http://www.solarbio.com腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（AGP）活性检测试剂盒说明书微量法注意：正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定。货号：BC0435规格：100T/96S产品内容：提取液：液体100mL×1瓶，4℃保存；试剂一：液体20mL×1瓶，4℃保存；试剂二：粉剂×1瓶，-20℃保存；临用前加入6.4mL双蒸水充分溶解备用；用不完的试剂仍-20℃保存；试剂三：粉剂×2瓶，4℃保存；临用前加入2mL双蒸水充分溶解备用；用不完的试剂仍-20℃保存；试剂四：粉剂×2支，-20℃保存；临用前每支加入500μL双蒸水充分溶解备用；用不完的试剂-20℃保存；试剂五：液体250μL×2支，-20℃保存。产品说明：AGP(EC2.7.7.21)主要存在于植物中，催化葡萄糖-1-磷酸与ATP反应生成淀粉合成的直接前体ADPG，是植物淀粉生物合成的主要限速步骤。AGP催化的逆向反应生成G1P，在反应体系中添加的磷酸己糖变位酶和6-磷酸葡萄糖脱氢酶依次催化生成6-磷酸葡萄糖酸和NADPH，340nm下测定NADPH增加速率，即可计算AGP活性。需自备的的仪器和用品：紫外分光光度计/酶标仪、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板（UV板）、研钵、冰和蒸馏水操作步骤：一、粗酶液制备称取约0.1g组织加入1mL提取液，冰浴中匀浆。10000g，4℃离心10min，取上清，置冰上待测。二、测定步骤第1页共3页http://www.solarbio.com1、分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零。2、在EP管中按顺序加入下列试剂（如果一次性测定样本较多，可以将试剂一、二按比例配成混合液1，将试剂一、三、四和五按比例配成混合液2）试剂名称（μL）试剂一试剂二样本测定管40648混匀，30℃保温15min，置沸水浴中1min（盖紧，防止水分散失），冰浴迅速冷却后加入下列试剂（试剂一、试剂三置37℃保温10min以上。）试剂一试剂三试剂四试剂五1204084混匀后立即在340nm波长下记录初始吸光度A1和2min后的吸光度A2，计算ΔA=A2-A1。三、AGP活性计算a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下：1、按样本蛋白浓度计算：单位的定义：每mg组织蛋白在反应体系中每分钟催化产生1nmolNADPH定义为一个酶活性单位。AGP活性（U/mgprot）＝ΔA÷ε÷d×V反总÷T÷（Cpr×V样本）=380.5×ΔA÷Cpr。此法需要自行测定粗酶液蛋白质浓度。2、按照样本鲜重计算单位的定义：每g组织在反应体系中每分钟催化产生1nmolNADPH定义为一个酶活力单位。AGP活性（U/g鲜重）＝ΔA÷ε÷d×V反总÷T÷（W×V样本÷V提取）=380.5×ΔA÷W。T：反应时间，15min；ε：NADPH消光系数，6.22×10mL˙nmol-3
-1
˙
cm；V反总：反应总体积，0.284mL；-1
d:石英比色皿光程，1cm；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；V样本：加入的样本体积，0.008mL；V提取：加入的提取液体积，1mL；W：样本鲜重，g。b.使用96孔板测定的计算公式如下：第2页共3页http://www.solarbio.com1、按样本蛋白浓度计算：单位的定义：每mg组织蛋白在反应体系中每分钟催化产生1nmolNADPH定义为一个酶活性单位。AGP活性（U/mgprot）＝ΔA÷ε÷d×V反总÷T÷（Cpr×V样本）=634.1×ΔA÷Cpr。此法需要自行测定粗酶液蛋白质浓度。2、按照样本鲜重计算单位的定义：每g组织在反应体系中每分钟催化产生1nmolNADPH定义为一个酶活力单位。AGP活性（U/g鲜重）＝ΔA÷ε÷d×V反总÷T÷（W×V样本÷V提取）=634.1×ΔA÷W。T：反应时间，15min；ε：NADPH消光系数，6.22×10-3mL˙nmol-1˙cm-1；V反总：反应总体积，0.284mL；d:96孔板光程，0.6cm；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；V样本：加入的样本体积，0.008mL；V提取：加入的提取液体积，1mL；W：样本鲜重，g。第3页共3页