廑Ｉ１幸｝广萄２０１２年第８期 ４１ 检测分析 Ｄ眦ｒｍ ａｔｉＯｎ ａｎｄＡ ｎａｌｙｓｉｓ 高效液祖色谱法检测饲料中的玉米赤霉烯酮 贾 涛 摘要：本文在试验时将试验样品经提取液提取，用 磷酸盐缓冲溶液稀释。用免疫亲和柱（ＩＡＣ）进行净化；净 化后经甲醇洗脱，洗脱液氮气吹干后经流动相溶液复溶， 最后用反相高效液相色谱仪一荧光检测器进行测定：荧光 检测器激发波长２７４ｎｍ处．发射波长４４０ｎｍ处检测吸光 度，同等条件下绘制工作曲线，玉米赤霉烯酮含量与吸光 度值在一定浓度范围内成正比．试样与工作曲线比较定 量。经试验：样品最低检测限可达到０．０１ｍｇ／ｋｇ。标准曲线 相关系数ｒ值ｔ＞０．９９９ ９６９，标准品变异系数（ＣＶ）≤１．６７％， 回收率Ｉ＞９１．Ｏ％．回收率标准偏差≤Ｏ．４７％．重复性试验变 异系数（ＣＶ）≤Ｏ．５９％。 关键词：液相色谱；饲料；玉米赤霉烯酮；检测 １玉米赤霉烯酮的简介 玉米赤霉烯酮是一种具有强烈致畸作用的 生殖系统毒素，会导致家畜生长速度下降、免疫 抑制、繁殖障碍等后果。从而给畜牧业带来严重 威胁。 ２玉米赤霉烯酮产生的原因与污染情况 当空气中相对湿度大于８５％．湿度大于２ＯＱｃ 时．禾谷镰刀菌等能够产生玉米赤霉烯酮的霉菌 就会大量繁殖。从而产生玉米赤霉烯酮毒素。我 国玉米赤霉烯酮的污染也十分普遍．２００４年对小 麦和大麦样品中玉米赤霉烯酮进行监测时．平均 水平均高于５ ｇ／ｋｇ，小麦样品中同时检测出含有 黄曲霉毒素和呕吐毒素：８９％的玉米样品与８０％ 的豆粕样品受到玉米赤霉烯酮的污染 ３对玉米赤霉烯酮进行监测的意义 由于玉米赤霉烯酮的危害性和污染普遍性． 贾涛：北京市饲料监察所，畜牧师，理化检验室检验 员，质量监督员。 ＧＢ １３０７８．２—２００６《饲料卫生标准饲料中赭曲霉 毒素Ａ和玉米赤霉烯酮》中已经规定了饲料中玉 米赤霉烯酮的最高险量不得超过０．５ｍｇ／ｋｇ．因此 对玉米赤霉烯酮进行监测对畜牧业的健康发展 具有非常重要的意义。． ４方法原理 试样经提取液提取．用磷酸盐缓冲溶液稀 释，用免疫亲和柱（ＩＡＣ）进行净化：净化后经甲醇 洗脱，洗脱液氮气吹干后经流动相溶液复溶，最 后用反相高效液相色谱仪一荧光检测器进行测 定；荧光检测器激发波长２７４ｎｍ处，发射波长 ４４０ｎｍ处检测吸光度．同等条件下绘制工作曲 线．玉米赤霉烯酮含量与吸光度值在一定浓度范 围内成正比，试样与工作曲线比较定量。 ５试剂与材料 除非另有规定．本试验使用已知的优级纯试 剂：用水应符合ＧＢ／Ｔ ６６８２—２００８（（分析实验室用 水规格和试验方法》中三级用水的规定。 ５．１甲醇：色谱纯。 ５．２乙腈：色谱纯。 ５．３样品提取溶液：量取乙腈（５．２）８００ｍＬ。与 ２００ｍＬ超纯水混合均匀 ５．４ ０．２ｍｏｌ／Ｌ氢氧化钠溶液：准确称取氢氧化钠 ０．８ｇ，用蒸馏水定容至１００ｍＬ。 ５．５磷酸盐缓冲溶液：准确称取氯化钠８．０ｇ，磷酸 氢二钠１．１６ｇ，磷酸二氢钾０．２ｇ，氯化钾０．２ｇ，用超 纯水溶解并定容至１ ０００ｍＬ容量瓶中．用 ０．０２ｍｏｌ／Ｌ氢氧化钠溶液（５．４）调节ｐＨ值至７．４。 ５．６流动相溶液：准确量取甲醇（４．１）４６０ｍＬ，乙 腈（４．２）４６０ｍＬ．用超纯水定容至１ ０００ｍＬ容量瓶 中，混合均匀，过０．