亮氨酸与异亮氨酸的表面增强拉曼光谱

第7期, 640～644

化 学 学 报

ACTA CHIMICA SINICA

Vol. 65, 2007 No. 7, 640～644

·研究论文· 亮氨酸与异亮氨酸的表面增强拉曼光谱 周光明* 虞丹尼 黎 司 杨大成 (西南大学化学化工学院 重庆 400715) 摘要 报道了在蛋白质氨基酸中唯一一对异构体氨基酸——亮氨酸和异亮氨酸的FT-拉曼光谱和在银胶基底上的表面增强拉曼光谱(SERS). 归属了各振动、增强峰位并分析了异构体氨基酸分子内不同振动模式引起的拉曼位移及其在不同pH值下SERS的变化. 分子内不同的振动模式主要源于异构体氨基酸中一个甲基和主链的不同连接次序, 表现在拉曼光谱; 亮氨酸的甲基摇摆ρ(CH3)和非对称变形δas(CH3)在962, 945, 924和1454, 1408 cm－1; 异亮氨酸的ρ(CH3), δas(CH3)在922和1448, 1420, 1394 cm－1. C—CO, C—C, H—O…H及骨架晶格振动峰位基本对应. 饱和液态的拉曼光谱和SERS中, 各基团振动峰位的差异表现得更为明显. 初步推测了这对氨基酸异构体在银表面吸附状态的模型. 关键词 亮氨酸; 异亮氨酸; FT-拉曼; FT-SERS; pH值 Surface Enhanced Raman Spectroscopy of Leucine and Isoleucine ZHOU, Guang-Ming* YU, Dan-Ni LI, Si YANG, Da-Cheng (School of Chemistry and Chemical Engineering, Southwest University, Chongqing 400715) Abstract FT-Raman and surface enhanced Raman spectra (SERS) of leucine and isoleucine, the only iso-mer in proteinic amino acids, on the silver colloidal substrate are recorded. The vibrational and enhanced peaks are assigned; the Raman shifts that stem from different vibrational model in the molecular inner struc-ture, and the variations of SERS at different pH values are analyzed. One methyl’s different connection to the main chains of the isomer amino acid resulted in different vibrational model in inner molecule, expressed －in Raman spectra: ρ(CH3) and δas(CH3) of leucine are at 962, 945, 924 and 1454, 1408 cm1, by the com-－paration, isoleucine’s are at 922 and 1448, 1420, 1394 cm1. Vibrations involved in C—CO, C—C, H—O…H and lattice vibration mode are identical. In saturated solution’s Raman spectra and SERS, all the different shifts are expressed more clearly than those in solid state’s Raman spectra. The adsorption models of the isomer amino acid on the silver surface are speculated. Keywords leucine; isoleucine; FT-Raman; FT-SERS; pH value傅立叶变换拉曼(FT-Raman)光谱技术因其采用近红外激光(λ＝1064 nm)作为激发光源及干涉仪代替色散方法, 能避开荧光干扰, 减少对样品的光损伤和光化学效应的特点, 可用来鉴定分子的化学官能团, 但其灵敏度较低而限制了其应用. 提高FT-Raman灵敏度的一个有效手段是把它与表面增强拉曼光谱(SERS)技术相结合. SERS的最大特点是样品分子被吸附在一些具有一 * E-mail: gmzhou@swu.edu.cn

定粗糙度的金属基底表面(如粗糙化的银电极, 金, 银胶等), 其拉曼散射信号可获得极大的增强(增强数量级在106～1010), 同时淬灭荧光. 因此, SERS有望成为一种高灵敏度的生物分子探测技术[1]. 在20种基本蛋白质氨基酸中, 亮氨酸与异亮氨酸同为带支链的氨基酸; 也是唯一一对异构体氨基酸. 前人已有不少关于应用Raman, SERS研究氨基酸的报道,

Received August 5, 2006; revised September 21, 2006; accepted December 12, 2006.

西南大学校青年基金(No. 2005008)和重庆市自然科学基金(No. 2005BB5095)资助项目.

