人参皂苷Rg_1及其肠内菌代谢产物Rh_1对小鼠免疫细胞功能的影响

人参皂苷Rg1及其肠内菌代谢产物Rh1对小鼠免疫细胞功能的影响

王 毅,蒋 艳,王本祥,邱全瑛

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(1.北京中医药大学微生物免疫教研室,北京100029;2.吉林天然药物研究所,吉林长春130012)摘要:目的 初探人参皂苷Rg1及其肠内菌代谢产物Rh1对正常小鼠免疫功能的影响。方法 用Rh1与Rg1分别处理脾T细胞,B细胞及腹腔巨噬细胞(MU);MTT比色法测T和B细胞增殖能力;中性红比色法测MU的吞噬功能;Griess法测MU释放NO的水平。结果 Rh1能促进脾细胞增殖、下调ConA诱导的T细胞增殖;Rh1与Rg1对LPS诱导的B细胞增殖均无明显作用;Rg1和Rh1能提高MU的吞噬能力和促进NO的释放。结论 Rg1及其代谢产物Rh1可共同作用于T细胞和MU而产生免疫调节作用。

关键词:人参皂苷Rh1;人参皂苷Rg1;免疫细胞

中图分类号:R967;R282.71 文献标识码:A 文章编号:0513-4870(2002)12-0927-03

人参皂苷Rg1是人参总苷中的主要成分之一,其结构简单,水溶性好,所以对人参皂苷Rg1含量的测定是含人参类制剂的重要质量标准。体内实验证[1]

明,Rg1可增强老年大鼠脾淋巴细胞增殖功能,提高其产生IL-2的能力。日本学者及我们的研究表明

[2,3]

动物 体重(18?210)g,`,NIH小鼠,购自北京

生物制品研究所,合格证号京动许字(1999)第012号。

脾脏淋巴细胞增殖试验 MTT比色法。(1)小鼠脾细胞悬液制备 无菌取小鼠脾脏,按常规制备脾细胞悬液,其活力>95%,最后用完全RPMI1640培养液调细胞浓度至5@10#mL。(2)药物对淋巴细胞增殖的直接作用 取上述细胞悬液190LLP孔加入96孔板。空白对照组:加入完全RPMI1640培养液10LL;Rg1组:加入Rg1各10LL(终浓度分别为1,10,100Lg#mL);Rh1组:加入Rh1各10LL(终浓度分别为1,10,100Lg#mL)。(3)药物对ConA诱导T细胞增殖的影响 取上述细胞悬液180LLP孔加入96孔板,同时设空白对照组及ConA对照组,空白对照组加完全RPMI1640培养液20LL,除空白对照组外,各组分别加入ConA10LL(终浓度为5Lg#mL),药物分组同(2)。(4)药物对LPS诱导B细胞增殖的影响 除将ConA换成LPS(终浓度为10Lg#mL

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-1

6

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,Rg1经人和大鼠肠内菌代谢后产生代谢产物

Rh1,同时在血中可检测到Rg1及Rh1,但对其药理作用研究甚少。本文通过比较Rh1及Rg1对小鼠免疫细胞功能的影响,初探Rg1免疫作用的机制。

材料及方法

药品及试剂 人参皂苷Rg1及其代谢产物Rh1

(白求恩医科大学天然药化室提供,纯度98%);ConA,LPS,MTT均购于美国Sigma公司,MTT以pH714的磷酸盐缓冲液(PBS)配成5mg#mL

[3]

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备用;

Griess液配制见文献;RPMI1640(美国Gibco公司)用三蒸水充分溶解后,加入Hepes(美国Sigma公司)25mmol#L、丙酮酸钠(美国Sigma公司)1

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mmol#L及NaHCO3(北京化工厂)16mmol#L,过滤除菌,即为不完全培养基;使用时分别加入青霉素和链霉素各100u#mL、L-谷氨酰胺(BDHChemicalsLtdPoole,英国)215mmol#L及10%灭活胎牛血清(美国Gibco公司)即为完全RPMI1640培养液。

收稿日期:2002-01-04.

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通讯作者 Tel:(010)64286972,Fax:(010)64286871,

E-mail:quanyingq1936@yahoo.com.cn-1

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)外,分组、加样同(3)。将上述96

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孔板置37e,5%CO2培养72h,弃上清液,加入MTT,37e继续培养6h,每孔加入011mol#LHC-l

10%SDS,37e培养4h,酶标仪570nm测A值,以A值示细胞增殖程度。

腹腔M5吞噬功能测定 中性红比色法。用冷PBS注入小鼠腹腔,常规制备腹腔MU悬液,其活力>95%。用完全RPMI1640培养液调细胞浓度至2@10#mL,加入96孔板,每孔190LL,置37e,5%CO2培养箱内培养4h后,弃未粘附细胞,按下列分组加样。空白组:加入完全RPMI1640培养液6

