包头医学院学报 ２０１１年第２７卷第４期 ６ Ｊ０ＵＲＮＡＬ ｏＦ ＢＡｏＴｏＵ ＭＥＤＩＣＡＬ ＣｏＬＬＥＧＥ Ｖ０】．２７ Ｎｏ．４ ２０１１ ＳＤ大鼠海马神经元原代培养及形态学观察 蔡志平 李朝晖 石素琴 贾建新 杜颞 崔慧先 （１．包头医学院解剖教研室，内蒙古包头０１４０６０；２．河北医科大学解剖教研室； ３．河北医科大学第二医院神经外科；４．包头医学院第二附属医院药剂科） 摘要 目的：掌握ｓＤ大鼠海马神经元体外培养方法，观察神经元形态学特点，测定细胞生长曲线。方法：新生ＳＤ 乳鼠，剥离海马，胰酶消化，接种，１ ｄ换为Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ培养基；小鼠抗大鼠微管相关蛋白一２、兔抗鼠神经元特异性烯醇化 酶为一抗，免疫细胞化学法计数阳性细胞百分率并显微摄影；１％甲苯胺蓝、苏木精伊红染色。结果：原代培养神经元 ６—８ ｈ内开始贴壁，培养５—７ ｄ突起增粗增长，连接成网，以多极神经元为主，胞体呈三角形、梭形、椭圆形；ＭＡＰ一２、 ＮＳＥ染色为棕褐色，经鉴定神经元纯度达９ｏ％左右；细胞经历生长潜伏期，对数生长期，平台期；细胞核大而圆，ＨＥ染色 胞核深蓝色，胞浆红色，胞体中可见尼氏颗粒。结论：相差显微镜下神经元形态多样，ＭＡＰ一２、ＮＳＥ染色阳性细胞，ＨＥ染 色细胞核呈深蓝色，胞浆为红色，尼氏体位于细胞质内，神经突起内少见。 关键词海马神经元；原代培养；ＨＥ染色 Ｐｒｉｍａｒｙ Ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｏｆ ＳＤ Ｒａｔ Ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ Ｎｅｕｒｏｎ ＣＡ／Ｚｈｉｐｉｎｇ’ ＬＩ Ｚｈａｏｈｕｉ ，ＳＨＩ Ｓｕｑｉｎ４，，ｅｔ ａｌ （１．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆＨｕｍａｎ Ａｎａｔｏｍｙ，Ｂａｏｔｏｕ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ，Ｂａｏｔｏｕ ０１４０６０，Ｃｈｉｎａ； ２．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｆｏＨｕｍａｎ Ａｎａｔｏｍｙ，Ｈｅｂｅｉ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ； ３．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆⅣｅＭｒ∞ 僧 ，ｙ，ｔｈｅ Ｓｅｃｏｎｄ Ａｆｉｆｌｉａｔｅｄ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ｏｆｔｔｅｂｅｉ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ； ４．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｆｏＰｈａｒｍａｃｙ，ｔｈｅ Ｓｅｃｏｎｄ Ａｆｉｆｌｉａｔｅｄ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ｆｏＢａｏｔｏｕ Ｍｅｄｉｃａｌ ｃｏｌｌｅｇｅ） Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏ ｅｘｐｌｏｒｅ ｔｈｅ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｏｆ ｐｒｉｍａｒｙ ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ＳＤ ｒａｔ ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ ｎｅｕｒｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｍｏｒｐｈ０ｌ０百ｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ ｏｆ ｔｈｅ ｎｅｕｒｏｎｓ。