白藜芦醇联合5

白藜芦醇联合5

李燕，邢克飞，李福洋，汪云，药立波，刘新平

【关键词】 白藜芦醇

Apoptosispromoting effect of resveratrol combined with 5FU on human breast cancer cell line MCF7

【Abstract】 AIM: To investigate whether 5FU in combination with resveratrol can accelerate the apoptosis of human breast cancer cell line MCF7 in vitro. METHODS: Four breast cancer cell lines (MCF7, MDAMB231, SKBR3 and Bcap37) were incubated with different concentrations of resveratrol or/and 5FU for 48 h, then cell survival rate was measured by MTT assay and cell morphological change was observed by phase contrast microscope. Apoptosis was detected by flow cytometry (Annexin V/PI staining) analysis and Hoechst33258 staining. RESULTS: Resveratrol could inhibit the growth of MCF7, MDAMB231, SKBR3 and Bcap37 to different extents. The IC50 values of resveratrol in MCF7, MDAMB231, SKBR3 and Bcap37 cells were 65, 207, 139 and 213 μmol/L, respectively. The IC50 value of 5FU in MCF7 cells was 13 μmol/L. When 5FU and 65 μmol/L resveratrol were combined, the IC50 value of 5FU in MCF7 cells was decreased to 9 μmol/L. Compared with the treatment with 13 μmol/L 5FU or 65 μmol/L resveratrol alone, the percentage of Annexin V(+)/PI(-) MCF7 cells increased when these 2 drugs were used in combination. The number of apoptotic MCF7 cells calculated with flow cytometry was accordant with the result got with Hoechst33258 staining. CONCLUSION:

Resveratrol interacts synergistically with 5FU to induce the apoptosis of MCF7 cells, which suggests that resveratrol is a secondary chemotherapeutic medicine for treating breast cancer.

【Keywords】 resveratrol; chemotherapy; apoptosis; breast neoplasms

【摘要】 目的：研究白藜芦醇联合5FU增进人乳腺癌细胞MCF7凋亡的作用. 方式：4种人乳腺癌细胞系（MCF7，MDAMB231，SKBR3和Bcap37）与不同浓度的白藜芦醇或／和5FU共孵育48 h，MTT法检测细胞存活率,并用相差显微镜观看细胞形态学改变. 用流式细胞术(检测细胞凋亡相关指标Annexin V/PI）和Hoechst33258染色检测细胞凋亡. 结果：白藜芦醇能够不同程度地抑制4种人乳腺癌细胞系（MCF7， MDAMB231，SKBR3和Bcap37）的生长. 白藜芦醇对MCF7，MDAMB231，SKBR3和Bcap37细胞的IC50（半数抑制浓度）别离为65，207，139和213 μmol/L. 单用5FU对MCF7细胞的IC50为13 μmol/L，联合利用5FU和白藜芦醇的IC50别离为9 μmol/L和3 μmol/L. 与单用组相较，65 μmol/L白藜芦醇和13 μmol/L 5FU联合利用后，MCF7细胞Annexin V水平升高. Hoechst33258荧光染色和流式细胞术分析MCF7细胞的结果一致. 结论：白藜芦醇与5FU合用可协同增进MCF7细胞凋亡，提示白藜芦醇可能用作医治乳腺癌的二线化疗药.

【关键词】 白藜芦醇；化疗；细胞凋亡；乳腺癌

0引言

中药植物的提取物与化疗药物的合理配伍，可大大提高肿瘤医治的疗效. 白藜芦醇(resveratrol)化学名称为芪三酚，化学结构为3，5，4’三羟基二苯乙烯(3，5，4’

_trihydroxystilbene)，分子式C14H12O3，Mr ，属非黄酮类多酚化合物，白藜芦醇可拮抗消化、血液、呼吸、生殖等多个系统来源的多种肿瘤细胞的增殖［1-4］，对肿瘤细胞的发生、增进、进展3个时期均有抑制作用［1］. 本研究将白藜芦醇与临床经常使用化疗药5FU联合应用，观看其对5FU在增进细胞凋亡中的增效作用.

