产抑菌活性物质菌株的筛选及其抑菌机理的研究

现代食品科技　Ｍｏｄｅｒｎ　Ｆｏｏｄ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　２０１６，Ｖｏ１．３２，Ｎｏ．１２　产抑菌活性物质菌株的筛选及其抑菌机理的研究　王文婧　，殷文政　，冀昌龙　（１．内蒙古农业大学食品科学与工程学院，内蒙古呼和浩特０１　００１　８）　（２．锡林郭勒盟疾病预防控制中心，内蒙古锡林浩特０２６０００）　摘要：从内蒙古锡林郭勒盟地区酸马奶酒中分离出的９株乳酸菌和５株酵母茵中筛ｉ　叩茵效果较好的菌株，并对其发酵液的抑　菌机理进行研究。以金黄色葡萄球菌、肠炎沙门氏菌肠亚种和荧光假单胞菌作为指示菌，通过牛津杯琼脂扩散密￣师Ｊｒ￣－选出乳酸茵Ｅｌ３　和Ｄ６与酵母菌Ｊ１０Ａ１的共生发酵液具有较强的抑菌能力，比乳酸菌单独发酵抑菌效果分别增加２．４８　ｍｍ和１．４５　ｍｍ　两株乳酸菌产　生的抑茵活性物质使沙门氏菌生长曲线延滞期延长，对数期缩短，对数期峰值降低；电解质、可溶性总糖外渗，导致菌液电导率和可　溶性总糖含量增加；糖吸收利用能力下降，磷代谢先变缓慢，随后趋于平稳。Ｅｌ３产生的抑茵活性物质的抑菌性更强。结果表明，乳　酸菌产生的抑菌活性物质，不仅破坏细菌的细胞壁和细胞膜结构，还会影响菌体细胞代谢，导致细菌无法进行正常的生长和繁殖，从　而发挥寸叩菌作用。　关键词：酸马奶；乳酸菌；酵母菌；混合发酵；抗菌剂　文章篇号：１６７３—９０７８（２０１６）１２—１５１—１５７　ＤＯＩ：１０．１３９８２／ｊ．ｍｆｓｔ．１６７３－９０７８．２０１６．１２．０２４　Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ　ｏｆＡｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ　Ａｃｔｉｖｅ　Ｓｕｂｓｔａｎｃｅ－－ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ　Ｓｔｒａｉｎｓ　ａｎｄ　Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ　Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ　ＷＡＮＧ　Ｗｅｎｑｉｎｇ　，ＹＩＮ　Ｗｅｎ－ｚｈｅｎｇ　，ＪＩ　Ｃｈａｎｇ－ｌｏｎｇ　（１．Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆＦｏｏｄＳｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ＩｎｎｅｒＭｏｎｇｏｌｉａＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈｏｈｈｏｔ０１００１８，Ｃｈｉｎａ）　（２．Ｘｉｌｉｎ　Ｇｏｌ　Ｌｅａｇｕｅ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｄｉｓｅａｓｅ　Ｃｏｎ￣ｏＩ　ａｎｄ　Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ，Ｘｉｌｉｎｈｏｔ　０２６０００，Ｃｈｉｎａ１　Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ａ　ｔｏｔａｌ　ｏｆ　ｎｉｎｅ　ｓｔｒａｉｎｓ　ｏｆ　ｌａｃｔｉｃ　ａｃｉｄ　ｂａｃｔｅｒｉａ　ａｎｄ　ｆｉｖｅ　ｙｅａｓｔ　ｓｒｔａｉｎｓ　ｉｓｏｌａｔｅｄ　ｆｒｏｍ　ｋｏｕｍｉｓｓ　ｆｒｏｍ　Ｘｉｌｉｎ　Ｇｏｌ　Ｌｅａｇｕｅ，Ｉｎｎｅｒ　Ｍｏｎｇｏｌｉａ，ａｎｄ　ｓｔｒａｉｎｓ　ｗｉｔｈ　ｈｉｇｈｅｒ　ｎａｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ　ｃａｐａｃｉｔｙ　ｗｅｒｅ　ｓｃｒｅｅｎｅｄ，ａｎｄ　ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ　ｍｅｃｈａｎｉｓｍ　ｏｆ　ｈｔｅｉｒ　ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ　ｂｒｏｔｈ　ｗａｓ　ｓｔｕｄｉｅｄ．　Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ，Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｅｎｔｅｒｉｃａ　ｓｕｂｓｐ．Ｅｎｔｅｒｉｃ，ａｎｄ　Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｌｆｕｏｒｅｓｃｅｎｓ　ｗｅｒｅ　ｕｓｅｄ　ａｓ　ｉｎｄｉｃａｔｏｒｓ，ｗｈｉｌｅ　ＣＯ—ｆｅｍｒｅｎｔａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　Ｄ６　ａｎｄ　Ｅｌ３　ｗｉｍ　ｙｅａｓｔ　Ｊ１０Ａ１　ｗａｓ　ｐｅｒｆｏｒｍｅｄ　ｕｓｉｎｇ　ｏｘｆｏ￣ｃｕｐ　ａｇａｒ　ｄｉｆｕｓｉｏｎ　ｍｅ￣ｏｄ．