第３６卷第２期 中国预防兽医学报 Ｖｏ１．３６．Ｎｏ．２ ２０１４年２月 Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｖｅ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｆｅｂ．２０１４ ｄｏｉ：１０．３９６９￣．ｉｓｓｎ．１００８－０５８９．２０１４．０２．０９ 鼻气管鸟杆菌ＴａｑＭａｎ荧光定量ＰＣＲ检测方法的建立 李富祥 ，段志华 ，赵文华 ， 信爱国 ，杨仕标 ，李华春 （１．云南省畜牧兽医科学院，云南昆明６５０２２４；２ 保山市动物疾病预防控制中心，云南保山６７８０００） 摘 要：为建立鼻气管鸟杆菌（ＯＲＴ）ＴａｑＭａｎ荧光定量ＰＣＲ检测方法，本研究根据ＯＲＴ １６Ｓ ｒＲＮＡ基因的保 守序列设计特异性引物和ＴａｑＭａｎ探针，通过优化反应条件、特异性、敏感性、重复性试验和临床样品的检测， 建立了ＯＲＴ ＴａｑＭａｎ荧光定量ＰＣＲ检测方法。实验结果表明：该方法具有良好特异性；最低可以检测到１．０９ｘ１０ 拷贝／“Ｌ的标准品阳性质粒；批内和批间变异系数均小于３％；２３份临床样品检测的阳性率为４８％。该方法可 以用于鸡ＯＲＴ感染的早期诊断及ＯＲＴ的快速鉴定和定量分析。 关键词：鼻气管鸟杆菌；ＴａｑＭａｎ荧光定量ＰＣＲ；１６Ｓ ｒＲＮＡ基因 中图分类号：￥８５２．６１ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００８．０５８９（２０１４）０２．０１２１．０４ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ＴａｑＭａｎ ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ ＰＣＲ ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＯｍｉｔｈｏｂａｃｔｅｌＩｌｕｍ ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅａｌｅ ＬＩ Ｆｕ－ｘｉａｎｇ ，ＤＵＡＮ Ｚｈｉ－ｈｕａ ，ＺＨＡＯ Ｗｅｎ—ｈｕａ ，ＸＩＮ Ａｉ－ｇｕｏ ，ＹＡＮＧ Ｓｈｉ—ｂｉａｏ ，ＬＩ Ｈｕａ—ｃｈｕｎ ’ （１．Ｙｕｎｎａｎ Ａｎｉｍａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｋｕｎｍｉｎｇ ６５０２２４，Ｃｈｉｎａ； ２．Ｂａｏｓｈａｎ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｄ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ，Ｂａｏｓｈａｎ ６７８０００，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｏ ｅｓｔａｂｌｉｓｈ ａ ｒａｐｉｄ ａｎｄ ｈｉｇｈ ｔｈｒｏｕｇｈ－ｐｕｔ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｏｍｉｔｈｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅａｌｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ，ａ ＴａｑＭａｎ ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ ａｓｓａｙ ｗａｓ ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｂａｃｔｅｒｉａ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ａ ｐａｉｒ ｏｆ ｐｒｉｍｅｒｓ ａｎｄ ｏｎｅ ＴａｑＭａｎ ｐｒｏｂｅ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ａｃｃｏｒｄｉｎｇ ｔｏ ｔｈｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅｌ６Ｓ ｒＲＮＡ ｇｅｎｅ ｏｆ Ｏ．ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅａｌｅ，ｗｈｉｃｈ ｗａｓ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｂｙ ＰＣＲ ａｎｄ ｃｌｏｎｅｄ ｉｎｔｏ ｐＭＤ１９－Ｔ ｔｏ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ ｓｔａｎｄａｒｄ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｌａｓｍｉｄ ｏｆ ｐＭＤ－１６Ｓ．Ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ，ｔｈｅ ｔｅｓｔ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｉｓ ｍｅｔｈｏｄ ｗａｓ ｓｐｅｃｉｉｆｃ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ Ｏ．ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅａｌｅ ｗｉｔｈ ａ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｌｉｍｉｔ ｏｆ １．０９ ｘ ｌ０。ｃｏｐｉｅｓ／ＩｘＬ，ａｎｄ ｈａｄ ｎｏ ｃｒｏｓｓ—ａｍｐｌｉｉｆｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｏｔｈｅｒ ｃｈｉｃｋｅｎ ｂａｃｔｅｒｉａ，ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ Ｅ．ｃｏｌｉ，Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ，Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ，Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ，Ｒ．ａｎａａｐｅｓｔｉｆｅｒ，Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ，Ｈ．ｐａｒａｇａｌｌｉｎａｒｕｍ， Ｐ．ｍｉｒａｂｉｌｉｓ ａｎｄ Ｇ．ａｎａｔｉｓ．Ｔｈｅ ｒｅｐｅａｔａｂｉｌｉｔｙ ｔｅｓｔｓ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｉｎｔｅｒ－ａｎｄ ｉｎｔｒａ－ｖａｒｉａｔｉｏｎ ｗｅｒｅ ｌｅｓｓ ｔｈａｎ ３％．Ｔｈｅｒｅｆｏｒｅ．ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ａｐｐｌｉｅｄ ｉｎ ｅａｒｌｙ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ Ｏ．ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅａｌｅ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ，ｒａｐｉｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ａｓｓａｙ ｏｆ ｔｈｅ ｂａｃｔｅｒｉａ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｏｍｉｔｈｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅａｌｅ；ＴａｑＭａｎ ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ；１６Ｓ ｒＲＮＡ ｇｅｎｅ 鼻气管鸟杆菌（Ｏｍｉｔｈｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅａｌｅ， 增高，产蛋鸡的产蛋量减少。