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#928#药学学报ActaPharmaceuticaSinica2002,37(12):927-929

10LL;Rg1组:加入Rg1各10LL(终浓度分别为1,10,100Lg#mL);Rh1组:加入Rh1各10LL(终浓度分别为1,10,100Lg#mL),置37e,5%CO2培养箱内培养24h后,弃上清液,加入01072%的中性红溶液100LLP孔,培养30min后,以PBS洗2次,加入腹腔M5裂解液200LLP孔,4e静置过夜,酶标仪530nm测A值。

腹腔M5NO释放能力测定 用Griess法。腹腔MU制备、加样、分组同上。经37e,5%CO2培养24h,取上清液100LL加至另一块96孔板相应位置,加入Griess液100LLP孔,24e,10min,酶标仪530nm测A值。

统计方法 各组数据均用t检验统计处理。

[4]

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Table1 EffectsofRg1andRh1onConA-inducedproliferationofmouseTlymphocyteinvitro

GroupControlConAcontrolRg1

110100

Rh1

110100

ConA+Rg1

110100

ConA+Rh1

110100

ConcentrationPLg#mL-1

A570value0.136?0.0100.156?0.010*

0.142?0.0100.142?0.0100.148?0.0120.156?0.010*0.159?0.015*0.161?0.010*0.151?0.010*0.147?0.0100.143?0.010@0.139?0.011@@,#0.142?0.011@0.140?0.010@@

,##,#*,#***

结果

1 Rg1和Rh1对小鼠脾淋巴细胞、T细胞增殖作用的影响

各浓度的Rh1均能直接促进脾脏淋巴细胞增殖,而Rg1仅有促进脾脏淋巴细胞增殖的趋势,无统计学意义。相同浓度的Rh1促进脾脏淋巴细胞增殖的作用比Rg1强(P<0101或P<0105)。

与未诱导组相比,在ConA诱导下,ConA对照组的T细胞增殖能力显著提高;加入Rg1及Rh1后,与ConA对照组相比,3个浓度的Rh1均能显著抑制ConA诱导的T细胞增殖,Rg1低剂量组(1Lg#mL)可增加T细胞的增殖,随剂量增加抑制作用加大,到100Lg#mL时有显著差异。两者同浓度相比,Rh1的抑制作用均比Rg1强;虽然加药各组均能抑制ConA诱导的T细胞增殖,但仍比空白对照组高。结果见表1。

2 Rg1和Rh1对LPS诱导的小鼠B细胞增殖的影响

LPS能明显促进B细胞增殖(P<01001),加入Rg1或Rh1后不影响LPS对B细胞的增殖作用(数据未列出)。

3 Rg1和Rh1对小鼠腹腔M5吞噬能力及NO释放的影响

Rg1与Rh1均能使腹腔M5的吞噬能力显著增强(P<0101或P<01001),但各浓度Rh1的作用均比相应浓度的Rg1弱,且中、高浓度有显著性差异。各浓度Rg1均能增强腹腔M5释放NO,Rh11和10Lg#mL亦有此作用,其高剂量组(100Lg#mL

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n=8,x󰀁?s.*P<0105,**P<0101,***P<01001vs

control;@P<0105,@@P<0101vsConAcontrol;#P<0105,##

P<0101vssameconcentrationofRg1

Table2 EffectsofRg1andRh1onphagocytosisandNO-releasinglevelofperitonealmacrophagefrommice

GroupControlRg1

110100

Rh1

110100ConcentrationPLg#mL-1

A530value

Phagocytosis0.24?0.040.38?0.06*0.41?0.05*0.37?0.07*0.33?0.07*0.33?0.04*0.31?0.06*

*******

**,###*,#

NO-releasinglevel0.17?0.020.20?0.02*0.19?0.02*0.20?0.02*0.20?0.02*0.20?0.02*

#*******##

0.170?0.010#

n=8,x󰀁?s.**P<0101,***P<01001vscontrol;0105,###P<01001vsthesameconcentrationofRg1

P<

讨

近年研究

[2,3]

论

证明,人参皂苷Rg1在人和大鼠体

[5]

内,经肠内细菌代谢后,均能转变为Rh1并被吸收入血,同时在血中还检测到Rg1的存在。Wang等的研究还表明Rg1及Rh1能够在体外刺激单核细胞株(THP-1)产生TNF-A,IL-8等细胞因子。但就其对免疫系统作用的研究罕见报道。

据报道,Rg1可增强老年大鼠脾淋巴细胞增殖功能,提高其产生IL-2的能力。本实验结果表明,Rh1能够直接促进脾脏淋巴细胞增殖,并抑制ConA诱导的T细胞增殖。而Rg1对脾细胞无明显直接作用,高浓度的Rg1能抑制ConA诱导的T细胞增殖。二者对LPS诱导B淋巴细胞增殖均无明显影响。从)作