Ｔｈｅ　ｎａｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｓｕ　Ｄ６　ａｎｄ　Ｅｌ３　ｅｘｃｅｅｄｅｄ　ｔｈａｔ　ｏｆ　ｌａｃｔｉｃ　ａｃｉｄ　ｂａｃｔｅｒｉａ　ｂｙ　２．４８　ｍｒｆｌ　ａｎｄ　１．４５　ｍｍ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｔｈｅ　ｎａｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ　ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ　ｐｒｏｄｕｃｅｄ　ｂｙ　ｓＷａｉｎｓ　Ｄ６　ａｎｄＥｌ３　ａｆｆｅｃｔｅｄＳａｌｍｏｎｅｌｌａｔｏ　ａｌａｒｇｅ　ｅｘｔｅｎｔ．Ｔｈｅｌａｇｐｈａｓｅ　ｏｆＳａｌｍｏｎｅｌｌａｇｒｏｗｔｈ　ｃｕｒｖｅｗａｓｄｅｌａｙｅｄａｎｄｉｔｓｌｏｇａｒｉｔｈｍｉｃ　ｐｈａｓｅｗａｓ　ｓｈｏｒｔｅｎｅｄ　ｗｉｈｔ　ｌｏｇａｒｉｔｈｍｉｃ　ｐｅａｋ　ｂｅｉｎｇ　ｒｅｄｕｃｅｄ．１ｎｔｒａｃｅｌｌｕｌｒａ　ｔｏｔａｌ　ｓｏｌｕｂｌｅ　ｓｕｇａｒｓ　ｎａｄ　ｅｌｅｃｔｒｏｌｙｔｅｓ　ｗｅｒｅ　ｐｕｒｇｅｄ，ｌｅａｄｉｎｇ　ｔｏ　ｎａ　ｉｎｃｒｅａｓｅ　ｉｎ　ｌｉｑｕｉｄ　ｃｏｎｄｕｃｔｉｖｉｔｙ　ｎａｄ　ｃｏｎｔｅｎｔ　ｏｆ　ｔｏｔａｌ　ｓｏｌｕｂｌｅ　ｓｕｇａｒｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ．Ｓｕｇａｒ　ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ　ｃａｐａｃｉｙｔ　ｗａｓ　ｄｅｃｒｅａｓｅｄ　ａｎｄ　ｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓ　ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ　ｗａｓ　ｒｅｄｕｃｅｄ　ｔｏ　ａ　ｃｏｎｓｔａｎｔ　ｖａｌｕｅ．Ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ　ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ　ｐｒｏｄｕｃｅｄ　ｂｙ　Ｅｌ３　ｓｈｏｗｅｄ　ａ　ｓｔｒｏｎｇｅｒ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ　ａｃｔｉｏｎ．Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｎａｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ　ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ　ｐｒｏｄｕｃｅｄ　ｂｙ　ｌａｃｔｉｃ　ａｃｉｄ　ｂａｃｔｅｒｉａ　ｎｏｔ　ｏｎｌｙ　ｄｅｓｔｒｏｙ　ｔｈｅ　ｃｅｌｌ　ｗａｌｌ　ａｎｄ　ｃｅｌｌ　ｍｅｍｂｒａｎｅ，ｂｕｔ　ａｌｓｏ　ａｆｆｅｃｔ　ｈｔｅ　ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ　ｏｆ　ｂａｃｔｅｒｉａ，ｅｘｅｒｔｉｎｇ　ａｌｌ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ　ｅｆｆｅｃｔ　ｂｙ　ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ　ｎｏｒｍａｌ　ｇｒｏｗｔｈ　ａｎｄ　ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆｔｈｅ　ｂａｃｔｅｒｉａ．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ｋｏｕｍｉｓｓ；ｌａｃｔｉｃ　ａｃｉｄ　ｂａｃｔｅｒｉａ；ｙｅａｓｔ；ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ；ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ　ａｇｅｎｔｓ　酸马奶，又称马奶酒（ｋｏｕｍｉｓｓ），是以鲜马奶为原　，ｊ】。乳酸菌可以产生有机酸、细菌素、过氧化氢和双　料，经乳酸菌和酵母菌共同发酵而成的一种乳酸一酒　乙酰等多种天然抑菌物质ｌ４１。细菌素（ｂａｃｔｅｒｉｏｃｉｎ）是某　精发酵乳饮料【ｌ　Ｊ。