各种家禽和野禽对 ＯＲＴ）感染是禽类的一种接触性传染疾病，其临床症 ＯＲＴ均易感，该病呈世界分布［１＿２］。近年来，我国的 状主要表现为流鼻液、呼吸紊乱、死亡率和淘汰率 多地 报道了ＯＲＴ感染，本研究室也于２０１ １年在 ＊Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ａｕｔｈｏｒ 收稿日期：２０１３．０５．０２ 基金项目：云南省农业科技创新工程（２００８ＬＡ０１９）；云南省自然科学基金（２０１０ＺＣ２２８） 作者简介：李富祥（１９７９一），男，云南曲靖人，助理研究员，主要从事动物微生物及免疫学研究 通信作者：Ｅ－ｍａｉｌ：ｈｕａｃｈｕｎｌｉ＠ｈｏｔｍａｉｌ．ｃｏｍ 中国预防兽医学报 ２０１４焦 云南分离到肉鸡和蛋鸡ＯＲＴ，证明了鸡ＯＲＴ感染 在云南的存在。该病给养禽业造成严重的经济损 失，为此，建立早期快速检测方法对ＯＲＴ感染的预 防和控制具有重要的意义。 在ＯＲＴ的病原检测方面，国外已经有ＰＣＲ检 测方法的报道【 。本研究首次建立了ＯＲＴ ＴａｑＭａｎ 荧光定量ＰＣＲ检测方法，对ＯＲＴ感染的早期诊断、 ＯＲＴ的快速鉴定和定量提供了快速及高通量的检测 方法。 １材料和方法 １．１ 菌株及临床样品鸡ＯＲＴ ＹＮ１１０６１株（基因登 录号ＫＣ３０５８４６），副鸡嗜血杆菌（Ｈ．ｐａｒａｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）［￣、 鸭源鸡杆菌（Ｇ．ａｎａｔｉｓ）、鸡奇异变形杆菌（Ｐ．ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）、 鸡金黄色葡萄球菌（Ｓｔａｐｈｆｌｏｃｏｃｃｕｓ）、鸡大肠杆菌 （Ｅ．ｃｏｌｉ）、鸡沙门氏菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、鸡链球菌 （Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、鸭疫里默氏杆菌（Ｒ．ａｎａ ｅｓｔｉｆｅｒ）和鸡肠 球菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）均由云南省热带亚热带动物病毒 病重点实验室分离鉴定和保存。２３份具有鼻炎样症 状鸡的临床样品（１８份棉拭子和５份肺脏样品）来自 云南３个地区的规模化养鸡场。 １．２引物和探针设计应用Ｂｅａｃｏｎ Ｄｅｓｉｇｎｅｒ ７．７软 件对ＧｅｎＢａｎｋ中登录的ＯＲＴ １６Ｓ ｒＲＮＡ基因序列 （ＫＣ３０５８４６）设计引物与探针。上下游引物分别为 ＯＲＴ—ｑＰＣＲ－Ｐｆ： ５’－ＣＡＧＴＡＡＡＣＧＡＴＧＣＴＡＡＣＴＣ一３’和 ＯＲＴ—ｑＰＣＲ—Ｐｒ： ５＇－ＣＡＧＧＴＧＧｃＴＡＡＣＴＴＡＴＣＡ一３’；特 异性探针ＯＲＴ．ｑＰＣＲ．Ｐｒｏｂｅ：５＇－ＦＡＭ．ＣＧＣＴＴＧＧＴＣＴ ＣＣＧＡＡＧＡＴＣＡＣ．ＢＨＱ１．．３，引物和探针均由Ｉｎｖｉｔｒｏ． ｇｅｎ公司合成。ＯＲＴ的普通ＰＣＲ鉴定引物按参考文 献［１，６］设计：ＯＲＴ．Ｐｆ：５’．ＧＡＧＡＡＴＴＡＡＴＴＴＡｃＧＧＡ ＴＴＡＡＧ．３’和ＯＲＴ．Ｐｒ： ５’．ＴＴＣＧＣＴＴＧＧＴＣＴＣＣＧＡＡＧ ＡＴ．．３，该对引物扩增ＯＲＴ １６Ｓ ｒＲＮＡ群特异性基因 片段（７８４ ｂｐ），由上海生工生物工程技术服务有限公 司合成。 １．３主要试剂细菌基因组提取试剂盒、ＲｅａｌＭａｓ． ｔｅｒＭｉｘ（Ｐｒｏｍｂ）Ｋｉｔ购自天根生化科技（北京）有限公 司；２ ｘＥａｓｙ Ｔａｑ ＰＣＲ ＳｕｐｅｒＭｉｘ和Ｔｒａｎｓ ２Ｋ ｐｌｕｓ ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ购自北京全式金生物技术有限公司； ｐＭＤ１９．Ｔ载体试剂盒购自ＴａｋａＲａ公司；ＤＮＡ胶回 收试剂盒购自生工生物工程（上海）股份有限公司。 １．４荧光定量ＰＣＲ重组质粒标准品的制备采用 细菌基因组提取试剂盒提取ＯＲＴ基因组ＤＮＡ作为 模板，以引物ＯＲＴ．ｑＰＣＲ－Ｐｆ和ＯＲＴ．ｑＰＣＲ－Ｐｒ ＰＣＲ扩 增获得目的片段，克隆至与ｐＭＤ１９．