用弱于同浓度的Rg1(P<01001)。结果见表2。药学学报ActaPharmaceuticaSinica2002,37(12):927-929#929#

以上结果可以推测Rg1对脾淋巴细胞增殖的影响可能是Rg1及其代谢产物Rh1共同作用于T细胞的结果,且Rh1的作用更强,对T亚群的作用有待进一步研究。

MU的吞噬作用是MU活化的主要标志之一。国外大量研究表明,MU抗肿瘤、抗病毒、抑制胞内病原体增殖等作用主要通过释放NO完成,因而NO的水平也是MU活化的一个重要指标。Rg1各剂量和Rh1低、中剂量组均能显著提高MU的吞噬及NO释放的能力,二者对提高MU吞噬功能及促进NO释

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放的作用基本一致。Rh1高剂量(10Lg#mL)的作用弱于同剂量的Rg1(P<0105或P<0101),此结果与我们先前所作的试验结果一致,即Rh1低浓度(1Lg#mL)能在体外刺激单核细胞株(THP-1)产生IL-8,而在高浓度(100Lg#mL)时则表现为抑制作[5]

用。有研究发现,兴奋的MU如果激活过度,则发展成为抑制性MU,产生PEG等抑制物,抑制免疫功能。Rh1高剂量对MU功能的抑制作用可能与Rh1剂量过大使MU过度活化而转为抑制型MU有关。

综上所述,人参的/扶正0、调节机体免疫的作用可能与Rg1及其代谢产物Rh1在体内直接激活T细胞增殖,抑制活化状态的T细胞,并提高MU吞噬及

[7]

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[6]

释放NO的能力等有关。二者对其他免疫细胞作用还待进一步研究。REFERENCES:

[1]LiuM,ZhangJT.Immunoregulatoryeffectsofginsenoside

Rg1inagedrats[J].ActaPharmSin(药学学报),1995,[2]

30(11):818-823.

WangY,LiuTH,WangW,etal.StudiesonthemetabolismofginsenosideRg1byintestinalbacteriaanditsabsorbedmetabolitesinratandhumansera[J].ActaPharmSin(药学学报),2000,35(4):284-288.

UshioS,ChungKS,ByungHH,etal.Radioimmunoassayforthedeterminationofginsengsaponin,ginsenosideRg1[J].ChemPharmBull,1982,30(5):1907-1910.

DingAH,NathanCF,StuehrDJ.Releaseofreactivenitrogenintermediatesandreactiveoxygenintermediatesfrommouseperitonealmacrophage[J].JImmunol,1988,141(7):2407-2412.

WangY,WangBX,LiuTH,etal.MetabolismofgensenosideRg1,byintestinalbacteriaII.Immunological

[3]

[4]

[5]

activityofginsenosideRg1andRh1[J].ActaPharmacolSin,2000,21(9):792-796.

[6]LiewFY,LoxFEG.Nonspecificdefencemechanism:the

roleofnitricoxide[J].ImmunolToday,1991,12(3):A17-21.

[7]BiAH.MedicalImmunology(医学免疫学)[M].Beijing:

People.sMilitaryMedicalPublishingHouse,1995.20.

EFFECTSOFGINSENOSIDERg1ANDITSMETABOLITERh1

ONTHEFUNCTIONOFIMMUNOCYTEINMICE

WANGYi,JIANGYan,WANGBen-xiang,QIUQuan-ying

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(1.MicrobiologyandImmunologyDepartment,BeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100029,China;2.JilinInstituteofNaturalDrug,Changchun130012,China)ABSTRACT:AIM TostudythemechanismofactionofginsenosideRg1anditsmetaboliteRh1onthefunctionofimmunocyteinnormalmice.METHODS TheproliferationofsplenocyteswasdeterminedbyusingMTTassay.Phagocytosisactivityofperitonealmacrophageswasdeterminedbyusingneutralredphagocytosisassay.GriessagentwasusedtoassaytheNO-releasinglevelofperitonealmacrophages.RESULTS Rh1wasshowntopromoteproliferationofsplenocytesdirectly,down-regulatetheConA-inducedproliferationofT-lymphocytes.Rg1cannotinduceproliferationofsplenocytesdirectly,whileRg1100Lg#mL

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caninhibitConA-inducedproliferationofT-lymphocytesobviously.Both

Rh1andRg1showednoeffectonLPS-inducedproliferationofB-lymphocytes.Rg1andRh1werefoundtosignificantlyincreasethephagocytosisandNO-releasinglevelofperitonealmacrophages,whiletheeffectofRh1isweakerthanthatofRg1.CONCLUSION Theimmuno-regulationeffectofRg1maybecarriedoutbybothRg1anditsmetaboliteRh1.Theirfunctionsonotherimmunocytesstillneedfurtherstudy.

KEYWORDS:ginsenosideRh1;ginsenosideRg1;immunocyte