４５１ａ，ｍ有机相滤膜，备用。 检测分析 ４２ 钢材广萄２０１２年第８期 Ｄ眦 ａｔｉＯｎ ａｎｄＡ ａｌｙｓｉｓ ５．７玉米赤霉烯酮标准品：纯度＞ｔ９９．５％。国家标 准物质中心提供。 ５．７．１玉米赤霉烯酮标准贮备溶液 精确称取玉米赤霉烯酮标准品（５．７）５．Ｏｍｇ． 用乙腈（４．２）定容至ｌＯＯｍＬ棕色容量瓶中，混匀； 此标准贮备溶液浓度相当于５０．Ｏｉｘｇ／ｍＬ．置于 一２０℃冰箱中避光保存，有效期１年。 ５．７．２玉米赤霉烯酮标准贮备溶液的校准 每当配制新的玉米赤霉烯酮工作溶液时．将 玉米赤霉烯酮标准贮备溶液重新校准．校准前先 将玉米赤霉烯酮标准贮备溶液恢复至室温。 准确移取玉米赤霉烯酮标准贮备溶液 （５．７．１）４．ＯｍＬ。用乙腈（４．２）定容至２５ｍＬ容量瓶 中．摇匀。用ｌｃｍ石英比色皿在２７４ｎｍ波长处测 量其紫外吸收，根据公式（１）计算玉米赤霉烯酮 的浓度 公式１计算玉米赤霉烯酮的浓度： ｐ：—Ｍ，ｘ１０００ｘＡｘ２５ ８Ｘ４ 式中：ｐ一玉米赤霉烯酮标准贮备溶液的校准 浓度，单位为Ｉｘｇ／ｍＬ； Ｍ广玉米赤霉烯酮的相对分子质量，３１８４； Ａ一紫外吸收值： 一玉米赤霉烯酮在２７４ｎｍ处的吸光系数． １２６２３。 ５．７．３玉米赤霉烯酮标准中间工作溶液 准确移取玉米赤霉烯酮标准贮备溶液 （５．７．１）１０．ＯｍＬ，用提取液（５．３）定容至ｌＯＯｍＬ容 量瓶中，摇匀，此溶液浓度相当于５．０￣ｇ／ｍＬ；置于 ４℃冰箱中避光保存，有效期为６个月。 ５．７．４玉米赤霉烯酮标准曲线工作溶液 准确移取玉米赤霉烯酮标准中间工作溶液 （５．７－３）０．２、０．５、１．０、１．５、２．ＯｍＬ，分别用流动相溶 液（５．６）定容至５０ｍＬ容量瓶中，此标准曲线工作 液浓度分别相当于０．０２、０．０５、０．１０、０．１５、０．２０１ｘｇ／ ｍＬ；置于４℃冰箱中避光保存，有效期为３个月。 ６仪器与设备 ６．１震荡器。 ６．２氮吹仪：带温度控制。 ６．３玉米赤霉烯酮免疫亲和柱：容量Ｉ＞２１ｘｇ玉米 赤霉烯酮。 ６．４旋涡振荡器：０～２ Ｏ００ｄｍｉｎ。 ６．５针管式微孔滤膜：０．２０ｌ￣ｍ。 ６．６高效液相色谱仪：配有荧光检测器。 ７分析步骤 ７．１提取 称取试样１０．０ｇ置于２５０ｍＬ具塞锥形瓶中， 加人１．Ｏｇ氯化钠及２５．ＯｍＬ样品提取液（５＿３），置 于振荡器上震荡６０ｍｉｎ．定量滤纸过滤．准确移取 １０．ＯｒａＬ滤液并加入４０．ＯｍＬ磷酸盐缓冲溶液 （５．５），混合均匀，用玻璃纤维滤纸过滤，至滤液澄 清，备用。 ７．２净化 准确移取１０．ＯｒａＬ处理后的试样溶液注入免 疫亲和柱（６－３），以２０ｍＬ超纯水淋洗柱子，抽干， 准确加入１．５ｍＬ甲醇（５．１）洗脱柱子，收集洗脱液 于５５ｃＩ＝下氮气吹干，用１．０ｍＬ流动相溶液（５．６）复 溶，过０．２０ｕｍ有机相滤膜（６．５），供高效液相色谱 仪检测（６．６）。 ７．３测定 ７．３．１液相色谱测定条件 色谱柱：Ｃ。 柱，柱长１５０ｍｍ，内径４．６ｒａｍ，粒 度５ ｍ（或相当者）；流动相（５．６）；流速：Ｏ．８ｍＬ／ ｍｉｎ；检测波长：激发波长２７１ｎｍ，发射波长 ４４０ｎｍ；进样量：２０１ｘＬ；柱温：室温。 ７．３．２结果计算 试样中玉米赤霉烯酮含量Ｘ以质量分数 （ｍｇ，ｌ【ｇ）表示，单点外标法校正按式２计算；标准 曲线校正按式３计算。 