多孔羟基磷灰石血管化实验研究

多孔羟基磷灰石血管化实验研究

魏人前1 杨志明2

(1.广东省佛山市第二人民医院骨科 广东佛山 528322; 2.四川大学华西医院干细胞与组织工程研究室 成都 610041)【摘要】目的 加速多孔羟基磷灰石血管化,采用复合血管内皮细胞生长因子(VEGF)及内植血管束。方法 采用新西兰大白兔为实验对象,将复合VEGF及内植股血管束的多孔羟基磷灰石放在兔的左侧大腿肌群内,不复合VEGF的多孔羟基磷灰石放在对侧进行对照,分别在术后1、2、3个月后处死动物,通过大体观察、墨汁灌注及组织学分析等方法进行观察。结果 通过对术后1、2、3个月的观察,多孔羟基磷灰石内单位面积上血管数目增多,但复合血管内皮细胞生长因子和(或)内植血管束的多孔羟基磷灰石的增多在同期较对照组明显。结论 复合VEGF及内植血管束能加速多孔羟基磷灰石血血管化。【关键词】多孔羟基磷灰石 血管内皮细胞生长因子 股血管束 血管化【中图分类号】R543【文献标识码】A【文章编号】1674-0742(2012)01(a)-0014-02

The Experimental Study of Porous Hydroxyapatite Vascularization

WEI RenQian1 YANG Zhiming2

1.Department of Orthopedic Surgery,The Second People's Hospital of Foshan City,Guangdong 528000,China; 2.Division of Stem Cell and Tissue Engineering,West China Hospital of Sichuan University,Sichuan 610041,China

【Abstract】Objective To improve porous hydroxyapatite (HA) vascularization, HA were combined with vessel endothelium growthfactor (VEGF) and planted femoral vessel bundle.Methods Nine New Zealand white rabbits were adopted in the study.The HA withVEGF and /or plantation of femoral vessel bundle were placed in left thigh muscles,and the HA without VEGF were placed in rightthigh muscle,At 1st、2nd and 3rd month after operation,behavior of the rabbits was observed,then these animals were sacrificedand the specimens were examined by ink irrigation through femoral artery and histological examination.Results At 1st、2nd and 3rdmonth after operation,the blood vessel number per unit within HA increased,but the HA which were combined with VEGF and/or planted femoral vessel bundle were more evident than one which were not combined with VEGF and/or planted femoral vesselbund.Conclusion The HA vascularization with VEGF and plantation of vessel bundle were sped up.【Key Words】Porous HA;VEGF;Femoral vessel bundle;Vascularization

.com.cn. All Rights Reserved.羟基磷灰石(hydroxyapatite,HA)主要成分是磷酸钙,与人体骨中的无机盐类似,在临床上被运用为骨缺损的填充材料和人工假体涂层[1],而且多孔羟基磷灰石义眼座作为理想的眶内植入物

羟基磷灰石含有规则的相互联通的微已被广泛接受和应用[2～3]。

孔通道,这种微孔结构允许纤维血管长入并与周围组织融为一体,达到最佳的生物整合效果,称为移植体血管化,因此,加速羟基磷灰石血管化,使之与周围组织较快地溶为一体,在临床更为广泛应用,降低感染、排斥率,促进骨愈合具有十分重要的意义。本实验采用多孔羟基磷灰石与VEGF复合,和(或)同时内植血管束,加速其血管化,取得较好的效果,报道如下。1 材料与方法1.1 材料

多孔羟基磷灰石,由清华大学材料系提供,其微孔径为200～300m;VEGF由Sigma公司生产。1.2 方法

1.2.1 VEGF溶液配制 将VEGF粉末溶解于平衡液中,配成200g/mL,常规加入庆大霉素(8mg/mL)。

1.2.2 羟基磷灰石制作 将多孔羟基磷灰石切割成圆柱形,长为10mm,直径为6mm,中央钻2mm孔,共36根,采用高压消毒,温度为1200℃,然后将其中12条浸泡在VEGF溶液中备用。