鲜马奶经微生物发酵剂发酵后，可　些细菌在代谢过程中通过核糖体合成的一类具有抑菌　以形成抑制传染性疾病如肺结核和非传染性疾病如胃　活性的蛋白质或多肽，能抑制食品中的多数腐败菌和　肠炎的生物活性物质，营养成分比鲜马奶有所提高　致病菌的生长繁殖ｌ５Ｉ６Ｊ。Ｉｓｈｉｉ等【７】研究发现：　收稿日期：２０１５－１２－３１　Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓｌａｃｔｉｓ和Ｋｌｕｙｖｅｍｍｙｃｅｓ　ｍａｒｘｉａＦｌ￣ｌＳ混合培养　基金项目：内蒙古自然科学基金项目（２０１４１￣１Ｓ０３５９）　过程中酵母菌可以不断中和代谢产物中的乳酸，从而　作者简介：王文婧（１９８９一），女，硕士，研究方向：食品微生物　降低乳酸对乳酸菌生长的抑制，使得产物Ｎｉｓｉｎ不断　通讯作者：殷文政（１９５９一），男，教授。研究方向：食品微生物　富集　引。　１５１　现代食品科技　Ｍｏｄｅｒｎ　Ｆｏｏｄ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　２０１６，Ｖｏ１．３２，Ｎｏ．１２　抑菌机理（Ｍｏｄｅ　ｏｆＡｃｔｉｏｎ）是指杀菌剂通过影响　靶标菌的某些生理生化过程导致菌体生长受到抑制或　是死亡。关于抗菌物质抑菌机理的报道有很多，一般　认为抑菌剂的主要作用途径是膜攻击、抑制细胞呼吸　或者抑制蛋白质的合成等［９１。目前己知Ｎｉｓｉｎ的抑菌机　理是作用于细胞壁，阻止细胞壁中肽聚糖的合成，从　而使细胞壁质膜与磷脂化的合成不能正常进行，导致　细胞内的物质和一些三磷酸腺苷渗漏到胞外，最终使　细胞破裂致死，达到抑菌目的　…。　本研究从内蒙古锡林郭勒盟（以下简称锡盟）地　区酸马奶酒中分离得到的乳酸菌和酵母菌中筛选抑菌　效果较好的菌株，并研究其发酵液的抑菌机理。通过　测定抑菌活性物质对目标菌株作用前后生长曲线、电　导率、可溶性总糖和磷代谢的变化，研究酸马奶中生　物活性物质对菌体细胞膜通透性和胞内分子代谢的影　响，为进一步研究马奶酒对病原菌的抑制作用机制提　供依据。　１材料与方法　１．１试验材料　１．１．１菌株　乳酸菌：从内蒙古锡盟地区酸马奶酒中分离出的　９株乳酸菌和５株酵母菌，乳酸菌编号分别为Ａ１、Ａ７、　Ｂ２、Ｃ６、Ｄ６、Ｅ２、Ｅｌ３、Ｅｌ４和Ｙ１。酵母菌编号为　Ｊ９Ａ３、Ｊ１０Ａ１、Ｊ８Ｃ３、Ｊ９Ｂ１和Ｊ９Ｂ２。由内蒙古农业大　学食品微生物实验室保存。　指示菌：金黄色葡萄球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａ￣ｌＦ６７．１Ｓ）、　肠炎沙门氏菌肠亚种（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｅｎｔｅｒｉｃａ　ｓｕｂｓｐ．　ｅｎｔｅｒｉｃａ）和荧光假单胞菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｌｆｕｏｒｅｓｃｅｎｓ），　购于中国科学院微生物研究所。　１．１－２培养基　乳酸菌培养基：ＭＲＳ培养基，脱脂乳培养基；酵　母菌培养基：葡萄糖一酵母膏．蛋白胨（ＹＥＰＤ）培养基；　指示菌培养基：普通肉汤培养基：抑菌活性检测培养　基：水琼脂培养基和营养琼脂培养基。　配制方法见参考文献ｌ“’１引。　１．２主要仪器设备　ＨＦｓａｆｅ一９００手动型生物安全柜，上海力新仪器有　限公司；梅特勒ＰＢ一１０ｐＨ计，梅特勒托利多公司；　ＫＤＣ一１４０ＨＲ高速冷冻离心机，河南兄弟仪器设备有　限公司；ＬＲＨ．２５０恒温生化培养箱，上海一恒科技有　限公司；ＫＧ．ＳＸ一５００高压蒸汽灭菌器，日本Ｔｏｍｙ　Ｄｉｇｉｔａｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ公司；Ｔ６新悦可见分光光度计，北京　ｌ５２　普析通用仪器有限责任公司；ＩＫＡ％Ｖ　１０　ｄｉｇｉａｔｌ型旋　转蒸发仪，广州仪科实验室技术有限公司。　１．３试验方法　１．３．１指示菌菌悬液的制备　指示菌接种于普通肉汤培养基，金黄色葡萄球菌　和肠炎沙门氏菌于３７℃培养２４　ｈ，荧光假单胞菌于　２６℃培养４８　ｈ，连续活化培养三代，利用平板活菌计　数法将各菌株用无菌生理盐水配制成浓度为ｌ０　ＣＦＵ／ｍＬ的菌悬液作为指示菌菌悬液，备用。　１．３．２　乳酸菌、酵母菌混合代谢产物的制备　供试乳酸菌和酵母菌活化三代，以体积分数２％　接种到ＭＲＳ液体培养基和ＹＥＰＤ液体培养基中，分　别于３７℃培养５０ｈ和３Ｏ℃培养７０ｈ制成母发酵液，　将乳酸菌和酵母菌母液以体积比２％：２％的接种量接　种于脱脂乳培养基，共生发酵先在３０℃摇床培养１２　ｈ，再转到３７℃静置培养２０ｈ。发酵液８０００　ｒ／ａｒｉｎ离　心２０　ａｒｉｎ，上清液用０．４５　ｐｍ孔径的滤菌器过滤，收　集无细胞发酵上清液，４℃冰箱保存备用。　１．３－３产抑菌活性物质乳酸茵的筛选　初筛：采用牛津杯琼脂扩散法　３Ｊ进行初筛。指示　菌菌悬液浓度为１０。ＣＦＵ／ｍＬ，取混有指示菌菌悬液的　营养琼脂培养基倾注于放有牛津杯的平皿中，制成带　孔的含菌平板。将乳酸菌代谢物２００　注入小孑Ｌ内，　４。