Ｔ载体中，构建 重组质粒ｐＭＤ．１６Ｓ，重组质粒经ＰＣＲ鉴定正确后， 经紫外分光光度计测定其浓度并换算成拷贝数，作 为荧光定量ＰＣＲ标准品。 １．５ 荧光定量ＰＣＲ反应条件的优化及标准曲线的 建立 以ｐＭＤ．１６Ｓ标准品作为模板进行反应体系的 优化，对模板浓度（１．０９ｘ１０ 拷贝／ Ｌ～１．０９Ｘ１０：拷 贝／ Ｌ）、引物浓度（０．１ ｉｘｍｏｌ／Ｌ￣０．５ Ｉｘｍｏｌ／Ｌ）和探针 浓度（０．１￣ｍｏｌ／Ｌ～０．５￣ｍｏｌ／Ｌ），以相同反应条件 （９５℃３ ｍｉｎ；９５℃５ Ｓ、６０℃３０ Ｓ，４０个循环）进 行反应，退火时检测荧光信号，最终确定其最佳引 物和探针的终浓度。利用ＡＢＩ ７５００ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ｖ２．０．１ 分析软件自动生成标准曲线。 １．６ 特异性试验 分别提取ＯＲＴ、Ｈ．ｐａｒａｇａｌｌｉ． ｎａＦｕｍ、 Ｇ ａｎａｔｉｓ、Ｐ ｍｉｒａｂｉｌｉｓ、 Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、 Ｅ ｃｏｌｉ、 Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、 Ｓｔｋｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｒ ａｎａｔｉｐｅｓｔｉｆｅｒ、 Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ的基因组ＤＮＡ，作为荧光定量ＰＣＲ反 应模板，同时设立阳性和阴性对照，以最佳反应条 件进行荧光定量ＰＣＲ检测。 １．７敏感性试验将标准品１０倍系列稀释１Ｏ个梯 度（１．０９ｘ１０ 拷贝／ Ｌ～１．０９ｘ１０ 拷贝／ Ｌ），分别作 为模板，以最佳反应条件进行检测，确定反应的最 小检出量。同时以同一ＯＲＴ基因组ＤＮＡ样品进行 １０倍系列稀释７个梯度，每个稀释度取等量体积分 别进行荧光定量ＰＣＲ反应和普通ＰＣＲ反应，比较 其检测的敏感性。 １．８重复性试验以１份ＯＲＴ基因组ＤＮＡ样品的 １０ｏ、１０～、１０。、１０。共４个稀释度的样品分别作为 模板，每个样品做３个重复检测进行批内重复性试 验；以４次不同批次提取的ＯＲＴ基因组ＤＮＡ样品 分别作为模板，每个样品做３个重复检测进行批间 重复性试验，根据ｃｔ值计算变异系数（ｃｖ），评价该 方法的稳定性。 １．９临床样品的检测分别提取２３份Ｉ临床样品的 基因组ＤＮＡ作为模板。采用建立的荧光定量ＰＣＲ 进行检测，计算阳性率。 ２ 结 果 ２．１ 标准品的制备 以ＯＲＴ基因组作为模板， 中国预防兽医学报 ２０１４短 ２．５重复性试验 以不同稀释度及不同批次的 ＯＲＴ基因组ＤＮＡ样品作为模板进行荧光定量ＰＣＲ 的批内和批间重复性试验。结果显示３次批内和批 间重复性试验的变异系数均小于３％（表１），表明 该方法具有较好的重复性。 表１ 荧光定量ＰＣＲ的重复性试验 Ｔａｂｌｅ ｌ Ｔｈｅ ｒｅｐｒｏｄｕｃｉｂｉｌｉｔｙ ｔｅｓｔ ｏｆｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ １ｏｏ ｌＩ．９７￣０．１７ １．４ｌ １１．７５±０．３３ ２．７７ １ｏ １５．Ｏ５±０．１９ １．２４ １４．９３￣０．０８ ０．５４ １０２ ｌ８．４５±Ｏ．１５ ０．８０ １８．３８￣０．１５ ０．８２ １０３ ２１．９８±０．２７ １．２３ ２１．７１±０．２９ １．３５ ２．６临床样品的检测利用荧光定量ＰＣＲ对２３份 临床样品进行检测，结果阳性１１份，阴性１２份， 阳性率为４８％（１１／２３），略高于ＯＲＴ分离率３９％ （９／２３），表明该方法可以直接用于临床样品的检测。 ３讨 论 ＯＲＴ血清型众多，迄今为止，ＯＲＴ已有１８个 不同的血清型，分别以Ａ～Ｒ来命名，其中Ａ型是 最流行的血清型［７］，然而ＯＲＴ分子流行病学研究表 明，全球大部分来源于家禽的ＯＲＴ分离株的基因型 属于同一亚群，具有很高的同源性【 。