1.2.3 手术方法 选择9只新西兰大白兔,体重为2～3kg,雌雄不拘,采用自身双侧对照实验方法。

将兔仰卧捆绑,双侧大腿腹侧中份剃毛,用0.5%利多卡因局部麻醉,作5cm长纵行切口,切开皮肤、皮下组织、阔筋膜,显露双侧股动、静脉束,左侧切口内距腹股沟韧带游离15mm长处结扎、切断,将血管束穿过羟基磷灰石中央孔固定在肌筋膜上,用股内侧肌群覆盖,相对应的一条羟基磷灰石放在右侧股血管旁,同时双侧各置一条羟基磷灰石于股内侧肌袋内,其中左侧肌袋一条HA经VEGF浸泡过,右侧未处理,术后全层缝合皮肤及皮下组织。

1.2.4 观察方法 术后观察伤口的局部情况,有无红肿及溃疡形成,并分别于术后1、2、3个月后经耳缘静脉注入空气处死动物,观察羟基磷灰石表面情况,及经墨汗灌注情况,标本用10%福尔马林固定,脱钙、脱水、石蜡包埋,组织切片厚度为4m,HE染色,光镜下观察。

1.2.5 统计学分析 组织切片HE染色光镜下计数血管数目,每个标本随机选择12张切片计数,采用SPSS 11.0进行数据处

-理,数据以(x±s)表示,行t检验。2 结果

2.1 大体观察

兔术后无不良反应,伤口无红肿、溃疡出现,无皮下积液,切口缝线于术后2周自动脱落。

术后1个月,羟基磷灰石有一薄层白色冻状膜包绕,与周围肌筋膜粘附在一起,其表面可见红色血管浸润,呈散在针尖状分布,其中左侧标本较右侧表面鲜红,内植入血管束的HA组与未植入血管束表面颜色无显著差别;未植入血管束横切面示:复合VEGF组其外周有2/3有血管浸润,单纯HA组仅仅外周1/3有血管清润。植入血管束

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中外医疗 CHINA FOREIGN MEDICAL TREATMENT

基 础 医 学

HA组其横切面示:其中央侧与外侧有血管浸润,交界处血管浸润少;将股静脉近端夹住,自股动脉灌注墨汁,可见羟基磷灰石中央侧横切面上有较多黑色针尖样出现,外表面有少许黑色针尖样出现。

术后2个月:羟基磷灰石表面为白色韧性膜状物包裹,与周围肌筋膜融合为一体。表面针尖状血管明显较术后1个月多,左侧标本较右侧红润,植入血管束HA组标本较未植入血管束HA组整个横切面血管浸润分布均匀,且左侧标本单位面积浸润的血管数较右侧多,说明植入血管束标本已安全血管化;复合VEGF组整个横切面血管浸润,但外侧较内侧密;单纯HA组中央也有血管浸润,但密度不如复合VEGF组,说明单纯HA组血管化不完全;墨汁灌注示:整个横断面及表面均呈黑色针尖样分布,并且周围肌肉软组织可见墨汁经小血管流入其内,染成黑色。

术后3个月:羟基磷灰石其表面颜色未及以前红润,但血管较前变粗,且左侧较右侧颜色深;横断面示:单纯HA组血管分布仍不均匀,但较术后2个月增多,植入血管束HA组、复合VEGF组标本其横切面血管浸润更多、均匀。说明单纯HA组标本血管化仍不完全充分;墨汁灌注同术后2个月。2.2 组织学分析

羟基磷灰石内未见成骨细胞及骨样组织。术后1个月:各组组织切片示羟基磷灰石内胶原纤维、毛细血管和成纤维细胞外周环绕少量炎性细胞,植入血管束的HA组和复合VEGF组,单位面积浸润的血管数比单纯HA组多(P＜0.05);术后2个月,切片示新生血管管径增粗,成纤维细胞减少,结缔组织纤维成熟,炎性细胞消失,单位面积浸润的血管数,植入血管束的HA组和复合VEGF组