1材料和方式

材料四种人乳腺癌细胞系MCF7，MDAMB231，SKBR3和Bcap37均为本室保留细胞；白藜芦醇（纯度大于99％，溶于500 g/L的丙二醇）由西安绿康天然药物研究所提供，历时用含10％小牛血清的RPMI 1640细胞培育液稀释至工作浓度；5FU购于第四军医大学附属一院西药房；RPMI 1640培育基为美国Gibco公司产品；小牛血清购自杭州四季青生物材料工程；四氮唑溴盐（MTT）、Annexin V/PI双标试剂盒和Hoechst33258购自美国Sigma公司；其余试剂均为国产分析纯. BX60荧光显微镜和倒置相差显微镜及照像系统为日本Olympus产品；遥控酶标分析仪为奥地利TECAN公司产品；FACSCalibur流式细胞仪为美国BD公司产品.

方式

法测定细胞存活率参考Yamaue等［5］的方式采纳对数生长期的细胞，倾出其培育液，用PBS洗细胞3次，加适量的胰蛋白酶消化并细胞计数后，将细胞按4×103~6×103/孔（不同种类细胞接种密度不同）分组加入96孔培育板，每孔200 μL. 按细胞系、化疗药品种及药物浓度分组，白藜芦醇实验组分为6个浓度组：2, 20, 40, 80, 200和400 μmol/L；5FU实验组参照其在人体的血浆顶峰浓度，选择其最顶峰值浓度的~20倍范围，分为6组：8, 80, 160, 320, 800和1600 μmol/L；联合用药实验组分为6组，别离是8, 80, 160, 320, 800和1600 μmol/L 5FU与65 μmol/L白藜芦醇联用. 每种药物浓度接种5复孔，每组

设阴性对照组（培育液中只有细胞，无药物）和空白对照组（培育液中只有等量的药物，无细胞）. 细胞常规培育24 h后，将培育液换成含不同浓度药物的培育液，培育板置于CO2培育箱，在37℃，50 mL/L CO2条件下继续培育48 h，倒置相差显微镜观看细胞生长状态并拍照. 然后掏出全数培育板，每孔加入MTT溶液（5 g/L） 20 μL，再继续培育4 h，警惕吸出培育液，每孔加入150 μL二甲基亚砜，振荡10 min，使沉淀充分溶解，用酶标仪在490 nm波长下测定光密度，计算肿瘤细胞存活率. 计算公式为：细胞存活率＝(实验组光密度－空白对照组光密度)／（阴性对照组光密度－空白对照组光密度）×100％.

流式细胞仪分析细胞凋亡依照Annexin V/PI双标试剂盒说明，用双蒸水1∶4稀释结合缓冲液，PBS洗涤样品细胞后，以稀释的结合缓冲液重悬细胞，并调整细胞浓度为2×105~5×105／mL. 取195 μL细胞悬液，加入5 μL Annexin V混匀，室温反映10 min，PBS洗细胞一次，再以190 μL稀释的结合缓冲液重悬，加10 μL (20 μg／mL) PI，用流式细胞仪分析. 每样本搜集1×104个细胞荧光信号，采纳Cellquest软件分析结果.

荧光染料染色观看细胞核形态的改变药物处置后的细胞用PBS洗涤并重悬，加入浓度为5 μg／mL的Hoechst33258荧光染料反映10 min，于荧光显微镜下观看并拍照图像. 观看细胞核形态，以细胞萎缩、核固缩、染色质凝聚和荧光强度增强等作为凋亡细胞指征.

统计学处置：数据以x±s表示，采纳SPSS 统计软件进行分析. 行多个独立样本两两比较的Nemenyi法查验，P<为不同有统计学意义.

2结果

实验检测细胞存活率①白藜芦醇对4种乳腺癌细胞生长的抑制作用：MTT实验检测细胞存活率并绘制细胞生存曲线，曲线说明白藜芦醇能抑制4种乳腺癌细胞的生长，测得白

藜芦醇对MCF7细胞的IC50 (半数抑制浓度)为65 μmol/L，对MDAMB231，SKBR3和Bcap37细胞的IC50别离为207，139和213 μmol/L（图1）. ②5FU和白藜芦醇联用对MCF7细胞生长的阻碍：MTT实验测得，5FU单独作用于MCF7细胞的IC50为13 μmol/L，5FU和65 μmol/L白藜芦醇联合利用作用于MCF7的IC50降低到9 μmol/L.

