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2018年1月第25卷第1期Vol. 35, No. I, Jan. 2018
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柴胡-白芍药对干预大鼠抑郁症模型
的血清代谢组学研究
张洪财1，陈雁雁2，王文姨2，付新3 !
(1.黑龙江中医药大学中医药研究院，黑龙江哈尔滨150040;2.黑龙江中医药大学药附属第一医院，
黑龙江哈尔滨150040;3.黑龙江中医药大学，黑龙江哈尔滨150040)
摘要：目的：基于UPLCQ-TOF-MS技术对大鼠抑郁模型血清代谢组学进行研究，寻找与柴胡-白 芍药对干预抑郁症关联的生物标志物，探索该药对抗抑郁作用机制。方法:SD大鼠，采用CUMS方法造 模，通过糖水偏爱率和摄食量实验评价。建立模型成功后，随机分成柴胡-白芍药对组、氟西汀阳性药 组、模型组、空白组。末次给药后，眼眶取血收集血清样品。样品通过UPLC-MS分析，采集数据用 Masslynxv4. 1进行PCA分析。结果:模型组与空白组对比，色氨酸、尿酸、胆酸、容血磷脂酞胆減发生明 显变化，给予氟西汀或者药对后，代谢物组发生变化并具有回调作用，推测潜在的标志物可能是上述内 源性代谢物。结论：柴胡-白芍药对可能通过调控氧化应激、脂类代谢、氨基酸代谢来实现抗抑郁作用。 关键词：柴胡-白芍药对;代谢组学；抑郁症中图分类号：R28
文献标识码:A
文章编号=1002 -2406(2018)01 -0034 -04
doi：10.19656/j. cnki. 1002 -2406.180011
Serum Met^bolomics Study of Chaihu - baisliao on Depression in Rats
ZHANG Hong - cai^，CHEN Yan - yan2，WANG Wen - ran2，FU Xin3!
(1. TCM Research Institute，Heilongjiang University of Chinese Medicine，Harbin 150040， China；2. The First Affiliated Hospital of Heilongjiang University of Chinese Medwine，Harbin 150040，China；3. Heilongjiang University of Chinese Medicine，Harbin 150040，China)Abstract: Objective: To study the serum metabolomics of depressive model in rats based on UPLC/Q - TOF -基金项目：黑龙江省青年科学基金面上项目（No. QC2017114);黑龙江中医药大学校科研基金资助项目（No. 201210)
作者简介:张洪财(1983 -)，男，助理研究员，博士研究生，主要研究方向：中药药效物质基础及作用机制研究；中药有效成分的活性研究及先导化合
物的发现。
通讯作者:付新！（1983 -)，男，助理研究员，博士，主要研究方向：中药药效物质基础研究。收稿日期:2017 -06 -27 修回日期：2017 -07 -10
2018年1月第35卷第1期Vol. 35, No. I, Jan. 2018
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MS，and to find the biomarl^ers associated witli the effect of Chailiu - Baisliao(Radi% Bulpeuri — Radi% Paeoni- ae Alba) on depression and to explore its antidepressant mechanism. Methods: SD rats were modeled byCUMS met!iod and evaluated
by
sugar
and
water preference and food intake. After
successful
the model，the rats were randomly divided into four groups，i. e. Chaihu - Baishao group，Fluoxetine group，the model group，and the blank group. After the last administration， orbital blood were collected. Samples were analyzed by UPLC — MS，and data were collected for PC A analysis witii Masslynxv^. 1. Results ： Compared to the blank group，the levels of tryptophan，uric acid，cholic acid，and lysophosj^hatidylcholine weresignificantly changed. After tiie medications，it had a callback efect on metabolites，suggesting that tiie potential mariner might be
the above
endogenous
metabolites.