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周光明等：亮氨酸与异亮氨酸的表面增强拉曼光谱

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包括单个氨基酸晶体结构及不同温度下结构变化的Raman光谱如亮氨酸[2]、蛋氨酸[3]; 研究氨基酸与其它硒酸、高氯酸盐等构成复杂配合物的分子如硝酸、

Raman光谱变化及一些氨基酸的SERS如芳基氨基酸[7]等; Jenkins等[8]对拉曼光谱表征氨基酸作了概述, 但未见对这一异构体作较为系统的研究. 本文对比了它们的固态、饱和液态的普通拉曼光谱和在银胶基底上的SERS及其不同pH值下的SERS; 归属分析了它们因分子内结构差异导致的不同振动模式而产生的不同拉曼位移; 最后, 依据SERS作用机理和规律, 探讨了亮氨酸和异亮氨酸在银胶表面的吸附状态及其相互作用特点. 初步提出了这两种氨基酸各自在银胶表面的吸附模型. 对这一对蛋白质氨基酸中唯一一对同分异构体的研究, 可以为拉曼光谱更深入研究氨基酸、多肽、蛋白质以及其它生物分子, 提供十分重要的信息和有益的参考.

[4]

[5]

[6]

1.2 实验方法

亮氨酸和异亮氨酸的固态及其饱和液样品分别装入拉曼样品池中, 测得FT-Raman光谱.

选用硝酸和氢氧化钠溶液(0.1 mol•L－1)调节银胶和样品体系的pH值.

将1×10－3 mol•L－1的亮氨酸和异亮氨酸溶液分别与银溶胶按1∶1的体积比混合吸附, 调节所需pH, 分别测定FT-SERS.

2 结果与讨论

2种异构体氨基酸在结构式上(图2)的差别表现为一个甲基(6号碳, C-6)和主链不同的连接次序, 由此引发整个氨基酸链上相应基团和骨架的振动峰位的位移. 这些振动峰位变化具体体现在亮氨酸和异亮氨酸的固态拉曼光谱(图3)、饱和液态拉曼光谱(图4)及银胶基底上不同pH条件下的SERS (图5和图6). 异构体的固态拉曼光谱中, 各振动峰位归属见表1[2].

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

RFS-100/s型傅立叶变换拉曼光谱仪(德国Bruker公司), Nd:YAG 激光光源(1064 nm), 液氮冷却Ge检测器, 激光强度分为50 mW(用于固态样品, 扫描80次)和150 mW(用于液态样品, 扫描200次), 光谱分辨率为4 cm－1.

银胶的制备依据Lee[9]的方法用柠檬酸三钠还原硝酸银, 呈灰色, 放置一周而获得, 室温下避光保存可稳定数周. 日立H600型透射电镜表征银胶. 银粒子平均粒径为(50±5) nm, 大部成球体(图1).

图2 亮氨酸(a)和异亮氨酸(b)的结构式

Figure 2 Structural formula of leucine (a) and isoleucine (b)

图1 银胶的透射电镜图 Figure 1 TEM of silver colloid

图3 固态亮氨酸(a)和异亮氨酸(b)的拉曼光谱

Figure 3 Raman spectra of leucine (a) and isoleucine (b) in solid state

亮氨酸和异亮氨酸(分析纯, 成都凯泰新技术有限责任公司), 未经任何处理直接使用.

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表1 亮氨酸和异亮氨酸的拉曼位移及其归属a

Table 1 Raman shifts of leucine and isoleucine and assignments

Leucine Isoleucine

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－

assignment Raman shift/cm1 Tentative

Leucine Isoleucine ν(C—H) ν(O—H…O) δas(NH＋3) δas(CH3) δ(CH), δ(NH) ν(C—C) ρ(CH3) γ(H—O…H) ν(C—N) ρ(CH3) ρ(CH2) ν(C—CO) δ(COO) ρ(COOH) τ(C—C) τ(6-CH3)

Lattice vibration mode

ν(C—H) ν(O—H…O) δas(NH＋3) δas(CH3) δ(CH), δ(NH) ν(C—C) ρ(CH3) γ(H—O…H) ρ(CH3) ρ(CH3), ν(C—C) ρ(CH2) γ(C—O—H) ν(C—CO) ω(COO) δ(COO) ρ(COOH) δ(skelet.)