比单纯HA组仍然多(P＜0.05)。

术后3个月各个切片显示新生血管管径增粗,相对比较均匀,各组单位浸润的血管数无明显统计学

差异(P＞0.05)。

墨汁灌注切片示规则的黑色分布,并随着时间推后,在相同视野下墨汁分布增多、增粗,越不规则,说明观察时间点越长,血管在各个不同方向浸润、交织,增粗。3 讨论

羟基磷灰石由海洋生物珊瑚虫所“建造”的珊瑚加工而来,其主要成份为磷酸钙,这种物质内部有彼此相连的微孔,类似人骨骼的哈佛氏系统,这种多孔构筑为血管结缔组织向内生长提供理想的框架。羟基磷灰石有良好的生物相容性,无毒、无刺激,不引起明显的异物反应,因此兔的术后无不良反应,植入局部无红肿等,组织学未发现HA与宿主组织之间有水肿、血栓、巨噬细胞浸润等排斥反应表现。

HA材料促进骨缺损修复的机理在于其在缺损处为修复早期

的微血管形成及宿主骨系细胞的附着提供支撑[4]。

骨缺损部位修复需在植入材料再血管化后才能进行。新生血管沿材料内的多孔结构爬行,使局部血液流通。保证了骨组织的正常生长代谢。HA晶体的刺激则使骨细胞活跃而围绕HA颗粒并以其为中心形成成骨区,即多中心成骨。在骨盐沉积过程中由HA提供晶核以加速钙化成骨,其发挥的是骨传导作用。Grenga TE[5]认为HA具有骨引导性(Osteoconducivity),而无骨诱导性(Osteoinductivity),因此本试验将HA材料植入软组织内,组织切片未见骨样组织形成。

实验采用200～300m孔径的多孔羟基磷灰石人工骨,孔隙率达到90%以上,它具以下优点:(1)适当的孔隙率,保证其一定的力学性能。虽然300～500m孔径的材料是骨向内生长的理想材料,但其脆性大,抗压性差,没有实用价值。但空隙率过低,硬度高,代谢降解缓慢,不利于血管长入。(2)200～300m的孔径既方便生长因子或细胞的复合,又利于血管和骨的向内长入,而且能够较好的发挥支架作用,达到骨传导功能。

Joneathan J[6]将HA植入眼眶,其完全血管化为4～8个月。

只有HA完全血管化,才能使HA与周围组织融为一体,明显降低排斥反应及植入物感染和移位的发生率[7],而HA植入术后血管化延

2012 NO.01CHINA FOREIGN MEDICAL TREATMENT中外医疗迟,是HA暴露及感染的主要原因[8]。

如何促进羟基磷灰石血管化,人们探索运用组织工程方法将羟基磷灰石与血管内皮细胞或骨髓间充质干细胞共同培养[9～10],或加入促血管生长药物以期通过

刺激机体代谢增加[11～12],从而加速羟基磷灰石血管化。

VEGF是一种特异作用于血管内皮细胞的强效多功能细胞因子,能诱导内皮

细胞分裂、增生、迁移和形成管腔[13]。

在生理状态及肿瘤血管生成中,VEGF是内皮细胞的一种强力的生存因子,可以诱导内皮细胞中抗凋亡蛋白的表达。VEGF特异性地作用于内皮细胞,使其分裂增生、转移,增加血管通透性,促进或诱导新生血管形成。本研究发现复合VEGF的HA颗粒之间微血管及成纤维细胞较未复合VEGF的HA丰富,提示VEGF可能早期诱导微血管和纤维组织向HA颗粒之间生长的功能。本试验HA内植血管束,1个月左右接近完全血管化,较复合VEGF的HA组更加明显,而未植血管束,术后3个月仍未完全血管化。因此,内植血管束能明显加速HA血管化。由于植入HA体内周围有知名血管或无名血管,取材简单方便,有较好的临床应用前景,值得推广。参考文献

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【收稿日期】 2011-11-10

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