Ｃ冰箱扩散３～５　ｈ，将含沙门氏菌和金黄色葡萄球菌　的平皿３７℃培养１０　ｈ，含荧光假单胞菌的平皿２６℃　培养１６　ｈ后，用游标卡尺测量抑菌圈直径。选取对三　株指示菌均有较好抑菌效果的菌株进行复筛试验。　复筛：将代谢物排除有机酸和过氧化氢进行复筛。　将空白脱脂乳培养基分别用乳酸和乙酸调节ｐＨ为　４．０、４．５、５．０、５．５和６．０进行抑菌试验，确定有机酸　排除的对照ｐＨ值。将代谢物调至ｐＨ　７．０，按浓度ｌ０　ｍＬ加入过氧化氢酶，３７℃水浴２　ｈ后调至有机酸　排除对照ｐＨ值，在旋转蒸发仪中浓缩１０倍，以相同　ｐＨ值的乳酸和乙酸作为对照，采用牛津杯法进行抑菌　试验。　１．３．４抑菌活性物质对指示菌生长曲线的影响　在５　ｍＬ普通肉汤培养基中加入含活菌数为１０。　ＣＦＵ／ｍＬ的沙门氏菌菌悬液和体积分数为２％和６％的　浓缩２０倍代谢物，以加等量无菌水作为空白对照，　３７℃恒温培养，每隔２　ｈ在６００　ｎｍ处测吸光值，连　续测定３８　ｈ，制作沙门氏菌在抑菌物质作用下的生长　曲线。　１．３．５抑茵活性物质对指示菌细胞膜通透性的　影响　现代食品科技　Ｍｏｄｅｒｎ　Ｆｏｏｄ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　２０１６，Ｖｏ１．３２，Ｎｏ．１２　采用电导率法　测定指示菌细胞膜离子通透性　的变化。分别取５０　ｍＬ菌浓度为１０。ＣＦＵ／ｍＬ的沙门　氏菌菌悬液，加入体积分数为２％、３％和４％的２０倍　０．５　ｍＬ菌悬液加入４０　ｍＬ浓度为１　ｍｇ／ｎ￣的葡萄糖溶　液和１０ｍＬ０．０４ｍｇ／ｒｒ￣的磷标准溶液，分别加入体积　分数为２％、３％和４％的２０倍代谢物浓缩液，以加等　量无菌水作为空白对照。混匀后３７℃处理０、２、４、　６、８、１０和１２ｈ后取出１　ｍＬ于离心管，用三氯乙酸　．浓缩代谢物，以加等量无菌水作为空白对照，３７℃恒　温培养。分别在０、０．５、１、２、３、６和９　ｈ取出菌悬　液５　ｍＬ，离一Ｇ（４０００　ｒ／ｍｉｎ，１０　ｍｉｎ），上清液用于电导　率的测定。　硫酸亚铁和钼酸铵溶液处理后，３０℃恒温水浴ｌ　５　ｍｉｎ，在６３０ｎｍ处测吸光值。　１．３．６抑菌活性物质对指示菌液中可溶性总糖　含量的影响　采用蒽酮法［１５】测定指示菌液中可溶性总糖含量。　在浓度为１　ｍｇ／ｍＬ葡萄糖溶液中加入沙门氏菌菌悬　液，调节菌浓度为１０。ＣＦＵ／ｍＬ，分别加入体积分数为　２％、３％和４％的２０倍代谢物浓缩液，以加等量无菌　水作为空白对照。３７℃分别处理０、２、４、６、８、１Ｏ　和１２　ｈ后取出１　ｍＬ离心（４０００　ｒ／ｍｉｎ，１０　ｍｉｎ），取　１．３．８数据统计分析　数据采用ＳＰＳＳ　２２．０软件的ＡＮＯＶＡ进行单因素　方差分析。　２结果与讨论　２．１　产抑菌活性物质乳酸菌的筛选　２．１．１初筛　以肠炎沙门氏菌肠亚种、荧光假单胞菌和金黄色　上清液，加入蒽酮试剂，混匀后置于沸水浴中加热１０　ａｉｒｎ，冷却后测定其在６２０　ｎｍ处吸光值，以标准葡萄　糖溶液作标准曲线，从标准曲线中查得相应的总糖含　量。　葡萄球菌为指示菌，对分离出的均具有抑菌活性的９　株乳酸菌进行抑菌试验。由表１可知，乳酸菌对不同　指示菌表现出不同的抑菌活性，其中Ｄ６、Ｅ２、Ｅｌ３　和Ｅｌ４的抑菌作用比较显著，对各指示菌的抑菌圈直　径均在２０ｒｆｌｌＴｌ以上，选取这４株乳酸菌进行下一步的　复筛试验。　１．３．７抑菌活性物质对指示菌磷代谢的影响　根据翟培等【ｌ　６＿的方法测定指示菌液中的总磷含　量。用活化三代指示菌，以０．１　ｍｏｌ／Ｌ，ＰＨ＝７．４的磷　酸缓冲液稀释菌体，获得１０。ＣＦＵ／ｍＬ的菌悬液。取　表１产抑菌潘陛物质乳酸菌的初筛结果　Ｔａｂｌｅ　１　Ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ　ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ　ｒｅｓｕｌｔ　ｏｆｌａｃｔｉｃ　ａｃｉｄ　ｂａｃ￣ａ　ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ　ａｎｔｉｂａｃ￣ａｌ　ａｃｔｉｖｅ　ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ　注：表中数值为三次试验的平均值士标准误差；牛津杯直径８　ａｒｉｎ，下同。　２．１．２　复筛　将乳酸菌代谢物排除过氧化氢，并把ｐＨ值调整　为排除酸影响ｐＨ值５．０后，４株供试菌株均保持较好　的抑菌活性，说明供试菌株的代谢物中含有除乳酸、　乙酸和过氧化氢以外的其他抑菌活性物质。从表２可　以看出，菌株Ｄ６和Ｅｌ３的抑菌活性较好，４株供试　选择沙门氏菌作为研究抑菌机理的指示菌。　将５株酵母菌与Ｄ６和Ｅｌ３混合发酵，与乳酸菌　单独发酵的抑菌圈大小进行比较，结果见表３。酵母　菌ＪＩＯＡ１和乳酸菌Ｅｌ３和Ｄ６的共生发酵ｌ：ｌ￣ｇＬ酸菌单　独发酵抑菌效果分别增加２．４８　ｍｍ和１．４５　ｍｍ左右，　具有极显著（ｐ＜０．