５，即使在５℃，ｐＨ分别为５．５和５．８的条件 下，Ｃａｌｐａｉｎ还分别具有２５℃，ｐＨ７．５时活力的２４％和 ２８％。科学家也证实了在４１２，ｐＨ５．６，ＩＯＯｍＭＣａＣＩ， 溶液中Ｌ－Ｃａｌｐａｉｎ对ｔｉｔｉｎ ｎｅｂｕｌｉｎ ｆｉｌａｍｉｎ ｄｅｓｍｉｎ ＴｎＴ还具有很强的水解活性（廖洪波等，２００３）。 ３．２ Ｃａ￣ｐａｉｎ及Ｃａｌｐａｓｔａｔｉｎ的降解 参考文献 Ｉ１１ 常泓，南庆贤．】钙激活酶激活蛋白初探Ｄ】．￣２００１，８＂．２４． 『２】黄明，罗欣．内源蛋白酶在肉嫩化中的应用Ｕ】．肉 类研究，１９９９（２）：９—１１，１４． 通过对肉中Ｃａｌｐａｉｎ及Ｃａｌｐａｓｔａｔｉｎ的研究发现， 在肉成熟过程中ｕ—Ｃａｌｐａｉｎ和Ｃａｌｐａｓｔａｔｉｎ的活性逐 渐降低，而ｍ－Ｃａｌｐａｉｎ的活性则几乎没有变化。由于 —【３１李兰会，张志胜，孙丰梅等．钙蛋白酶嫩化肉类机 理Ｕ】．生命的化学，２００３，２３（３）：２１２—２１４． Ｃａｌｐａｉｎ所需Ｃａ 浓度较低，动物宰后，肌浆网失 去了Ｃａ２＋泵作用，其中的贮钙蛋白大量释放Ｃａ２＋于肌 １４１廖洪波，明建，贺稚非，李洪军．钙蛋白酶和肉的 成熟嫩化Ⅱ】．肉类＿ｘ－￣ｋ，２００３，８（２６８）：２７—２９． 浆中，激活了ｕ－Ｃａｌｐａｉｎ，被激活的－Ｃａｌｐａｉｎ除水 解其它蛋白外，很可能发生自溶及对Ｃａｌｐａｓｔａｔｉｎ的降 ２０１０耳第５期总第１ ３５期 【５】刘兴余，闫雪钙蛋白酶系统及其对肉嫩度的影响 Ｂｏｌｃｈｉｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ａｃｔａ．１９８４，７８８：３４８—３５５． Ｕ］．食品研究与开发，２００６，１（２７）：８７—８９． 【６】 刘鹭，李洪军．肉类嫩滑方法及技术研究进展．肉 类工业，２００１，１ １：４０—４２． ：【１２】Ｋａｗａｓａｋｉ Ｈ．，Ｉｍａｊｌｈ ｓ．，Ｋａｗａｓｈｉｍａ ｓ．，Ｈａｙａｓｈｉ Ｈ．ａｎｄ Ｓｕｚｕｋｉ Ｋ．Ｔｈｅ ｓｍａｌｌ ｓｕｂｕｎｉｔｓ Ｉｆ ｃａｌｃｉｕｍ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐｒｏｔｅａｓｅｓ ｗｉｔｈ ｄｉｆｅｒｅｎｔ ｃ￣ｄｕｍ ｓｅｎｓｉｉｔｖｉｉｔｅｓ ａｒｅ ｉｄｅｎｔｉｃａ１． 【７】 苏永杰，梁梓，郑玉才．钙蛋白酶在肉嫩化中的作 用及其活性测定Ｕ】．西南民族大学学报，自然科 学版．２００６，３２（３）：５６４—５６５． ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．１９８６，９９：１５２５—１５３２． 【１３】Ｋｏｏｈｍａｒａｉｅ Ｍ．Ｑｕａｎｔｉｉｆｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃａ２＋ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐｒｏｔｅａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｂｙ ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ ａｎｄ ｉｏｎ——ｅｘｃｈａｎｇｅ 【８】汤晓燕，周光宏，徐幸莲，等．钙离子溶液浸泡处 理对牛肉肌原纤维的影响Ｕ】．南京农业大学学报， ２００４，２７（３）：９５—９８． ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙＩＪ１．Ｊ．Ａｎｉｍ．Ｓｃｉ，１９９０，６８：６５９—６６５． 【１ ４】ＭＣ ｃｌ ｅ１１ａｎｄ Ｐ．，Ｌ ａ ｓｈ Ｊ．Ａ．ａｎｄ Ｈａｔｈａｗａｙ Ｄ．Ｒ．Ｉｄｅｎｔｉｉｆｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｍａｊｏｒ ａｕｔｏｌｙｔｉｃ ｃｌｅａｖａｇｅ ｓｉｔｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｓｕｂｕｎｉｔ ｏｆ ｖａｓｃｕｌａｒ ＩＩ．Ａ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ｏｆ ｐａｒｔｉａｌ ａｍｉｎｏ——ｔｅｒｍｉｎａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ 【９】张英君，陈有亮．钙激活蛋白酶在肉成熟中的作用 机理Ｕ］．肉类工业，２０００，８（２３０）：３１—３５． 【１０】ＡｒｔｈｕｒＪ Ｓ Ｃ，Ｇａｕｔｈｉｅｒ Ｓ，ＥｌｃｅＪ Ｓ．Ａｃｔｉｖｅ ｓｉｔｅ ｒｅｓｉｄｕｅｓ ｉｎ ｍ—ｃａ１ｐａｉｎ：Ｉｄｅｎｔｉ６ｃａｔｉｏｎ ｂｙ ｓｉｔｅ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ． ｔｏ ｄｅｄｕｃｅｄ ｆｒｏｍ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ＤＮＡ３ｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｙ．１９８９，ｒ２６４：１７４２８—１７４３１． ＦＥＢＳＬｅｔｔ，１９９５，３６８（１３）：３９７～４００． 【１５】Ｒｉｃｈａｒｄ Ｇ，Ｔａｙｌｏｒ Ｈ，Ｇｅｅｒｔ Ｇ，ｅｔ ａ１．Ｉｓ Ｚ—ｄｉｓｋ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｒｅｓｐｏｎｓｉｂｌｅ ｆｏｒ ｐｏｓｔｍｏｒｔｅｍ ｔｅｎｄｅｒｉｚａｔｉｏｎ 【１ １】Ｃｒｏａｌｌ Ｄ．Ｅ．ａｎｄ ＤｅＭａｒｔｉｎｏ Ｇ．Ｎ．Ｃｏｍｐａｒｉｓｉｏｎ ｏｆ ｔｗｏ ｃａｌｃｉｕｍｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ ｆｒｏｍ ｂｏｖｉｎｅ ｈｅａｒｔ． Ｊ Ａｎｉ Ｓｃｉ，１９９５，７３：１３５１—１３６７．