S11实验十一 植物原生质体的分离及融合(理论)

实验十一 植物原生质体的分离及融合（理论）

原生质体培养的主要目的是实现远缘物种的体细胞杂交，外源染色体、DNA或细胞器的导入，创造新的远缘杂种。全部技术环节包括原生质体分离、原生质体培养、体细胞杂交、杂种细胞产生愈伤组织及再生植株等。

一、原生质体的概念

1、原生质体

是指用特殊方法脱去植物细胞壁的、裸露的、有生活力的原生质团。没有细胞壁，但具有活细胞的一切特征。

2、原生质体培养

指将植物细胞游离成原生质体，在适宜的培养条件下，依据细胞的全能性使其再生细胞壁，进行细胞的分裂分化，并发育成完整植株的过程。

二、原生质体的分离方法

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1、机械分离法

采用渗透方法使细胞发生质壁分离，然后切开细胞壁释放出原生质体。特点是原生质体产量很低；方法繁琐费力；局限性大。

2、酶法分离

采用果胶酶、纤维素酶等酶类对植物细胞壁进行酶解，得到原生质体。

三、原生质体纯化与活力测定

1、原生质体的纯化

a、离心沉淀法

应用原生质体的比重大于溶液的性质，将原生质体沉于底部，收集原生质体备用。

b、漂浮法

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应用渗透剂含量较高的洗涤液使原生质体漂浮于液体表面。依次通过网筛过滤、离心、收集沉淀，再用蔗糖液洗涤离心2—3次，漂浮收集即可。

c、界面法

选用两种不同渗透浓度的溶液，一种溶液密度大于原生质体的密度，另一种小于原生质体的密度，进行界面收集原生质体。

2、活力测定

a、形态识别

形态上完整，含有饱满的细胞质，颜色新鲜的即为存活的原生质体。

b、染色识别

用0.1%酚番红或伊凡蓝进行染色，后进行观察，有活力而质膜完整的原生质体对染料有排斥作用而不被染色，死亡的却被染上颜色。

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四、原生质体的培养方法

培养方法有四种，即固体薄层培养法、液体浅层培养法、双层培养法和琼脂糖珠培养法。

1、固体薄层培养法

又叫平板培养法，指将一定体积的原生质体按照一定细胞密度与等体积的处于45℃的琼脂培养基混合，在培养皿内制成薄层固体平板的方法。使原生质体位置固定，避免其游动，便于定点观察。

2、液体浅层培养法

是将原生质体用培养液调整到一定细胞密度，取出3—4ml置于培养皿中浅层静止培养的方法。

3、双层培养法

又分为液体-固体双层培养法和固体-固体双层培养法。将一定浓度原生质体悬浮液涂布在固体琼脂培养基表面的培养方法为液体-固体双层培养法。是液体培养与固体培养的结合，既利于原生质体的生长，又利于营养成分的逐步释放和有害成分的扩散；固体-固体双层培养法是指将等体积的琼脂与一定浓度的原生质体悬浮液混合，涂布在固体琼脂培养基表面的方法。

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4、琼脂糖珠培养法

用适温的琼脂糖液与提纯的原生质体液混合均匀，然后以0.5ml左右的液滴滴入培养液中，待形成琼脂糖珠后，震荡培养的一种方法。

五、原生质体再生过程与遗传变异

原生质体再生过程是指分离、纯化的原生质体在适当的培养方法和良好的培养条件下，很快恢复细胞壁，再生细胞持续分裂形成细胞团，最后或通过愈伤组织或通过胚状体分化出完整植株的过程。

（一）原生质体再生过程

1、细胞壁再生

具有活力的原生质体都具有再生和分裂的潜在能力，而细胞壁的再生是细胞分裂的先决条件。正常情况下，原生质体经培养数小时后开始再生细胞壁，两天至数天细胞壁再生完成。再生完整细胞壁的原生质体进一步进行正常的细胞有丝分裂，而细胞壁发育不全的原生质体常会出现芽或体积增大。