０１）促进抑菌物质生成的效果，所　以选择ＪＩＯＡ１和乳酸菌Ｅｌ３、Ｄ６共生发酵作进一步试　验。　菌株对沙门氏菌的抑菌活性显著高于其他两株指示　菌，所以选择Ｄ６和Ｅｌ３作为混合发酵的试验菌株，　现代食品科技　Ｍｏｄｅｒｎ　Ｆｏｏｄ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　表２产抑菌活性物质乳酸菌的复筛结果　Ｔａｂｌｅ　２　Ｒｅｓｃｒｅｅｎｉｎｇ　ｒｅｓｕｌｔ　ｏｆ　ｌａｃｔｉｃ　ａｃｉｄ　ｂａｃｔｅｒｉａ　ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ　ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ　ａｃｔｉｖｅ　ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ　２０１６，ＶｏＬ３２，Ｎｏ．１２　０　０　０　０表３混合发酵液的抑菌效果　Ｔａｂｌｅ　３　Ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ　ｅｆｆｅｃｔ　ｄｕｒｉｎｇ　ｍｉｘｅｄ　ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ　注：表中‘　”为混合培养促进抑菌效果，“一”为混合培养抑制抑菌效果；“一实验组与对照组比较差异显著（ｐ＜０．０５），“　’为实验　组与对照组比较差异极显著（　Ｏ．０１）。　２．２　抑菌活性物质对指示菌生长曲线的影响　菌液光密度值（ＯＤ值）的变化可以间接反映抑　菌活性物质对沙门氏菌生长的影响程度，在适宜生长　细胞膜是细菌的保护屏障，而强抑菌剂能破坏细　菌的细胞膜，导致菌体的保护屏障被打破，其内部电　解质（如ｌ（＋）渗漏到细胞外的培养液中，使培养液的　电导率上升。因此，菌液电导率的变化可以反映抑菌　物质对指示菌细胞膜通透性的影响【Ｉ　。　排除浓缩代谢物自身的电导率影响（见表４），沙　门氏菌菌悬液的电导率变化如图２和图３所示，试验　条件下，菌体生长表现出具有规律性的４个阶段：延　滞期、对数期、稳定期以及衰亡期。图１显示，与对　照组正常生长的沙门氏菌相比，试验组生长曲线相对　较为平缓，延滞期延长，且对数期的峰值低于对照菌。　Ｅｌ３所产抑菌物质作用下的沙门氏菌受到更大的影　响，说明菌株Ｅｌ３对沙门氏菌的抑菌作用强于菌株　组和对照组的电导率在０￣０．５　ｈ下降，其原因可能是　菌悬液中的电解质与细胞膜外表面发生了静电结合，　导致带电离子减少。２￣３　ｈ试验组电导率显著高于对　照组，说明抑菌物质在２　ｈ抑菌作用明显。随着所加　代谢物体积分数的增大，试验组电导率也随之增大，　说明抑菌活性物质浓度越高对细胞膜的破坏越大。观　Ｄ６，且随着加入２Ｏ倍浓缩代谢物的体积分数由２％增　加到６％，生长曲线变化明显，ＯＤ６ｏｏｍｎ增加的幅度大　大减小，说明在一定范围内，抑菌活性物质的抑菌作　用随其浓度的增加而增强。　察相同时间的电导率值，Ｅｌ３高于Ｄ６，说明Ｅｌ３产生　的抑菌活性物质对沙门氏菌细胞膜通透性的影响大于　Ｄ６。　舍　邑　＼　褂　曲　发酵时间／ｈ　图１抑菌活性物质对沙门氏菌生长曲线的影响　Ｆ．ｇ．１　Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ　ａｃｔｉｖｅ　ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｇｒｏｗｔｈ　ｃｕｒｖｅ　ｏｆ　Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　时间／ｈ　图１　Ｅ１　３产抑菌活性物质对沙门氏菌菌悬液电导率的影响　Ｆ　．２　Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ　ａｃｔｉｖｅ　ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ　ｆｒｏｍ　Ｅｌ３　ｏｎ　２．３　抑菌活性物质对指示菌细胞膜通透性的　影响　１５４　ｔｈｅ　ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌ　ｃｏｎｄｕｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｆＳａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｓｕｓｐｅｆｉｓｉｏｎ　现代食品科技　Ｍｏｄｅｒｎ　Ｆｏｏｄ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　２０１６，Ｖｏ１．３２，Ｎｏ．１２　窭　时间／ｈ　图３　Ｄ６产抑菌活性物质对沙门氏菌菌悬液电导率的影响　Ｆ　．