Conclusion ：
Chai!iu -
sant effect by regulating oxidative stress and the metabolisms of lijDid and amino acid.Key words: Chaihu - Baishao # Metabolomics # Depression抑郁症是一种以长期情绪低落为特征的精神类疾 病。表现特征为睡眠困难、兴趣丧失、食欲降低、情绪 不稳定，具有发病率高、致残率高、治愈率低、复发率高 的特点[1_2]。据世界卫生组织统计，抑郁症在全球世 界疾病负担中排名第二。目前，临床治疗抑郁症化学 药物主要有万拉法辛、氟西汀、米氮平、舍曲林、艾司西 酞普兰、瑞博西丁。西药特点为种类繁多、临床应用 早、效果显著，但是毒副作用较大，患者依从性差[3—4]。 中医药治疗抑郁症疗效较好，且毒副作用相对较小，成 为众多学者研究的焦点[5]。文献报道柴胡、白芍、柴 胡-白芍药对均具有抗抑郁作用，且柴胡-白芍药对 是众多方剂中经典药对。本课题组以CUMS抑郁大鼠 模型为对象进行药效学实验，验证其具有抗抑郁作用， 但作用机制需进一步深入研究。基于此，本实验利用 代谢组学技术研究CUMS抑郁大鼠血清代谢轮廓信 息，寻找抑郁症关联的生物标志物，探索代i射途径和作 用靶点，阐述作用机制。1
实验仪器与材料
22.1
健康SD大鼠，体质量190 ~210 g，购自黑龙江中 医药大学GLP中心，实验动物生产许可证号：SCX 2013 -004,实验动物使用许可证:SYK2013 -012。
柴胡、白芍药材购于哈尔滨世一堂中草药专营店。 实验方法 提取物的制备
按照柴胡、白芍药材质量1:1组成，水煎煮40 min，煎煮2次，合并水煎液，冷冻干燥，制成粉末备用。
2.2$ 的 [6 -8]
将禁食(24 h)、夹尾（1 min)、间歇噪音刺激（85 dB)、电击足底（电流强度10 mA，每隔1 min刺激1 次，每次持续10 s，共30次）、断水（24 h)、摇晃 (1次/s，15 min)、45°C环境热刺激(5 min)、昼夜颠倒 (24 h)、4°C冷水游泳（5 min)，陌生气味等10种应激 因子按随机方法在28天内应用，为避免大鼠对刺激产 生适应性，使大鼠不能预料刺激的发生，每日给予1种 刺激。每种刺激累计使用2 ~3次。2.3血清样品的制备
造模3周后，正常组:正常饲养，不接受刺激，每日 灌服蒸馏水4. 5 ml/kg；模型组:每日灌服蒸馏水4. 5 ml/kg；药对组:每日灌服药对溶液4. 5 ml/kg，生药量 5.9 g/(kg • d)，相当于70 kg体质量成人临床用药的 等效量，从实验第一天到实验结束，连续28天;氟西汀 组：盐酸氟西汀溶液4.5 ml/kg，生药量1.8 mg/(kg • d )，相当于70 kg体质量成人临床用药的等 效量，从实验第一天到实验结束，连续28天。以上各 组按程序给予不同应激刺激，给药治疗4周后，采血前 12 h禁食不禁水，眼眶采血，离心，样品低温（-70C) 保存，待测。2. 4
液相方法
Acquity™ UPLC液相色谱仪（四元梯度泵-在线 真空脱气机-自动进样器-二极管阵列检测器-柱温
Bais!ia
UPLC - Q - T0F/MS超高效液相色谱串联质谱
(美国Waters);MassLynx 4. 1质谱软件（美国Wa- ters);XZ -25K高速离心机（长沙湘智离心机仪器有 限公司）；电子天平（梅特勒-托利多）；TGL - 16G低 速离心机(上海安亭仪器有限公司）；KQ -300DE数控 超声清洗器（上海凌科实业发展有限公司）；DZF-
6050真空干燥箱（上海和呈仪器制造有限公司）。
甲醇、乙腈（色谱
HPLC级，迪马科技）；色氨酸
(65 -46 -3)、胆酸(81 -25-4)、苯丙氨酸(89-18 -7) 对照品（上海科顺生物科技有限公司）；溶血磷脂酰胆 碱（190025)对照品（北京世纪奥科生物技术有限公 司）；尿酸(69 -93 -2)对照品（上海远慕生物科技有 限公司）
；SCIENTZ - 18ND型冷冻干燥机（宁波新芝冻
干设备股份有限公司）。
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2018年1月第35卷第1期Vol. 35，No. l，Jan.2018
箱）# ACQUITY UPLC™ HSS T3 ( 100 mm x 2. 1 mm i. d.，1.8 !m$色谱柱;流动相A为0. li甲 酸水，流动相B为0. 1i甲酸 ；柱温45°C ;样
-温度4°C;流速0.5 mLmin;进样体积:2 !L。最佳梯
谢物提供保证。色谱图见图1。
洗
见表1。
表1 UPLC梯度洗脱方法
洗脱时间流速流动相A 流动相B (min)(ml/min )洗脱曲线
(i)(i)Initial0.599110.59010630.58812660.586146110.5298611.60.51996120.5991614
0.5
99
1
6注:A:0.1i甲酸水;B:0. 1i乙睛水
2.5质谱方法
电喷雾离子源（ESI;毛细管电压2.5 kV;样品锥 孔电压45 V;提取孔电压4.0 V;脱溶剂温度 300C ;
剂流量500 Lh;锁定质量溶液:采
国Waters集团公司独家专利Lockspray校正系统进行 在线质量校正，亮氨酸-脑啡肤（leueine - enkephalin， [M + H] ； =556.277 1，[M-H] ； =554.261 5)，锁定 质量溶液浓度为200 pg/ml;质量扫描范围： 平
超过10个扫描，扫描范围m/z 50〜900 Da，以centriod
式进行 采集;工作站:Masslynx V4. 1工作站。
3
实验结果3.1大鼠行为学指标
评价 是否成功的指标是糖水偏愛率和摄食
量。刺 6
， 组
于 组，说成功。药对组
组优于 组，但与
组
。
见 2。
表2
大鼠糖水
量实验结果比较（@±(
组别n糖水偏率（i)摄食量（/)对组
80.85 ±0.0330.40 ±0.79组80.59 ±0.0424.30 ±0.95组80.81 ±0.03!!28.80 ±0.89 !药对组
8
0.76 ±0.02 !28. 50 ±0. 87 !
