LPS和抗LPS治疗的研究及应用进展

LPS和抗LPS治疗的研究及应用进展

靖学芳　综述;安云庆　审校(首都医科大学免疫系,北京　100054)

摘　要:细菌脂多糖LPS是革兰阴性菌致病的关键因子,可作为抗感染药物治疗的作用靶位。本文主要对LPS结构和功能及致病机制和抗LPS治疗策略的研究和应用进行综述,为临床上内毒素介导的感染性疾病的防治提供一定的依据。

关键词:GNB;LPS;败血症(Septicemia);内毒素血症(Endotoxemia);感染性休克(Infectiousshock)中图分类号:R392.1　　　文献标识码:A　　　文章编号:100525673(2004)0220053205

　　革兰阴性菌(Gram2negativebacteria,GNB)感染败血症、内毒素血症及其休克的临床病死率很高,是抗

感染治疗中一大难题。GNB感染时,细菌和/或脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)即内毒素(Endotoxin)进入血循环,激活多种炎症细胞释放炎性介质,引起炎症反应,严重时会导致多器官功能衰竭。LPS是GNB致病的启动因子,可作为药物治疗的作用靶

综合症(包括休克),严重时会引起弥漫性血管内凝血,导致多脏器功能衰竭。LPS还可直接或间接诱导免疫细胞凋亡,抑制机体免疫功能,从而加重败血

2〕症的发病〔。2　LPS的致病机制

有几种重要分子参与LPS致病过程,包括LPS结合蛋白(LBP)、膜CD14(mCD14)、可溶性CD14(sCD14)、CD11/CD18复合体及单核2吞噬细胞上Toll2like受体(TLRs)等。LPS在LBP介导下与靶细胞膜上LPS受体结合,经膜受体将LPS信号传入细胞内,激活一系列蛋白激酶组成的信号通路,最终引

κ起转录因子NF2B、AP21等的活化,转位于核内,启动某些细胞因子和炎性介质的基因表达。LPS信号

传导通路是内毒素致病过程的关键机制。2.1　LPS受体

CD14是LPS受体,是由356个氨基酸组成的富含亮氨酸重复序列的糖蛋白,分子量为50～55kD,在1～152位氨基残基内有LPS结合位点。mCD14属于模式识别受体,它通过糖基化磷脂酰肌醇(GPI)末端锚定在单核2吞噬细胞表面。sCD14参与LPS对不表达mCD14的细胞(如内皮细胞、上皮细胞等)的激活,还可与mCD14竞争结合LPS,以减轻LPS对单核2吞噬细胞的激活。实验证明:给败血症小鼠模

3〕

型注射重组sCD14可降低小鼠死亡率〔。有关sCD14作用的确切机制仍不清楚。

目前认为LPS受体是一种“复合受体”。CD14直接结合LPS,但因无跨膜区,故不能向细胞内传递信号,推测可能存在其他与CD14相关的信号传导

位。1　LPS的结构和功能

LPS是GNB外膜的主要成分,由类脂A、核心寡聚糖和O2特异性多糖侧链三部分组成。最内层的类脂A是LPS的主要生物活性部分,其结构是由焦磷酸键连接而成的葡糖胺聚二糖链,链上结合有多种中长链脂肪酸,高度保守,无种属特异性,不同GNB引起的毒性作用大致相同。核心寡聚糖位于类脂A外层,由22酮232脱氧甘露辛酮糖酸、磷酸乙醇胺、庚酸等组成,结构易变,有种属特异性。LPS最外层是若干重复的多糖侧链,组成完整的O抗原,GNB不同则组成例链的单糖种类、排列顺序也

1〕

不同,决定了GNB的种型特异性〔。

LPS在GNB外膜渗透性和流动性的维持及其致病过程中起主要作用。LPS释放入血循称为内毒素,是激发机体非特异性免疫功能的重要分子。LPS有双重作用,低浓度时可刺激机体免疫系统,增强固有免疫功能,如LPS可直接激活补体的旁路途径等;高浓度时会引起广泛而强烈的炎症反应,激活单核2