不同ＯＲＴ菌 株的１６Ｓ ｒＲＮＡ基因序列同源性研究表明，来源于 鸡、火鸡、鹌鹑和风凤头鹰的不同菌株之间的核苷 酸同源性高达９７％～１００％【”，ＯＲＴ １６Ｓ ｒＲＮＡ基因 保守性和变异性为建立其群特异性ＴａｑＭａｎ荧光定 量ＰＣＲ方法提供了实验依据。因此，本研究通对 ＧｅｎＢａｎｋ中登录的ＯＲＴ １６Ｓ ｒＲＮＡ基因序列进行比 对分析，选择群特异性基因片段作为引物和探针设 计的靶基因，通过优化反应条件，首次建立了ＯＲＴ 群特异性ＴａｑＭａｎ荧光定量ＰＣＲ方法。 该ＴａｑＭａｎ荧光定量ＰＣＲ方法与鸡的其它常见 致病菌之间无交叉反应，具有高度的特异性。敏感 性试验表明，该方法最低可以检测到１．０９ｘ１０：拷贝 ／ Ｌ的标准品阳性质粒，具有很好的敏感性，并且 其敏感性比普通ＰＣＲ提高了将近１００倍。该方法批 内和批问变异系数均小于３％，具有很好的重复性。 采用该方法对２３份临床样品进行ＴａｑＭａｎ荧光 定量ＰＣＲ检测，ＯＲＴ阳性率为４８％，而ＯＲＴ细菌 分离率为３９％。其阳性率高于细菌分离率的原因可 能是由于有的病料杂菌过多，在营养琼脂培养板上 生长过于旺盛而掩盖了ＯＲＴ的生长。另外，本研究 建立的方法敏感性比普通ＰＣＲ的敏感性提高将近 １００倍，可以用于临床样品的检测。该方法的建立 为ＯＲＴ感染的早期快速诊断及ＯＲＴ分离株的快速 鉴定和定量提供了新方法。 参考文献： ［１］ Ｃｈｏｕ Ｃｈｕｎｇ－Ｈｉｓ，Ｌｉｎ Ｓｈｉｎ－Ｙｉｎｇ，Ｃｈｅｎ Ｃｈｉｏｕ－Ｌｉｎ，ｅｔ ａ１．Ｕｓｅ ｏｆ ｒａｎｄｏｍ ａｍｐｌｉｉｆｅｄ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ ＤＮＡ ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ ｓｉｎＮｅ—ｅｎｚｙｍｅ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｌｅｎｇｔｈ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｙｐｉｎｇ ｏｆ Ｏｍｉｔｈｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅａｌｅ ｓｔｒａｉｎｓ［Ｊ］．Ａｖｉｎａ Ｄｉｓ，２００９，５３ （１）：１０８—１１４． ［２］ 马保华，毕英佐，吕平等．鼻气管鸟杆菌病的研究进展［Ｊ］． 中国预防兽医学报，２００２，２４（３）：２３２．２３４． ［３］ 陈小玲，宋程，罗延荣，等．鼻气管鸟杆菌中国株的鉴定 ［Ｊ］．中国家禽，２００４，３６（１８）：１０．１２． ［４］ 吴海洋，刁有祥，李瑶瑶，等．山东省鸡鼻气管鸟杆菌的分 离与鉴定［Ｊ］＿西北农林科技大学学报（自然科学版），２０１０， ３８（７）：１－６． ［５５］ 刘爱晶，番青，田德雨，等．鼻气管鸟疫杆菌株的分离鉴定 及最低抑菌浓度测定［Ｊ］ｌ中国农业大学学报，２０１２，１７（２）： １２４．１２７． ［６ ６］Ｔｈａｃｈｉｌ Ａ Ｊ，Ｖｅｌａｙｕｄｈａｎ Ｂ Ｔ，Ｌｏｐｅｓ－Ｂｅｒｋａｓ Ｖ Ｃ，ｅｔ ａ１．Ａｐｐｌｉ— ｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈｍｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｉｎｇ ｔｏ ｄｉｆｅｒｅｎｔｉａｔｅ Ｏｍｉｔｈｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅａｌｅ ｉｓｏｌａｔｅｓ【Ｊ］．Ｊ Ｖｅｔ Ｄｉａｇｎ Ｉｎｖｅｓｔ， ２００７，１９（４）：４１７—４２０． ，［７】 李富祥，李华春，许琳，等．副鸡嗜血杆菌的分离鉴定及 １６Ｓ ｒＲＮＡ序列分析［Ｊ］．中国动物传染病学报，２０１２，２０ （４）：３２—３８． ［８］ Ｈａｆｅｚ Ｈ Ｍ．Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ Ｏｍｉｔｈｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅａｌｅ［Ｊ］． Ｉｎｔ Ｊ Ｐｏｕｌｔ Ｓｃｉ，２００２，１（５）：１１４—１１８． （本文编辑：彭永刚）