His标签融合蛋白纯化步骤

His标签融合蛋白纯化步骤

（Ni-NTA琼脂糖凝胶亲和层析纯化法）

1. 缓冲液配制

 Lysis Buffer 1 (under native condition) 0.5mM Tris.HCl 0.5M NaCl

5%(w/v) glycerol 10mM Imidazol

100mg(1mg/ml)lysozyme (Purification of 6xHis-tagged proteins from E.coli)

1% Nonidet P40 (NP40 = Igepal CA-630 ) 0.25% Tween 20 （or Triton 100） 0.02% NaN3 (Optional)

2 tablets of protease inhibitor cocktail (EDTA free， Recommended)

200 µg(2µg/ml) RNase A (Optional) 1mg (10µg/ml) DNase1 (Optional) 50 mM NaF (Optional) 1mM Na3VO4 (Optional)

+ ddH2O to 100ml, Adjust pH to 8.0 using NaOH

此 lysis buffer 适用于从 E.coli、哺乳动物细胞和昆虫细胞中纯化带His标签的蛋白质。仅在用于裂解 E.coli 细菌时，加入溶菌酶。

Na3VO4是磷酸酶抑制剂，保护磷酸化的蛋白不被磷酸酶还原。NaF是酯酶抑制剂，保护脂蛋白不被酯酶降解。

注意：当使用镍琼脂糖凝胶纯化带His标签的蛋白时，缓冲液中不能加EDTA，因EDTA能使镍从螯合物上脱离，从而使分离介质失去效果。

 Lysis Buffer 2(under denature condition)

50 mM Tris-Cl

8 M Urea (or 6 M Gu-HCl) 10mM Imidazole 0.05% Tween 20

Adjust pH to 8.0 using NaOH

 Dialysis/Tev cleavage Buffer

50 mM Tris-Cl,pH8.0

100 mM NaCl (depends on solubility of protein) 2.5% glycerol 0.5mM EDTA

0.5mM DTT or TCEP

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 缓冲液A：

50mM Tris.HCl

0.5M NaCl 5% glycerol 0.05% Tween 20

用高浓度HCl调节pH值至8.0。

 缓冲液B（洗脱缓冲液）：

50mM Tris-Cl

0.5M NaCl 5% glycerol 0.05% Tween 20 500mM咪唑

用高浓度HCl调节pH值至8.0。

 缓冲液C（咪唑梯度洗脱液）：用缓冲液A和缓冲液B按不同比例配制，配制比例如下（100ml

总体积）：

咪唑浓度 0mM 10 mM 20 mM 50 mM 60 mM 100 mM 150 mM 200 mM 250mM 400 mM 缓冲液A(ml) 100 98 96 90 88 80 70 60 50 20 缓冲液B(ml) 0 2 4 10 12 20 30 40 50 80 各种溶液配制完毕后，最好进行脱气处理，0.45μm滤膜过滤备用。

2. 样品预处理：

按每克湿重菌体/4~5ml Lysis Buffer 的比例充分悬浮离心收集的菌体，置-80ºC 冰箱过夜；在4ºC 融解菌体，vortex 悬浮细菌， 400w功率下，每个循环超声5s，冷却5s，每次10 min，共循环2次破碎菌体；4℃、12000rpm离心30min，收集上清液或者用0.45μm滤膜过滤，并用低浓度NaOH调节 pH至8.0待纯化。

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3. 操作步骤

 介质平衡与亲和

取 1ml Ni-NTA琼脂糖凝胶（金益肽TM NTA 货号：JYT-M0007），置入15ml 离心管中，2000 rpm离心2 min，移去上清液；加入5ml Lysis Buffer，混匀，低速离心，去上清。加入4-5 ml细胞（细菌）裂解液，置于混匀转盘，4ºC低速旋转1小时。

(每个品牌的NI柱载量都不同，金益肽TM NI-NTA琼脂糖凝胶载量>40mg/ml，请根据目标蛋白的浓度、分子量大小、及体积来选取适量的Ni-NTA琼脂糖凝胶)  装柱

1) 将层析柱固定在铁架台或层析架上，封闭层析柱下端出口，向柱内充入纯水，排开层析

柱内空气，先将垫片完全浸没于水面下方，在保持水平的状态下，小心推向底部，避免垫片下方滞留气泡。

2) 打开层析柱下端出口，排出柱中纯水；在液面低至距垫片1~1.5cm高度时封闭下端出口，

用移液管吸取已与样品亲和的介质，将介质加入到层析柱中；在4ºC静置10min，让介质自然沉降。

3) 从上端管口将另一垫片缓慢推至介质沉降平面，使介质表面保持水平状态，注意避免垫

片与介质接触面滞留气泡（如对实验要求并非十分严格，为提高流速，可不覆盖上垫片）。 4) 在使用一段时间后，如果层析柱流速减慢，可先用小镊子沿边缘将垫片推翻，夹出垫片，

倒出介质，清洗或更换新的垫片后，按2）、3）所述步骤重新装柱；或不更换垫片，用细棒搅拌介质，使其疏松，再装入上端垫片。  洗柱：

用5~10倍介质体积含10mM 咪唑缓冲液C洗去层析柱中未结合蛋白； 保留洗涤液，待SDS-PAGE电泳检测无目的蛋白后，再将洗涤液丢弃。  洗脱：

用含20、50、250mM 咪唑的缓冲液C分步洗脱，每个梯度2~3倍介质体积洗脱，分别收集洗脱样品，SDS-PAGE电泳检测蛋白质；

注：纯化过程流速不宜过快，对于1ml介质，流速保持在0.5ml/min为宜。

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