式２： Ｘ：墨 ２ Ｐ，ａｘｍｘＶ ｘＶ＾ｘＶ１ Ｘ一试样中玉米赤霉烯酮的含量．单位为毫克 每千克（ｍｇ／ｋｇ）； Ｐｉ一试样溶液的峰面积值； Ｖ 一试样中加入提取液的体积，单位为毫升 （ｍＥ）； Ｖ 一从提取液中（Ｖ ）分取的溶液体积，单位 为毫升（ｍＬ）； Ｖｍ－试验溶液最终体积（分取体积Ｖ 加入磷 ４，１料广萄２０１２年第８期 ４３ 检测分析 Ｄｅ￡ｅｒｍｉｎａｔｉＯｎ帆 ｏ］ｙｓｉｓ 酸盐缓冲溶液的总体积），单位为毫升（ｍＬ）； Ｖ广分取最终试验溶液（Ｖ ）过免疫亲和柱净 化用的体积，单位为毫升（ｍＬ）； Ｊ ４ Ｖ 一复溶溶液的体积，单位为毫升（ｍＬ）； Ｃｉ一玉米赤霉烯酮标准工作溶液浓度，单位为 微克每毫升（ 咖Ｌ）； ４∞ ６ Ｏ０ ｍ日Ｏ０ ＇０呻 １２ Ｏ０ １．∞ Ｖ 一玉米赤霉烯酮标准溶液进样体积，单位 为微升（ Ｌ）； 一玉米赤霉烯酮标准溶液峰面积值； ｍ一试样质量，单位为克（ｇ）； Ｖ广试样溶液的进样体积，单位为微升（ Ｌ）。 式３： Ｘ： ２ ｍｘＶ ｘＶｌ Ｘ一试样中玉米赤霉烯酮的含量．单位为毫克 每千克（ｍｇ／ｋｇ）； Ｃ一从标准曲线中查得样品溶液的浓度．单位 为微克每毫￣（ｗｇ／ｍＬ）： Ｖ 一试样中加入提取液的体积，单位为毫升 （ｍＬ）； Ｖ 一从提取液中（Ｖ ）分取的溶液体积，单位 为毫升（ｍＬ）； Ｖ 一试验溶液最终体积（分取体积Ｖ 加入磷 酸盐缓冲溶液的总体积），单位为毫升（ｍＬ）； Ｖ广分取最终试验溶液（Ｖ ）过免疫亲和柱净 化用的体积，单位为毫升（ｍＬ）； Ｖ２＿－复溶溶液的体积，单位为毫升（ｍＬ）； ｍ一试样质量，单位为克（ｇ）。 ７．３．３结果表述 计算结果表示到小数点后２位．在重复性条 件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得 超过算术平均值的１５％。 图１ 玉米赤霉烯酮标准品峰谱图 玉米赤霉烯酮空白样品峰谱图 ●１ｎ 图３玉米赤霉烯酮添加样品峰谱图 图４标准曲线图 表１ 玉米赤霉烯酮标准曲线数据 项目 Ｏ．０２１．Ｌｇ／ｍＬ Ｏ．０５￣ｇ，／ｍＬ ０．１Ｏｐ，ｇＣｍＬ Ｏ．１５ｐ，ｇ／ｍＬ ０．２０１．Ｌｇ／ｍＬ 峰面积１２ ４５０ ３５ ０００ ７１ ７３０ １０９ ８６０ １４７ ２９０ ｒ＝Ｏ．９９９９６９ 注：Ｙ＝７．４９ｅ＋０．００５ｘ－２．６４ｅ＋０．００３。 表２玉米赤霉烯酮峰面积值变异系数 项目 Ｏ．０２ｐ，ｇ／ｍＬ Ｏ．０５ｐ，ｇ／ｍＬ Ｏ．１Ｏｗｇ／ｍＬ ０．１５１，ｌ，ｇ／ｍＬ ０．２０ｏ，ｇ／ｍＬ 检测分析 饲料广萄２０１２年第８期 Ｄ ｒｍｉｎａｔｉ。ｎａｎｄＡｎａｌｙｓｉｓ 。２ ４ 表３玉米赤霉烯酮检测回收率 ８．４净化条件的选择 由于乙腈的含量过高能 值偏系 ％％ 低．因此提取溶剂在通过免疫亲和柱之前。需要 雠摒 破坏免疫亲和柱的吸附性能．造成回收效率降 进一步进行稀释。根据实验结果。当饲料样品中 ：刍 杂质干扰比较小时．选择应用２０ｍＬ超纯水作为 淋洗液；当饲料样品中杂质干扰比较大时，选择 ５ ３ ８ ６ ８ ２ ９ ３ 先用１０％甲醇水溶液ｌＯｍＬ淋洗．再用ｌＯｍＬ超 ６ ３ ５ ４ ５ ９ ５ ９ 表４玉米赤霉烯酮重复性试验 ８ ８ ４ ６ ３ Ｏ ２ ３ ８ １ ８结果讨论 ８．