ａｎｄ ｔｏ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ ｔｈｅ ｃｅｌｌ ｇｏｓｈ ｃｕｎｒｅ．Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ｔｈｅ ｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓ ｏｆ ｎｅｗ ｂｏｒｎ ＳＤ ｒａｔ ｗａｓ ｄｉｓｓｅｃｔｅｄ ａｎｄ ｄｉｇｅｓｔｅｄ ｗｉｔｈ ｔｒｙｐｓｉｎ，ｔｈｅｎ Ｗａｓ ｃｕｌｔｉｖａｔｅｄ．Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ ｍｅｄｉｕｍ Ｗａｓ ａｄｄｅｄ ａｆｔｅｒ ａ ｄａｙ．Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｍｅｔｈｏｄ ｗａｓ ｕｓｅｄ ｔｏ ｃｏｕｎｔ ｔｈｅ ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ ｏｆ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｅｌｌｓ．Ａｎｄ ｔｈｅ ｃｅｌｌｓ ｗｅｒｅ ｓｔａｉｎｅｄ ｗｉｔｈ １％ｔｏｌｕｉｄｉｎｅ ｂｌｕｅ ａｎｄ ＨＥ．Ｒｅｓｕｌｔｓ：Ｐｒｉｍａｒｙ ｃｕｌｔｉｖａｔｅｄ ｎｅｕ ｏｒｎｓ ａｄｈｅｒｅｄ ｉｎ ６—８ ｈｏｕｒｓ．Ｎｅｕｒｉｔｅｓ ｅｌｏｎｇａｔｄｅ，ｔｈｉｃｋｅｄ ａｎｄ ｃｏｎｎｅｃｔｅｄ ｉｎ ５—７ ｄａｙｓ．Ｍｏｓｔ ｎｅｕｒｏｎｓ ｗｅｒｅ ｍｕｌｔｉｐｏｌａｒ，ａｎｄ ｃｅｌｌ ｂｏｄｉｅｓ ｗｅｒｅ ｔｉｒａｎ￣ｅ，ｆｕｓｉｆｏｒｍｉｓ ａｎｄ ｅｌｌｉｐｓｅ ｓｈａｐｅ．Ｃｅｌｌｓ ｗｅｒｅ ｂｒｏｗｎ ｉｎ ＭＡＰ－２ ａｎｄ ＮＳＥ ｓｔａｉｎｉｎｇ．Ｔｈｅ ｐｕｒｉｔｙ ｄｅｇｒｅｅ ｏｆ ｎｅｕｒｏｎｓ ｗａｓ ａｂｏｕｔ ９０％．Ｃｅｌｌ ｇｒｏｗｔｈ ｕｎｄｅｒｗｅｎｔ ｌａｔｅｎｃｙ，ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ ｐｈａｓｅ，ａｎｄ ｐｌａｔｅａｕ ｐｅｒｉｏｄ．Ｎｕｃｌｅｕｓ Ｗａｓ ｂｌｕｅ ｂｙ ＨＥ ｓｔａｉｎｉｎｇ ａｎｄ Ｎｉｓｓｌ ｂｏｄｉｅｄ ｗｅｒｅ ｉｎ ｔｈｅ ｃｙｔｏｐｌａｓｍ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：Ｎｅｕｒｏｎｓ ａｒｅ ｄｉｖｅｒｓｉｆｉｅｄ，ａｎｄ ａｒｅ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｉｎ ＭＡＰ一２，ａｓ ｗｅｌｌ ａｓ ＮＳＥ ｓｔａｉｎｉｎｇ． Ｆｏｒ ＨＥ ｓｔａｉｎｉｎｇ，ｎｕｃｌｅｕｓ ａｎｄ ｃｙｔｏｐｌａｓｍ ａｒｅ ｂｌｕｅ ａｎｄ ｒｅｄ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｎｉｓｓｌｅ ｂｏｄｉｅｓ ａｒｅ ｉｎ ｃｙｔｏｐｌａｓｍ ａｎｄ ｓｅｌｄｏｍ ｉｎ Ｎｅｕｒｉｔｅ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ Ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ ｎｅｕｒｏｎ；Ｐｆｉｍａ￣ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ；ＨＥ ｓｔａｉｎｉｎｇ 海马锥体神经元是海马区的主要成分，主要功能 （武汉博士德）、兔抗鼠ＮＳＥ单克隆抗体（北京中彬）。 