３　Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ　ａｃｔｉｖｅ　ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ　ｆｒｏｍ　Ｄ６　ｏｎ　ｔｈｅ　ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌ　ｃｏｎｄｕｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ　表４浓缩代谢物电导率　１阻ｂＩｅ　４　Ｃｏｎｄｕｃｔｉｖｉｙｔ　ｏｆ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄ　ｍｅｔａｂｏｆｉｔｅｓ　２．４　抑菌活性物质对指示菌液中可溶性总糖　含量的影响　糖类是微生物主要的碳源和能源。细菌处于正常　生理状态时，会吸收利用外源的营养成分，而当膜结　构遭到破坏时，细胞内容物包括糖类发生外泄，菌液　糖浓度的变化，可以反映细菌膜结构的完整性ｎ引。　２．４．１　葡萄糖标准曲线的绘制　以标准葡萄糖溶液作标准曲线，结果如图４所示。　可得其线性回归方程为　．７６０６ｘ＋０．０１８４，其中　Ｒ２：０．９９３７（０．９９３７＞０．９９）。　ｌ　８　葡萄糖含量／（ｍｇ／ｍＬ）　图４葡萄糖标准曲线　Ｆ喀４　Ｓｔａｎｄａｒｄ　ｃｕｒｖｅ　ｏｆ　ｇｌｕｃｏｓｅ　２．４．２菌液中总糖含量的变化　沙门氏菌与不同体积分数代谢浓缩物混合处理不　同时间后，在６２０　ｎｌＴｌ处测吸光值，从标准曲线中查　得相应的总糖含量，排除代谢浓缩物本身葡萄糖含量　影响（见表５），结果见图５和图６。经抑菌物质作用　后，试验组菌液中可溶性总糖含量先升高，这说明沙　门氏菌的细胞膜结构遭到破坏，使胞内糖类物质外渗；　４　ｈ后试验组糖含量均有不同程度下降，说明细菌开始　增殖，利用培养基中的糖类物质。但相对于对照组降　低程度较小，表现出对糖吸收利用能力的下降，干扰　菌体正常生长代谢。代谢物体积分数越大，以上抑菌　表现越突出，对沙门氏菌生长代谢影响越大。　表５浓缩代谢物葡萄糖含量　ｌｂｌｅ　５　Ｇｌｕｃｏｓｅ　ｃｏｎｔｅｎｔ　ｏｆ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄ　ｍｅｔａｂｏｆｉｔｅｓ　１　ｌ　１　Ｏ　Ｏ　Ｏ　Ｏ　Ｏ　ｌ　ｌ　１　Ｏ　要　掘　时间／ｈ　图５　Ｅ１　３产抑菌活性物质对沙门氏菌菌悬液中可溶性总糖的影　响　Ｆｉｇ．５　Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ　ａｃｔｉｖｅ　ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ　ｆｒｏｍ　Ｅｌ３　ｏｎ　ｓｏｌｕｂｌｅ　ｔｏｔａｌ　ｓｕｇａｒ　ｃｏｎｔｅｎｔ　ｏｆ　Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ　邑　钿　耀　｝曰　龌　时间／ｈ　图６　Ｄ６产抑菌活性物质对沙门氏菌菌悬液中可溶性总糖的影响　Ｆｉｇ．６　Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ　ａｃｔｉｖｅ　ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ　ｒｆｏｍ　Ｄ６　ｏｎ　ｓｏｌｕｂｌｅ　ｔｏｔａｌ　ｓｕｇａｒ　ｃｏｎｔｅｎｔ　ｏｆ　Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ　２．５抑菌活性物质对指示菌磷代谢的影响　磷是所有包括微生物在内的生物所需要的微量元　素，它是核酸、磷脂以及糖代谢中间产物的重要组成　成分，而且在细胞的能量代谢中起到十分关键的作用　ｆｌ９］。细菌利用葡萄糖经过一系列磷酸化反应过程，是　ｌ５５　Ｏ　现代食品科技　ＭｏＵｒｎ　Ｆｏｏｄ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　２０１６，Ｖｏ１．３２，Ｎｏ．１２　细菌生长繁殖所需能量的主要途径。通过检测细胞代　谢活动中磷的消耗状况可反映细菌细胞的整体代谢功　能和生长状态【ｌ　６Ｊ。排除代谢浓缩物本身磷含量影响　（见表６），沙门氏菌菌液中磷含量变化如图７和８所　示，ＯＤ６３０ｎｎ　值越高，表示菌液中磷含量越高。与对照　组相比，试验组磷消耗量均随着作用时间的延长而逐　渐降低，抑菌物质体积分数增大后，磷代谢先变缓慢，　随后趋于平稳，表明沙门氏菌的磷代谢受到严重影响。　由此可知两株乳酸菌产生的抑菌活性物质不仅破坏细　菌的细胞壁和细胞膜结构，还会影响细菌的细胞代谢，　导致细菌死亡。　表６浓缩代谢物磷含量　Ｔａｂｌｅ　６　Ｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓ　ｃｏｎｔｅｎｔ　ｏｆ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄ　ｍｅｔａｂｏｌｔｔｅ　８　时间／ｈ　图７　Ｅ１　３产抑菌活性物质对沙门氏菌磷代谢的影响　Ｆｉｇ．