Lattice vibration mode

2960 (vs), 2933 (vs), 2870 (s) 2764 (s), 2717 (s) 1624 (w) 1454 (s), 1408 (m)

1340 (m), 1313( w), 1296 (w) 1238 (w)

1186 (w), 1128 (w) 1080 (w) 1030 (w) 1003 (w)

962 (w), 945 (w), 924 (w) 847 (m), 835 (m) 775 (w) 669 (w)

534 (m), 457 (m), 444 (m) 403 (w), 347 (m) 284 (w)

172 (w), 110 (m), 87 (m)

a

2945 (vs), 2889 (vs) 2758 (w)

1620 (w), 1512 (w)

1448 (m), 1420 (w), 1394 (w) 1354 (m), 1327 (m)

1188 (w), 1136 (w) 1090 (w) 1032 (w)

991 (w), 966 (w), 922 (w) 872 (w), 853 (m), 826 (m) 800 (w)

768 (m), 748 (m), 710 (w) 675 (w)

556 (w), 536 (m), 484 (w), 424 (w) 388 (w), 363 (w) 139 (s), 85 (s)

δ(C—O—H)

284 (w) τ(6-CH3)

Abbreviations: vs, very strong; s, strong; m, medium; w, weak; b, broad; ν, stretching; δ, deformation or in-plane bending; τ, torsion; γ, our-of-plane bending; ω,

wagging; ρ, rocking; subscript s, symmetric; subscript as, antisymmetric.

图4 亮氨酸(a)和异亮氨酸(b)在饱和液态的拉曼光谱

Figure 4 Raman spectra of saturated solutions of leucine (a) and isoleucine (b)

2.1 亮氨酸和异亮氨酸的拉曼光谱

固态亮氨酸和异亮氨酸的拉曼光谱中, 对应基团振动峰位相差较大的有: 高强峰2960, 2933和2870 cm－1来自亮氨酸ν(C—H), 异亮氨酸的ν(C—H)在2945和2889 cm－1. 强峰位1454和1408 cm－1为亮氨酸的甲基非对称变形δas(CH3); 异亮氨酸的δas(CH3) 在1448, 1420和1394 cm. 962, 945和924 cm为亮氨酸CH3的摇摆

－1

－1

图5 异亮氨酸在不同pH值的SERS Figure 5 SERS of isoleucine at different pH

(a) pH＝12; (b) pH＝9; (c) pH＝7; (d) pH＝5

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的结合形式也有差异. 其中都以在碱性条件下各SERS较佳, 亮氨酸尤为显明. 亮氨酸和异亮氨酸的等电点均为6.0, 在溶液中略显酸性. 而碱性条件下, 利于COO－的存在, 氨基酸主要以此基团与银胶作用并被吸附到银胶表面, 如此还带动周围链和基团的吸附, 从而在不同pH值下产生不同的SERS.

碱性条件下(pH＝9, 12), 1464, 1337, 1113, 1057, 961, 849, 710, 428 cm－1为亮氨酸δas(CH3), δ(CH)和δ(NH), ν(C—C), γ(H—O…H), ρ(CH3), ρ(CH2), ν(C— CO), ρ(COOH); 1458, 1121, 1018和1036, 881, 851, 718, 407 cm－1为异亮氨酸δas(CH3), ν(C—C), γ(H—O…H), ρ(CH2), ω(COO－), ρ(COO－). 两者都通过COO－的化学作用和CH3, C—C的物理作用在银表面吸附, 但亮氨酸还有NH的参与(化学吸附)且SERS峰较强, 说明与银表面的作用更为有效. pH减小后, 异亮氨酸的羧基与银相互作用的有效性, 超过该分子其它基团. ω(COO－), δ(COO－)到酸性条件下, 其对应的SERS谱也未见太大削弱; 氨基的吸附作用有所增强且伴有SERS峰位的变化; 随着pH的减小, 亮氨酸分子中, δ(NH), δas(CH3), δ(NH)增强之外, 其余基团的SERS都被不同程度地削弱, 甚至ρ(CH2)在pH＝5时完全消失.

图6 亮氨酸在不同pH值的SERS Figure 6 SERS of leucine at different pH

(a) pH＝12; (b) pH＝9; (c) pH＝7; (d) pH＝5

2.3 亮氨酸和异亮氨酸在银胶表面吸附的模型

SERS机制分为电磁增强(物理增强)和分子增强(化学增强). 前者主要通过金属表面附近电磁场的等离子共振引起拉曼散射增强, 具有长程特性; 后者是由于分子和金属之间的化学吸附和相互影响产生的拉曼散射增强, 具有短程特性. 由亮氨酸和异亮氨酸的SERS可知, COO－振动增强最明显, 亮氨酸ρ(COO－) 428 cm－1; 异亮氨酸ω(COO－) 718 cm－1, COO－通过与银胶表面化学吸附作用而增强, 符合短程特性的分子增强机制; 同时, COO－的作用又带动与其紧密相连的C-2和C-3碳链, 甚至下一个碳链C-4. 由于在这两种异构体分子中C-3的构造不同, 显示出COO－的不同带动作用, 致使亮氨酸和异亮氨酸整个分子在银胶上的吸附状态及其COO－本身SERS的差别. 异亮氨酸分子中, 作为支链的C-6 (CH3), 受C-3所传递的“带动作用”要小于亮氨酸分子中位于主链上的6-CH3, 于是在1057 cm－1 ν(C—C), 亮氨酸的SERS峰强于异亮氨酸.