注:与模型组比较，
<0.05, ！！！<0.01
3.2血液样品UPLC - HDMS分析方法的建立
了适合大鼠血液样品的UPLC - HDMS分析
方法，为全面、高效、
地
大鼠血液中内源性代
-■■ ctki
rta Vr>
I 1 \\
1 ；
广
J
7
\\
A.正离了模式；B.负离了模式
图1 血液样品典型UPLC - HDMS色谱图
3.3对血代物谱的干预作用研究
采用非
主成分分析(PCA)方法，对
组、模组及给药组大鼠血液的代谢指 进行分析，绘制出反映组间离散程度的Score pl(图2$。
大鼠血液代谢物组发生了 的
，与
组相比明显
分类。 大 柴胡-白芍药对 ，在Scoe
plot上显示出一个独立的表征区域并且向空白组靠
，
柴胡
药对对
大鼠代谢物组的变化具
有回A
调作用。
B
-100 -SO 0 SO 1Q0
叫
-D.1
Q.D
Q.1
G.2
p[1l
图2大鼠血液代谢数据的PCA分析的 Score plot 图
和 Loading - plot 图
注:a:模型组;b:药对组;c:空白组
2018年1月第35卷第1期Vol. 35，No. l，Jan.2018
3#代谢谱中生物标识物的鉴定
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氨酸含量决定5 -羟色胺的合成，色氨酸的竞争性氨 基酸是苯丙氨酸，柴胡-白芍药对能 善 与
状态;胆酸是 强，参与 脂类物质
趋势
组大鼠血清代谢物谱经PCA处理，利
量
到贡献较大的代谢物，经代物一、二质谱信
对，共鉴定出5个对分类贡献较大的代表3血清代谢物相关生物标志物
保留
离 4.4（min)式
188.6Tryptophan fragmentm/z
代
物的鉴定
加色氨酸
化加，
的浓度，使苯丙氨酸浓度降低，5 -羟色胺含量增加，改
酸成分，能够使脂 循环，胆酸血清中浓 与代
到
组中血
息及对
物。结果见表3。
况[8]。药对能效果;LPC与
降，不LPC浓 够降 氧
酸浓度，调控脂类代
。
LPC浓度含量增加， LCAT酶活性降低。且
5.9184.8C20 :4LPCfragment
7.5524.1
C18:0 LPC
离
式7.4164.5Phenylalanine8.0407.8Cholic acid1.2
167.4
Uric acid
Scores colored by Sample Group
s模型组；j氟西汀组
图3
抑郁模型组与氟西汀组OPLS - DA图
注:S模型组;J:氟西汀组
Scores colored by Sample Group
MarkerLynx XS 3.0.3 - ZHC-P0S2.usp (M3: OPLS-DA) - 2017-06-02 13:59:15 (UTC+8)
S模型组；Y药对组
图4抑郁模型组与药对组OPLS - DA图注:S模型组;Y:药对组
4讨论
单胺类神经递质学说抑郁症的病理机制之一。色
酸是非酶抗氧化剂，能 氧化物，
自基，
药对能够提高尿酸浓度，抗氧化反应，并能提高血清中
LPC 浓 。本
以
大鼠为研究对象，用糖水偏率及摄食量两个 指标作为
成功标准。建立
成功后， UPLC/Q- TOF - MS技术分析血清
代谢谱， PCA主成分分析，发现血清中色氨酸、尿
酸、胆酸、溶血磷脂 碱发生
。基于以上内
容， 柴胡-白芍药对
机制可能是
调节
氧
， 脂 代 、
质作
的。
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