７　Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ　ａｃｔｉｖｅ　ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ　ｆｒｏｍ　Ｅｌ３　ｏｎ　ｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓ　ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ　ｏｆ　Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｌ　昌　０　时间／ｈ　图８　Ｄ６产抑菌活性物质对沙门氏菌磷代谢的影响　Ｆｉｇ．８　Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ　ａｃｔｉｖｅ　ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ　ｆｒｏｍ　Ｄ６　ｏｎ　ｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓ　ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ　ｏｆＳａｌｍｏｎｅｌｌａ　３结论　３．１经过初筛和复筛，酵母菌ＪＩＯＡ１和乳酸菌Ｅ１３、　Ｄ６共生发酵，比乳酸菌单独发酵抑菌效果分别增加　１　５６　２．４８　ｍｍ和１．４５　ｍｍ，对抑菌活性物质的形成表现出　极显著（　＜０．Ｏ１）的促进作用。沙门氏菌对Ｅｌ３和Ｄ６　产生的抑菌活性物质敏感，经抑菌活性物质作用后，　其生长曲线延滞期延长，对数期缩短，对数期的峰值　明显降低；菌体细胞内电解质和可溶性总糖外渗，菌　液电导率和可溶性总糖含量增加，说明抑菌活性物质　能改变沙门氏菌细胞膜的通透性；糖吸收利用能力下　降，磷代谢先变缓慢，随后趋于平稳，细胞代谢受到　严重影响。　３．２研究结果表明，乳酸菌产生的抑菌活性物质，不　仅破坏细菌的细胞壁和细胞膜结构，还会影响细菌的　细胞代谢，导致细菌无法进行正常的生长和繁殖，从　而发挥抑菌作用。菌株Ｅｌ３产生的抑菌活性物质的抑　菌活性强于菌株Ｄ６。　参考文献　［１】　殷文政，乌尼，钱建伟，等．锡林郭勒牧区马奶酒生物活性动　态的研究（一）［Ｊ】．内蒙古农业大学学报，２００１，２３（１）：９—１６　ＹＩＮ　Ｗｅｎ—ｚｈｅｎｇ，ＷＵ　Ｎｉ，ＱＩＡＮ　Ｊｉａｎ—ｗｅｉ，ｅｔ　ａ１．Ｓｔｕｄｙ　ｏｎ　ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ａｃｉｔｖｉｔｙ　ｄｙｎａｍｉｃ　ｏｆｋｕｍｙｓ　ｆｒｏｍ　Ｘｉｌｉｎｇｕｏｌｅ（－）［Ｊ１．　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｉｎｎｅｒ　Ｍｏｎｇｏｌｉａ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，２００１，　２３（１）：９－１６　［２】　殷文政，刘立一，马玉玲，等．马奶酒抑菌活性的研究［Ｊ］．中国　乳品工业，２００５，３３（７）：１５－１７　ＹＩＮ　Ｗｅｎ—ｚｈｅｎｇ，ＬＩＵ　Ｌｉ—ｙｉ，ＭＡ　Ｙｕ—ｌｉｎｇ，ｅｔ　ａ１．Ｓｔｕｄｙ　ｏｎ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ　ａｆｆｅｃｔｉｏｎ　ｐａｔｈｏｇｅｎｓ　ｏｆ　ｋｕｍｉｓ［Ｊ］．Ｃｈｉｎａ　Ｄａｉｒｙ　Ｉｎｄｕｓｔｒｙ，２００５，３３（７）：１５—１７　【３］Ｓｚａｋａｌｙ　Ｓ．Ｒｏｌｅ　ｏｆｆｅｒｍｅｎｔｅｄ　ｍｉｌｋ　ｐｒｏｄｕｃｔｓ　ｉｎ　ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ｈｅａｌｈｔ［Ｊ１．Ｔｅｊｇａｚｄａｓａｇ，１９９９，５９（２）：１５—１８　［４］　Ｇｕｌａｈｍａｄｏｖ　Ｓ　Ｇ　Ａｂｄｕｌｌａｅｖａ　Ｎ　Ｇｕｓｅｉｎｏｖａ　Ｎ　ｅｔ　ａ１．　Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｂａｃｔｅｒｉｏｃｉｎ—ｌｉｋｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ　ｓｕｂｓｔｎａｃｅｓ　ｆｒｏｍ　ｌａｃｔｉｃ　ａｃｉｄ　ｂａｃｔｅｒｉａ　ｉｓｏｌｔａｅｄ　ｆｒｏｍ　ａｚｅｒｂａｉｊａｎ　ｃｈｅｅｓｅｓ［Ｊ］．Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００９，　４５：２６６　２７ｌ　【５］Ｄｅ　Ｖｕｙｓｔ　Ｌ，Ｌｅｒｏｙ　Ｅ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｃｉｎｓ　ｆｒｏｍ　ｌａｃｔｉｃ　ａｃｉｄ　ｂａｃｔｅｒｉａ　ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，ｐｕｒｉｉｆｃａｔｉｏｎ，ａｎｄ　ｆｏｏｄ　ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ＆Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００７，１３（４）：１９４一　ｌ９９　［６　６］黎杰，韩磊，殷文政．一株产细菌素乳酸菌的筛选及细菌素　特性研究［Ｊ］．安徽农业科学，２０１５，４３（２２）：２２５・２２７，２３０　ＬＩ　Ｊｉｅ，ＨＡＮ　Ｌｅｉ，Ｙ１Ｎ　Ｗｅｎ－ｚｈｅｎｇ．Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ　ｏｆ　ｂａｃｔｅｒｉｏｃｉｎ—　ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ　Ｌａｃｔｉｃ　ａｃｉｄ　ｂａｃｔｅｒｉａ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ　ｏｆ　ｂａｃｔｅｒｉｏｃｉｎ［Ｊ］．Ａｎｈｕｉ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，２０１５，４３（２２）：　２２５—２２７，２３０　【７　７］Ｉｓｈｉｉ　Ｓ，Ｋｉｋｕｃｈｉ　Ｍ，Ｔａｋａｏ　Ｓ．Ｉｄｅｎｔｉｉｆｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ　现代食品科技　Ｍｏｄｅｒｎ　Ｆｏｏｄ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　２０１６，Ｖｏ１．３２，Ｎｏ．１２　（上接第１７Ｏ页）　［８］　ＹＥ　Ｘｉａｏ—ｐｉｎｇ，ＳＯＮＧ　Ｃｈｕｎ・ｑｉｎｇ，ＹＵＡＮ　Ｐｉｎｇ　ｅｔ　ａ１．　Ａｌｐｈａ—ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ　ａｎｄ　ａ—ａｍｙｌａｓｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　ｃｏｍｍｏｎ　ｃｏｎｓｆｉｔｕｅｎｔｓ　ｆｒｏｍ　ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ　Ｃｈｉｎｅｓｅ　ｍｅｄｉｃｉｎｅ　ｕｓｅｄ　Ｗｉｌｅｙ－ＶＣＨ，Ｉｎｃ．２０００　［１０］Ｖａｎ　ｄｅ　Ｌａａｒ　Ｆ　Ａ，Ｌｕｃａｓｓｅｎ　Ｐ　Ｌ　Ｂ　Ｊ，ｍｋｋｅｒｍａｎｓ　Ｒ　Ｐ　ｅｔ　１ａ．　ｌｐｈａ－Ａｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ　ｆｏｒ　ｔｙｐｅ　２　ｄｉａｂｅｔｅｓ　ｍｅｌｌｉｔｕｓ：ａ　ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ　ｒｅｖｉｅｗ［Ｊ】．Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｅｖｉｄｅｎｃｅ　Ｂａｓｅｄ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２００６，６（５）：３３５—３５　１　ｆｏｒ　ｄｉａｂｅｔｅｓ　ｍｅｔｌｉｔｕｓ［Ｊ】．Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｎａｔｕｒａｌ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅｓ，２０１０，８（５）：３４９－３５２　【１　１］Ｒ　Ｅｉｓｅｎｔｈａｌ　Ａ，Ｃｏｍｉｓｈ—Ｂｏｗｄｅｎ．Ｔｈｅ　ｄｉｒｅｃｔ　ｌｎｅｉａｒ　ｐｉｎ：Ａ　ｎｅｗ　ｇｒａｐｈｉｃａｌ　ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ　ｆｏｒ　ｅｓｔｉｍａｔｉｎｇ　ｅｎｚｙｍｅ　ｋｉｎｅｔｉｃ　【９］　Ｒｏｂｅｒｔ　Ａ．Ｃｏｐｅｌａｎｄ．Ｅｎｚｙｍｅｓ：ａ　ｐｒａｃｔｉｃａｌ　ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｔｏ　ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ｍｅｃｈａｎｉｓｍ，ａｎｄ　ｄａｔａ　ａｎａｌｙｓｉｓ［Ｍ］．Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ：　ｐａｒｍｅｔａｅｒｓ［Ｊ］．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｊｏｕｒｎａｌ，１９７４，１３９（３）：７１５・７２０　１５７