2、细胞分裂和愈伤组织或胚状体形成

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原生质体细胞壁的存在是进行规则有丝分裂的前提，但再生细胞不一定都能进行细胞有丝分裂，因此原生质体植板率变化很大。原生质体培养过程中会发生不正常的有丝分裂现象，这可能是核分裂和胞质分裂的不平衡所致。

3、植株再生

原生质体培养形成的愈伤组织转移到分化培养基中，可形成不定芽和不定根或形成胚状体结构后直接发育成植株。

（二）遗传变异

植物离体培养过程中存在着广泛的变异，包括适应性变异和遗传性变异。适应性变异为非遗传变异，它随环境条件的改变而丧失其变异特征；遗传变异因涉及染色体和基因变异，能稳定地传递给后代。主要表现为形态特征变异、染色体和基因变异。

六、体细胞杂交概念

体细胞杂交也即原生质体融合，就是使分离下来的不同亲本的原生质体，在人工控制条件下，像性细胞受精作用那样相互融合成一体。它使植物无性杂交成为可能，使有性杂交根本无法获得的种间、

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属间、科间远缘杂种成为现实。打破了物种间的界限。

七、原生质体融合的类型及过程

（一）原生质体融合的类型

原生质体融合可以分为自发融合和诱发融合两类。

1、自发融合

由于去壁的裸细胞具有彼此融合的能力，在制备原生质体的酶解保温处理过程中，相邻的原生质体能彼此融合形成含有多个细胞核的融合体，这种方式就是自发融合。

2、诱发融合

通过诱发剂是两个彼此相邻的原生质体相互融合的过程，称为诱发融合。诱发融合主要有化学融合方法与物理融合方法。

（1）化学融合

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采用化学融合剂，促使原生质体相互靠近、粘连融合。常用的化学融合剂主要有PEG、NaNO3

等。

（2）物理融合

采用电场等方法使原生质体相互靠近、融合的方法。电融合指利用改变电场诱导原生质体彼此相连成串，再施以瞬间强脉冲电压促使质膜发生可逆性电击穿，达到原生质体融合的方法。

（二）融合过程

原生质体融合的基本过程是：

1、原生质体在诱融剂或正弦电场作用下凝集，彼此靠近；

2、两个相邻原生质体之间的质膜相互融合，随后两个亲本原生质体质膜上的受体、糖蛋白、糖脂等成分也在融合后的质膜上重新分布；

3、细胞质发生融合；

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4、细胞核发生融合，形成单核融合细胞。

八、影响原生质体融合的因素

A、原生质体质量

对细胞的融合起着至关重要的作用，高质量的原生质体是细胞融合的首要条件

B、融合方法

C、融合参数 各种融合液都应选择适当

九、杂种细胞的筛选

1、互补选择

利用两个亲本具有不同遗传和生理特性，在特定培养条件下，只有发生互补作用的杂种细胞才能生长的选择方法。又分为营养缺陷型互补选择法、抗性突变体互补选择法等。

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2、机械选择法

利用融合细胞所具有的可见标记，在倒置显微镜下，用微管将融合细胞吸取出来进行选择的方法。常用的可见标记是叶肉细胞的绿色。

十、杂种植株鉴定

鉴定方法有：形态学鉴定、细胞学鉴定、同工酶鉴定和DNA分子标记鉴定。

十一、体细胞杂种遗传特征

不同基因型亲本融合形成的体细胞杂种与其亲本比较具有一些明显不同的遗传特征，表现为细胞分裂和染色体数目不稳定性、杂种植株的不育性等。亲缘关系较远的种、属间融合形成的杂种体细胞一般不发生核融合，形成异核体。异核体常常不发生细胞分裂、或细胞分裂不同步导致细胞分裂失败、或细胞分裂几次后停止生长、或形成几十个细胞的细胞团后停止生长，致使亲缘关系较远的种、属间形成杂种几率极低。

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