是参与近期记忆、情绪及内脏功能调节，是老年性痴 １．２实验方法新生乳鼠酒精消毒后断头取脑，于 呆、癫痫等疾病的主要病变部位¨Ｉ２ Ｊ。原代培养神经 ＳＭＺ体视显微镜下分离海马组织，０．１２５％胰蛋白酶 元能建立一个很好的体外神经元活动实验模型，具有 消化，吹打细胞悬液，台膀蓝染色计数，以１×１０ ～ 影响因素单一、机体干扰因素少和结果易分析等优点。 ５ Ｘ１０ ￣＂／ｍＬ细胞密度接种，置培养箱内培养，１ ｄ后 从细胞和分子水平上深入研究海马神经元的物质代 换为现配的Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ（２％的Ｂ２７）培养基继续培养， 谢、生理、药理及形态特征，海马神经元原代培养是一 以后每３ ｄ全量换液１次。取培养神经元，加小鼠抗 个必不可少的前提条件 Ｊ。 大鼠ＭＡＰ一２（１：１００稀释）、兔抗鼠ＮＳＥ（１：１００）、一 １材料与方法 抗４℃过夜，加生物素标记二抗、亲合素，加入ＤＡＢ避 １．１试剂胰蛋白酶（Ｓｉｇｍａ）、Ｂ２７、胎牛血清（ＰＡＡ）、 光显色，以酒精脱水、二甲苯透明，树胶封片。阴性对 Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ（Ｇｉｂｏｃｏ）。小鼠抗大鼠ＭＡＰ一２单克隆抗体 照用ＰＢＳ代替一抗。光镜下观察神经元ＭＡＰ一２和 第４期 蔡志平，等．ＳＤ大鼠海马神经元原代培养及形态学观察 ７ ＮＳＥ表达，随机选取ｌＯ个视野计数阳性细胞百分率并 进行显微摄影。将海马神经元接种在包被有多聚赖氨 酸的９６孔酶标板中，从细胞接种后首次换为Ｎｅｕｒｏ— ｂａｓａｌ（含２％的Ｂ２７）后２ ｄ开始，每２ ｄ测定１次吸光 ２．４原代培养的海马神经元ＨＥ染色 神经元胞核 大而圆，核仁１～２个，胞核染色深，颜色呈蓝色，胞浆 为红色。神经胶质细胞为三角形或多边形，核染色质 疏松而染色淡，胶质细胞胞体比神经元大，胞核位于胞 体一侧，见图１Ｅ。Ｎｉｓｓｌ染色可见神经元胞体中的尼 氏颗粒呈蓝色块状或颗粒状，可用来鉴定神经元，突起 内很少能见到尼氏体，见图１Ｆ。 度（ＡＤ）值并记录，共测定７次。以培养时间为横轴， ＡＤ值为纵轴，绘制生长曲线。神经元经固定、苏木精 染色、盐酸酒精分色、伊红染色、上行脱水透明、中性树 胶封片，观察；再经甲苯胺蓝染色、上行脱水、９５％乙 醇显微镜下控制分化时间，至尼氏体清晰显示时停止， 透明后树胶封片，观察。 ２结果 ２．１ 原代培养海马神经元特征倒置相差显微镜下， ６～８ ｈ内开始贴壁，培养８ ｈ后可见部分细胞长出微 小的突起，见图１Ａ。１ ｄ后绝大多数神经细胞贴壁，培 养５～７ ｄ神经元胞体最丰满，周围光晕明显，突起交 织成稀疏的网络，神经胶质细胞胞体扁平，核大而圆， 因异染色质少而色浅，胶质细胞周围无光晕，易与神经 元区别；神经细胞逐渐增多、突起伸长，细胞以多极神 经元为主，胞体呈锥体形、三角形、梭形、椭圆形，见图 １Ｂ。培养３周后，神经细胞开始退化，胞质中出现颗 粒空泡，然后突起退化、出现核固缩、崩解。 ２．２原代培养海马神经元免疫组化鉴定 ＭＡＰ一２ ■●一 ●一一 图１ 原代培养的海马神经元图片 Ａ：原代培养海马神经元１２ ｈ，倒置相差显微镜（×２００）；Ｂ：原代培 养海马神经元１４ ｄ，倒置相差显微镜（ｘ２００）；Ｃ：原代培养海马神经元 １０ ｄ，免疫组化染色显示ＭＡＰ一２阳性（×２００）；Ｄ：原代培养海马神经 元ｌＯ ｄ，免疫组化ＰＢＳ为对照组显示阴性（×２００）；Ｅ：原代培养海马神 经元１０ ｄ，ＨＥ染色，黑色箭头显神经胶质细胞，黄色箭头显示为神经元 （ｘ３００）；Ｆ：原代培养海马神经元１０ ｄ，Ｎｉｓｓｌ染色（×ｚｏｏ） 染色细胞体和突起被染成棕褐色为阳性细胞，见图 １Ｃ；整个细胞都不被染色为阴性细胞，见图１Ｄ。ＮＳＥ 为胞浆染色，ＤＡＢ染色后细胞胞浆棕褐色，突起部分 着色，阴性细胞为整个细胞都不着色。