NH也有增强[δ(NH): 亮氨酸1337 cm－1; 异亮氨酸1339 cm－1], 表明它们也与银胶有吸附作用. 在水溶液中, 氨基上的H和H2O结合, 剩余的N利用其孤对电子与银配位, 形成分子-金属键, 产生化学吸附, 引起分子与银表面间的电荷能量转移共振增强. NH3与银胶吸附作用不如COO－的吸附强, 无“带动作用”, NH3也就构不成对整个分子在银胶表面吸附的影响.

ρ(CH3); 异亮氨酸对应的ρ(CH3)只在922 cm－1且伴有ν(C—C). 1238 cm－1为亮氨酸C—O—H的变形振动 δ(C—O—H); 异亮氨酸无此振动峰位. 此外异亮氨酸的C-6(如图2)与C-3连接引起C-6相对于C-1～C-5的整个碳链面的变形振动δ(skelet)峰在388和363 cm－1. 其余如284 cm C—H扭转τ(6-CH3), 与氨基、羧基相关的振动及晶格振动的低波段基本一致.

饱和态的拉曼光谱中, 固态亮氨酸的δ(CH), δ(NH) 由1340, 1313和1296 cm－1变为仅出现在1350 cm－1; 异亮氨酸类似其δ(CH), δ(NH)由固态时的1354和1327 cm－1变为1339 cm－1. 与亮氨酸在1250 cm－1的振动峰位相对应位置, 异亮氨酸无振动峰位. 对应固态拉曼光谱, 这一拉振动峰位归属于亮氨酸的δ(C—O—H). 其它位移, 在这两种氨基酸的饱和液态相差不大(图4).

振动峰的强度, 在ν(CH), δas(CH3), ν(C—C)基本一致, ν(O—H…O), ν(C—CO), ν(CN)等相差明显. 2.2 亮氨酸和异亮氨酸的SERS

氨基酸分子的电离状态受pH值影响较大, 不同pH值下异构体氨基酸的SERS (图5和6)显示, 与银胶基底

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另外, 在空间位阻上, 异亮氨酸分子的支链甲基更靠近与银表面相作用的羧基和氨基, 必然引起更强的阻碍作用, 致使异亮氨酸的SERS较差. 尤其在碱性条件下, 这种差异很明显.

亮氨酸和异亮氨酸以COO－和NH3通过化学吸附作用较为紧密地与银表面结合产生SERS, 因支链甲基在这对异构体中的不同构造, 引起COO－与银胶吸附后呈现出不同的“带动作用”和不同的空间位阻效应, 致使异构体的SERS出现差异.

分有益的参考.

References

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(蒋芸, 崔颜, 姚建林, 顾仁敖, 化学学报, 2006, 64(3), 240).

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Acta, Part A 1996, 52, 29.

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4 Nemec, I.; Micka, Z. J. Mol. Struct. 1999, 482～483, 23. 5 Nemec, I.; Micka, Z. J. Mol. Struct. 2001, 563～564, 295. 6 Mary, M. B.; Umadevi, M.; Pandiarajan, S.; Ramakrishnan,

V. Spectrochim. Acta, Part A 2004, 60, 2643.

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9 Lee, P. C.; Meise, D. J. Phys. Chem. 1982, 86, 3391.

3 结论

通过对这一对异构体氨基酸在固态、饱和液态的拉曼光谱及不同pH的SERS的研究, 揭示出因甲基在这对异构体中连接次序的不同, 导致分子中各对应基团呈现出拉曼位移的变化; 在SERS中, 这些变化更为明显地表现出来. 结合SERS作用的机理和规律, 初步推测了亮氨酸和异亮氨酸在银胶表面的吸附模型. 这为拉曼光谱更深入研究氨基酸、多肽及其它生物分子提供了十

(A0608053 LI, W. H.; FAN, Y. Y.)