图1白藜芦醇对人乳腺癌细胞系MCF7，MDAMB231，SKBR3和Bcap37生长的抑制作用（略）

倒置相差显微镜下观看细胞形态随着药物浓度的增加，与阴性对照组相较，白藜芦醇实验组中MCF7细胞数量慢慢减少，细胞形态发生明显改变. 5FU实验组与阴性对照组相较，在较低的药物浓度下，细胞的数量和形态就有明显转变，但专门快进入平台期，随药物浓度的增加，细胞的数量和形态转变不明显. 联用5FU和白藜芦醇于MCF7细胞，与阴性对照组相较，48 h后镜下可见到：随着药物浓度的增加，细胞数量慢慢减少，细胞形态发生明显改变，没有显现平台期（图2）. 且上述细胞形态学改变与MTT实验结果具有相同的趋势.

V/PI检测细胞凋亡凋亡初期，细胞内膜的磷脂酰丝氨酸移位到细胞外膜，荧光标记的Annexin V极易与细胞外膜的磷脂酰丝氨酸结合从而使其染色. MCF7细胞经65 μmol/L白藜芦醇联合13 μmol/L 5FU处置48 h，细胞凋亡率明显高于两药别离单用（n=3，P<），其中联用组细胞凋亡率为（±）％；而65 μmol/L白藜芦醇、13 μmol/L 5FU和对照组别离为（±）％，（±）％，（±）％. 图2单用白藜芦醇、5FU和联用5FU加白藜芦醇（65 μmol/L） 48 h后MCF7细胞的形态学改变×200（略）

凋亡细胞的形态学经Hoechst33258荧光染料染色，荧光显微镜下，正常细胞染色质均匀，核形态规那么（图3A）. 65 μmol/L白藜芦醇或13 μmol/L 5FU作用48 h后，凋

亡细胞即可显现，呈现细胞体积缩小，核固缩，染色质凝集、碎裂；两种药物联用后，凋亡细胞数进一步增加，形态学特点加倍典型（图3B~D）.

3讨论

白藜芦醇能通过降低血液中胆固醇、抑制脂质过氧化而减少动脉粥样硬化、高血脂症的发生，能抑制血小板聚集从而阻止血栓形成，还有抑制自由基生成等作用［6-7］. 白藜芦醇抑制心血管疾病的普遍作用已经有很多研究. 新近实验证明，白藜芦醇能抑制乳腺上皮癌细胞的恶性生长、小鼠肝癌细胞恶变［1］，具有抗炎作用［8］. 这些实验结果已引发普遍关注.

本实验结果说明，白藜芦醇能在体外抑制4种人乳腺癌细胞系的生长，且随着剂量的增加，细胞生存率显著降低. 咱们发觉不同浓度白藜芦醇对细胞生长的阻碍不同，2~20 μmol/L的白藜芦醇增进细胞的生长，细胞生存率>100%；大于40 μmol/L浓度时，细胞生存率随药物浓度的增加而降低，这可能是“毒物兴奋效应”［9］.相差显微镜下可见，不同药物组干与后，MCF7细胞数量和形态的改变与MTT实验结果一致.

A:阴性对照；B:65 μmol/L白藜芦醇；C:13 μmol/L 5FU；D: 65 μmol/L白藜芦醇+13 μmol/L 5FU.

图3单用白藜芦醇、5FU和联用5FU加白藜芦醇诱导MCF7细胞凋亡的荧光染色×1000（略）

动物实验说明，5FU抑瘤率较高，同时其毒性反映也较重，要紧表现为厌食、腹胀、精神萎靡、消瘦等病症；而白藜芦醇单历时无此类病症，和5FU联历时病症较轻，厌食、

腹胀及消瘦不明显，说明白藜芦醇可减少化疗药物5FU对机体的毒性反映［10］. 本实验以MCF7细胞为要紧研究对象，联用5FU和白藜芦醇后，MCF7细胞的生存曲线较单用5FU的生存曲线明显向左下方偏移，说明白藜芦醇能明显增强化疗药物5FU的抑癌成效. 65 μmol/L的白藜芦醇与13 μmol/L的5FU表现出明显的协同效应，两药联合应用后，凋亡细胞比例明显比单用任一种时升高. Hoechst33258荧光染色的实验结果也说明白藜芦醇能够增进5FU对MCF7细胞的促凋亡作用. 因此，白藜芦醇作为医治乳腺癌的二线化疗药具有广漠的应用前景，这关于临床上提高抗癌化疗药物的医治指数、降低毒副反映及延长患者的寿命，具有重要的意义.

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