α、吞噬细胞、内皮细胞等,释放TNF2IL21、IL26、IL28、氧自由基、NO、组胺等炎症介质,诱发全身炎症反应

收稿日期:2003211224

作者简介:靖学芳(19692),女,吉林大学免疫学博士,主要从事

抗感染免疫研究。

54　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　微生物学免疫学进展2004年第32卷第2期分子。TLRs的发现加深了人们对LPS信号传导机制的认识。在固有免疫应答中,TLRs主要识别入侵病原微生物上高度保守的结构基序(Motif),即病原相关的分子模式(Pathogen2associatedmolecularpat2tern,PAMP)。PAMP存在于细菌多种成分(如甘露糖、脂多糖、肽聚糖等)中,靶细胞上TLRs识别PAMP后可通过其胞内区TIR(Toll/IL21Receptor)结构域激活一系列接头蛋白和蛋白激酶,如MyD88(Myeloiddifferentiationprimaryresponsefactor88)和I2RAK(IL21receptor2associatedkinase)的信号级联传递,κ即TLR(IL21R)ϖMyD88ϖIRAKϖκIBϖNF2B转录4〕

因子的转位,诱导炎性细胞因子的表达〔。现已发现人类有10种TLRs,其中TLR4和TLR2可识别LPS。CD14、TLR4和MD2共同组成LPS受体信号传导复合体,其中TLR4传导LPS刺激信号,MD22与TLR4胞外区结合,提高TLR4对LPS的敏感性,增加5〕LPS受体复合体的稳定性〔。有人认为β2整合素(CD11/CD18)是所有GPI锚

3　抗LPS治疗策略

3.1　LPS结合蛋白(Lipopolysaccharidebindingpro2

tein,LBP)

LBP是由452个氨基酸组成的分子量为58～60kD的急性期蛋白。正常人LBP血清含量低于0.5mg/L,急性感染时含量可升高50～100倍。LBP可

结合LPS,但无杀菌和中和LPS的作用,其N末端能以高亲和力结合类脂A组成LBP2LPS复合体;其C末端可将LPS呈递给单核2吞噬细胞、中性粒细胞表面LPS受体,从而导致细胞活化产生一系列炎症因子(如IL21、6、8等),引起炎症反应。LBP在LPS介导的病理生理过程中发挥双向作用,一方面,LBP将LPS运至靶细胞膜mCD14上,诱发炎症反应;另一方面,LBP能与sCD14共同将游离LPS转运到血浆高密度脂蛋白(HDL)颗粒上,促进血循环中LPS的降

8〕解失活〔。目前认为,在内毒素血症早期,LBP可识别pmol级的LPS,放大LPS效应以充分诱导机体的固有免疫功能:随着LPS的增加,LBP将LPS转运到HDL上,并穿梭于CD14/LPS和HDL/LPS之间以维

9〕

持一种动态平衡〔。临床观察发现:血清中LBP含10〕量高的患者转归较好〔。LBP衍生肽NH2LBP和BG43可明显抑制LPS介导的巨噬细胞的激活和

11〕

TNF的分泌,降低实验动物脓毒症的病死率〔。3.2　杀菌/渗透性增强蛋白(Bactericidal/Permeabilityincreasingprotein,BPI)

定蛋白的共同信号传导子。将β2整合素基因转染到对LPS低应答的CHO细胞后,发现CHO细胞对LPS应答增强;但将无胞内区的β2整合素变异体转染后,仍可见CHO细胞对LPS的应答反应,可见β2整合素并不是通过胞内区传递LPS信号,确切机制

6〕

不明〔。

最近提出另一种胞内LPS识别系统,包括NOD蛋白家族NOD1和NOD2。它们是Apaf1/Ced4cas2pase激活物,含有核苷结合位点和亮氨酸重复序列

κ富集区,可结合LPS以TLR4非依赖途径介导NF2B

7〕

的活化〔。2.2　LPS胞内信号传导途径

LPS激活靶细胞的信号传导通路是一个复杂的

天然BPI存在于中性粒细胞嗜天青颗粒中,由

456个氨基酸组成,分子量约为55kD。BPl及其功能性氨基端片段对GNB如大肠杆菌、沙门氏菌、志贺痢疾杆菌、绿脓杆菌、变形杆菌和奈瑟球菌等均有抑制、杀伤作用。现已证实,BPI及其功能性N端片段具有广谱抗菌、中和游离LPS、抑制炎性介质释放、减轻内毒素血症和防止休克发生等一系列生物学作用。BPI与LBP间约有40%的同源性,二者对LPS的结合能力基本相同,但结合后所引起的生物学效应却不同,BPI可与LBP竞争结合游离LPS,有效调节宿主细胞对LPS的应答,减轻毒性反应。

近年来,有关BPI及其功能性N端片段(rBPI23

和rBPI21)的抗感染免疫作用的研究己取得较大进展,在GNB败血症、慢性渗出性耳炎动物模型中的应用,均获得满意的结果。目前已应用于临床脑膜炎菌血症患者、创伤性失血及其并发症患者和肝部分切除及其并发症患者的治疗,疗效显著。可见BPI及其衍生物有非常广阔的临床应用前景,但是在临床应用中存在成本高、用量大、半衰期短等问