１由于玉米赤霉烯酮在粉碎过程中不易挥发 损失．为了提取完全．采用粉碎的饲料及植物原 料为分析试样．粉碎的样品过１ｍｍ筛。并充分混 合均匀。 ８．２提取方式的选择。试验中分别采用震荡和高 速均质提取方式对饲料样品提取．即摇床震荡提 取６０ｍｉｎ和高速均质２ｍｉｎ．回收率结果．两种提 取方式回收率均大于９０％无明显差异 ８－３提取溶液的选择。玉米赤霉烯酮的极性较 高，因此在样品的提取阶段．选择适当极性的提 取溶液对提高回收率十分重要 但是由于免疫亲 和柱的填料含有对玉米赤霉烯酮具有特异吸附 能力的单克隆抗体．它对通过免疫亲和柱的溶剂也 有较为严格的要求：试验中采用甲醇一水（８０：２０）、 乙腈一水（８０：２０）、甲醇一水（９０：１０）、乙腈一水（９０： １０）的回收率比较情况；当使用甲醇一水（８０：２０） 时，回收率约为５０％左右，当使用甲醇一水（９０：１０） 时，回收率约为５５％左右，无明显差异，且回收率 较低，不能满足试验要求；采用乙腈一水溶液（９０： １０）时，回收率约为６０％ ９０％．而采用乙腈一水溶 液（８０：２０）时，回收率基本稳定在９０％左右，因此 本次试验中最终选定乙腈一水（８０：２０）做为样品提 取溶液 纯水淋洗 ８．５色谱条件的选择。由于玉米赤霉烯酮自身为 荧光物质．能产生蓝绿色荧光．所以本实验方法 ９ 采用荧光检测器检测，激发波长２７４ｎｍ．发射波 长４４０ｎｒｎ。实验采用Ｃ， 柱反相色谱柱进行分离， 流动相采用乙腈一甲醇一水（５ ４６：４６：８），流速０．８ｍＬ／ ｍｉｎ：在上述条件下。玉米赤霉烯酮的色谱峰较为 理想．保留时间适中，玉米赤霉烯酮标准品峰谱 图见图１所示 ８．６最低检测限的确定。在本次实验中．将标准 溶液连续稀释后进行玉米空白样品的加标回收． 根据１０倍噪音的峰响应值、取样量和进样量，确 定本次实验中的最低检测限为０．Ｏｌｍｇ／ｋｇ ８．７免疫亲和柱的吸附容量对回收率的影响 本 次实验中所使用的免疫亲和柱中抗体容量约为 ２ｔＬｇ左右．所以在检测时应特别注意对玉米赤霉 烯酮高含量的样品进行稀释．以避免因超过免疫 亲和柱吸附极限而造成的检测数值不准确 ８．８通过图４标准曲线图与表１能够看出玉米赤 霉烯酮标准曲线相关系数ｒ值Ｉ＞０．９９９９６９：通过 表２可以看出．玉米赤霉烯酮标准品的变异系数 为０．２６％～１．６７％，表明此方法重复性好、曲线拟 合好。通过表３能够看出，此方法检测的回收率 为：９１．０％～９２．４％，当添加量低时，回收率也较低， 随着添加量的加大，回收率也相应的增高；回收 率标准偏差≤０．４７％．证明此方法具有较好的回 收率．同一浓度下回收率差异不大．标准偏差较 小，能够满足检测的要求。 ８．９通过文中的玉米赤霉烯酮标准品峰谱图（图 １）中显示．玉米赤霉烯酮的出峰时间约在 ９．８３５ｍｉｎ左右，空白样品峰谱图（图２）与标准品 比较时．空白样品在９ｍｉｎ左右的时间没有峰谱 出现，为阴性对照物；添加样品峰谱图（图３）与标 （下转第４９页） ８ ４ ９ ２ 铆料广函２０１２年第８期 ４９ ． 畜产品加工 Ｌ如ｅｓｃｏｃ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｐｒｏｃ 表７ （３ ）正交试验结果 卤蛋产品的滋味、色泽、质地、香味最好。 ３讨论与小论 ３．１进行单因素试验的目的是为了确定食盐、白 砂糖、味精、香辛料４个因素的适宜添加量，便于 进行正交试验。本次试验得出食盐、白砂糖、味 精、香辛料的适宜添加比例分别是０．９％、３．Ｏ％、 ０．０１５％、５．０％。这与李立新（２００２）在粉状调味料 的配制中所得出的结果不尽相同．原因可能与本 次试验所用姜、蒜、葱是鲜品，含水量较高有关。 ３．２正交试验中的调味料和香辛料比例是根据单 因素试验结果和五香风味的特点以及香辛料的价 格等因素配制的．以便于经济有效的组织试验。 ３．３研究结果表明．各因素对香卤蛋品质影响大 小的顺序依次为食盐、五香料、白砂糖、味精；最 正交试验结果见表７ 可以看出．试验组合８ 终确定食盐１．１％、白砂糖３．Ｏ％、味精０．０１５％、香 的评分最高．并从极差Ｒ值的大小可知，食盐对 辛料１．１％的配方下所生产的香卤蛋品在色泽、滋 卤鸡蛋的影响最大．其次为五香料和白砂糖，味 味、香味、光泽、质地等方面最佳，该结果与张星 精的影响最小。根据均值大小可得到产品最佳配 等（２００１）、叶华等（２００７）研究所确定的含量基本 一方为Ａ Ｂ Ｃ３Ｉ） ，即食盐用量１．１％、自砂精用量 致。 （参考文献略）一 ３．０％、味精用量０．０１５％、香辛料用量１．１％，所得 （上接第４４页） ｌｍＬ流动相溶液溶解后较为混浊：复溶时应将试 准品比较时符合玉米赤霉烯酮出峰规律．添加样 管置于涡旋振荡器上充分振荡Ｉｍｉｎ以上。复溶 品在９．６６７ｍｉｎ出现的峰谱可以判定为玉米赤霉 溶液在通过０．２０１￣ｍ微孔滤膜过滤后．如果颜色 烯酮峰：虽然每一针的出峰时间不会超过ｌＯｍｉｎ， 混浊可以用滤膜再过滤一次．或者通过离心机离 但在实际检测中．每一进针时间不宜低于１５ｍｉｎ； 心使溶液清辙后再过滤０．２０１￣ｍ微孔滤膜。 利用流动相的冲洗，可以将Ｃ 柱中的残留物冲 ８．１１玉米赤霉烯酮在上机检测之间．如能用 洗干净．以利于下一进针样品减少杂峰的干扰。 １００％甲醇溶液１ｍＬ／ｍｉｎ，活化Ｃ 柱会较好的提 此方法操作简单易行。单一样品的检测时间约在 高检测回收率与降低离散系数。检测完毕后，应 １５ｍｉｎ左右．样品的提取也不是很复杂。并且具有 用检测流动相充分冲洗Ｃ堪柱，并用５０％甲醇溶 较高回收率与低变异系数等优点．样品检测时的 液和１００％甲醇冲洗：否则在下次检测时会出现 重复性稳定（通过表４玉米赤霉烯酮重复性试验 基线波动大．并出现杂峰的现象：具体操作是先 可以看出．回收率重复性变异系数≤０．５９％）。适 用流动相１ｍＬ／ｍｉｎ．冲洗１ｈ．再改用５Ｏ％甲醇溶 合饲料中玉米赤霉烯酮的大批量检测等特点。 液与１００％甲醇的流动相冲洗１ｈ ８．１０在玉米赤霉烯酮样品处理液过免疫亲和柱 ８．１２进样量的大小直接影响出峰效果．过小会 时．过滤速度不宜太快，速度宜保持稳定；用甲醇 使标准系列中低浓度峰难以分离清晰．过大会不 洗脱时．残留于免疫亲和柱中的溶液应尽量抽 易清洗干净，影响下一针进样。本实验以５、１０、 干：洗脱溶液在被氮气吹干时，氮吹仪的温度不 ２０、３Ｏ、４０、５０ Ｌ进样试验，结果表明２０１ｘＬ进样 可过高．否则吹干后的试管壁颜色发黑，在被 量玉米赤霉烯酮色谱峰的分离效果较为理想。■