细胞形态与倒 置相差显微镜下一致，观察并拍照，以１０个视野中阳 ３讨论 海马神经元原代培养一般取自１６—１８ ｄ胎龄的 大鼠，这时期的细胞正处于分裂、繁殖阶段，细胞容易 在体外继续生长＿４－５］。由于乳鼠海马较胎鼠好定位， 性神经元数目占观察细胞总数的百分率为神经元纯 度，达９０％左右。 取材方便，故多采用乳鼠海马作为实验研究对象。在 培养的第７ ｄ，神经元有自然死亡现象 Ｊ，如果不能保 证足够的营养，神经元就会逐渐死亡，所以必须提供充 足的营养，使神经元安全渡过这一时期。本研究采用 了进口的无血清培养基，并添加了神经元培养基添加 因子Ｂ２７，故神经元在此间死亡较少。相对于其它无 ２．３原代海马神经元的生长周期 在体外培养条件 下神经元经历了生长潜伏期（２～４ ｄ）、对数生长期 （４～８ ｄ），此期细胞生长非常迅速；后进入生长平台期 （８～１４ ｄ），细胞生长处于停滞状态。原代培养海马神 经元的生长周期大约要８—１０ ｄ左右，培养的细胞于 ８～１０ ｄ可用于实验，见表１。 表１原代培养海马神经元不同天数时的ＭＴＹ值 天数（ｄ） ＭＴｒ值 ０．４３±Ｏ．０１ ０．４４±０．０２ ０．５６±０．０５ 血清培养基而言，Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ（含２％Ｂ２７）是最近应用 比较好的神经元无血清培养基，本研究用Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ 与Ｂ２７成功地培养了原代海马神经元，其纯度达到了 ９０％，与潘永英等 研究结果相似。 ＮＳＥ在神经元分化成熟时，与其分化程度及活跃 程度有关。ＭＡＰ一２是一种非微管蛋白，存在于胞体 和树突。本实验对培养１０ ｄ的大鼠海马神经元细胞 进行了免疫化学检测，结果显示神经元胞体饱满、突起 粗大，ＭＡＰ一２和ＮＳＥ染色都显示为阳性细胞，胞浆内 颗粒明显，细胞处于最佳状态，与形态学检测结果相吻 ０．６９±０．０８ ０．７５±Ｏ．０４△ ０．７８±０．１１△ ＋与２ ｄ和４ ｄ组比较Ｐ＜０．０５，△与６ ｄ和８ ｄ组比较Ｐ＜０．０５ ８ 包头医学院学报 第２７卷 合 说明原代培养的海马神经元具有较高的活力。 ｓｏｕｒｃｅｓ［Ｊ］．Ａｎｎ ＮＹ Ａｃａｄ Ｓｃｉ，１９８６，４８６：１９４—２００． ｓ ＢＤ，Ｔｕｒｌｅｊｓｋｉ Ｋ，Ｓｔａｎｆｉｅｌｄ ＢＢ，ｅｔ ａ１．Ｏｎ ｔｈｅ ｎｕｍｂｅｒｓ ｏｆ ［４］ Ｂｏｓｎｅｕｒｏｎｓ ｉｎ ｆｉｅｌｄｓ ＣＡ１ ａｎｄ ＣＡ３ ｏｆ ｔｈｅ ｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓ ｏｆ Ｓｐｒａ— 尼氏体是神经元内特有的结构，Ｎｉｓｓｌ染色中胶质 细胞不着色，神经元胞质呈深蓝色。在本研究中，通过 Ｎｉｓｓｌ染色观察到培养的神经元中有尼氏体存在。 参考文献 ［１］Ｋｅｒｒ ＪＥ，Ｂｅｃｋ ＳＧ，Ｈａｎｄａ ＲＪ．Ａｎｄｒｏｇｅｎｓ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ ｍｏｄｕｌａｔｅ Ｃ—ｆ０ｓ ｍｅｓｓｅｎｇｅｒＲＮＡ ｉｎｄｕｃ ｎ ｔｈｅ ｒａ 。ｃａｍｐｕｓ ｆ０ｌ’ 『６１ ｇｕｅ—Ｄａｗｌｅｙ ａｎｄ Ｗｉｓｔａｒ ｒａｔｓ［Ｊ］．Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ，１９８７，１５４（２）： １５３—１７３． ［５］ 郭畹华，林启祥．胶质细胞成熟因子支持原代培养的小 脑皮质神经元的生存［Ｊ］．解剖学报，１９８９，２０（１）：５０— ５５． Ｂｏｒｂｅｒ Ｊ。Ｍｏｎｇｏｌｄ ＰＨ．Ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｄｉｓｓｏｃｉａｔｄｅ ｎｅｕｒｏｎ ａｎｄ ｇｌｉｌａ ｃｅｌｌ ｆｒｏｍ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｃｈｉｃｋ．ｒａｔ ａｎｄ ｈｕｍａｎ ｌｏｗｉｎｇ ｎｏｖｅｌｔｙ［Ｊ］．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｃ，１９９６，７４（２）：７５７—７６６． ［２］Ｐａｔｅｈｅｖ ＶＫ，Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ Ｊ，Ｇｏｅｔｚ Ｆ，ｅｔ １．Ｎｅｕｍｔａｒｏｐｉｃ ａｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｄｒｏｇｅｎｓ：ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ａｎｄ ｎｏｖｅｌ ｔａｒｇｅｔｓ［Ｊ］． Ｅｘｐ Ｇｅｒｏｎｔｏｌ，２００４，３９（Ｉ１／１２）：１６５１—１６６０． Ｆ＇７ １ ｂｒａｉｎ ｉｎ ｌｆａｓｋ ｃｕｌｔｕｒｅ［Ｊ］．Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，１９７２，２：９７． 潘永英，彭书峻，赵一凡，等．大鼠海马神经元的原代无 ［３］Ｄａｖｉｓ ＧＥ，Ｍａｎｔｈｏｒｐｅ Ｍ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＬＲ，ｅｔ ａ１．Ｃｈａｒａｃｔｅｉｒｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｌａｍｉｎｉｎ－－ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ－·ｎｅｕｆｉｔｅ——ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ ａｎｄ ａ ｎｅｕｒｏｎｏｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒ ｆｒｏｍ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｎｅｒｖｅ ａｎｄ ｒｅｌａｔｅｄ 血清培养及鉴定［Ｊ］．实用医学杂志，２００６，２２（７）：７５８— ７５９． （收稿日期：２０１１－０１．１９） （上接第３页） ２讨论 细胞样淋巴瘤（Ｒａｐｐａｐｏｒｔ），免疫细胞瘤，淋巴浆细胞 型（Ｋｉｅ１），浆细胞性一淋巴细胞性淋巴瘤（Ｌｕｋｅｓ—Ｃｏ１． １ｉｎｓ），具有浆细胞样分化的小淋巴细胞性淋巴瘤 （Ｗｏｒｋｉｎｇ Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ），淋巴浆细胞样淋巴瘤（免疫细 从临床症状、病理诊断、细胞形态学及细胞化学染 色综合分析，考虑为淋巴浆细胞样淋巴瘤（ＬＰＬ）骨髓 侵润。此病为一种少见的非霍奇金淋巴瘤（ＮＨＬ），约 占非霍奇金淋巴瘤的１％左右，是一个由小Ｂ淋巴细 胞、浆细胞样淋巴细胞和浆细胞组成的肿瘤，老年发 病，可伴自身免疫性疾病…。常有副蛋白血症，有时 可有高黏滞性所致的症状（Ｗａｌｄｅｅｎｓｔｒｏｍ微球蛋白血 胞瘤）（ＲＥＡＬ分类），淋巴浆细胞性淋巴瘤 （ＷＨＯ） Ｊ。淋巴浆细胞性淋巴瘤发病缓慢，病程较 长，经治疗可获缓解，但不易治愈。 参考文献 ［１］王淑娟，王建中，吴振茹．现代血细胞学图谱［Ｍ］．北京： 人民卫生出版社，２００１：３６—５４． 症）。就诊时多为晚期，不凶险，疗效较差，可转化为 大Ｂ细胞淋巴瘤。本文报道的类型罕见，通常累及骨 髓、淋巴结和脾，不表达ＣＤ５，大多数病例有血清单克 隆蛋白伴高黏滞血症或巨球蛋白血症，同时应排除其 他淋巴瘤的浆细胞样／浆细胞的变异型。在不同的分 ［２］ 谭齐贤，张树平．临床血液学和血液检验［Ｍ］．北京：人民 卫生出版社，２００３：２５—３６． 类系统中命名不同，包括：分化良好的淋巴细胞性一浆 （收稿日期：２０１１－０２—１３）