网络系统,除TIR信号通路外还有有丝分裂原激活

的蛋白激酶(MAPK)、蛋白酶C和磷脂酰肌醇23激酶等途径,研究较多的是MAPK途径。当LPS与相应受体结合后,TLRs胞浆区与MyD88的羧基端相互作用,MyD88用其死亡结构域募集IRAK,IRAK磷酸化后结合TNAF6(TNFR2associatedfactor6),TRAF6再

κ活化MAP3K家族成员NIK(NF2B2inducingkinase),

磷酸化的NIK可激活κIB激酶,使其泛素化而脱离κκκIB/NF2B,NF2B被活化转位入细胞核,诱导一系列特定基因的表达。TLRs介导的LPS信号转导途径还需进一步研究,不过其中的信号传导分子(如I2RAK和TRAF6等)可作为潜在的药物靶分子,对它们的抑制和激活能调节机体的免疫应答能力。

微生物学免疫学进展2004年第32卷第2期　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　55

题,许多国内外学者正利用基因工程、计算机分子模拟设计等技术生产和合成rBPI功能性片段及其模拟肽,己得到与BPI生物学功能相同的、生产工艺简单、成本较低的重组蛋白和模拟肽。安云庆等采用

γ原核表达系统生产的rBPI232Fc1融合蛋白不仅保持高亲和性结合和中和LPS、杀伤GNB等作用,而且

具有血清半衰期较长、固定补体和促进调理吞噬等

12〕

功能,能够最大限度的发挥二者的抗感染优势〔。3.3　抗LPS抗体、疫苗和LPS衍生物

抗LPS抗体包括针对菌体O抗原的种属特异性抗体、针对核心抗原的广谱抗体和针对类脂A的单克隆抗体,其中O抗体因具有型特异性限制其在临床的应用。第一种抗LPS抗体是热灭活的E.coliOlll突变株J5人免疫血清,败血症病人接收J5血清治疗组比对照组的病死率下降,但重复实验未得到满意效果,原因可能是血清抗体滴度无法控制,再加13〕

上来源受限,故此类抗体未能推广应用〔。针对类脂A的单克隆抗体HA21A(人IgM)和E5(小鼠IgM),HA21A可明显降低GNB败血症患者的死亡率,E5对GNB感染而非休克的治疗有效。Angus等用E5进行双盲随机试验,结果只是休克治疗组比对

14〕

照组死亡率稍有下降,无统计学差异〔。抗类脂A单克隆抗体特异性差、作用弱、临床结果不一致限制了此类抗体的应用。

抗LPS疫苗策略的目的是产生内源性广谱抗LPS抗体,以识别和中和多种血清型LPS。临床上LPS核心抗体血清含量高的患者比无此抗体的患者

道,但结果不一致。给予抗CD14单克隆抗体IC214可明显降低小剂量LPS诱导的炎症反应,IC214以2～4mg/kg剂量用药4天足以使外周血90%单核细胞上mCD14饱和7天,IC214治疗败血症的Ⅱ期临

17〕18〕

床试验已完成〔。Triantafilou〔等用荧光标记的LPS攻击内皮细胞,研究发现抗CD14单克隆抗体只能阻断低剂量LPS(<100ng/ml)和内皮细胞的结合,

提示LPS在高浓度时还依赖其他非CD14途径来激活内皮细胞。

TLR4抑制剂(E5564和E5531)是合成的类脂A拮抗物,结构上类似类脂A但磷酸化程度和脂肪酸组成不同于类脂A,比天然LPS脂肪酸(12～14C)长或短,可竞争结合靶细胞上的LPS受体中TLR4,抑制LPS与TLR4的结合及后续信号传递。E5531可明显抑制LPS活性,减轻LPS体内毒性作用,但是否对已产生LPS损伤的败血症患者有效仍不确定。

19〕

Gardinali〔等在兔的腹膜炎模型中预先给予CD11/CD18特异性单抗的治疗组比对照组死亡率降低40%,但疗效并不持久,只在早期应用时有一定的保护作用。3.5　其他LPS拮抗物

存活率高。现已研制出一种由N.meningitidisB型外

膜蛋白和E.coliJ5LPS核心结构组成的LPS疫苗,能诱导针对LPS核心多糖的多克隆抗体,对GNB败血症动物模型有保护作用,正进行防治GNB感染败

15〕

血症的临床前研究〔。

单磷酸类脂A(Monophosphory1lipidA,MPLA)是类脂A经酸水解后失去12磷酸而生成的LPS低毒衍生物,研究表明:MPLA能诱导内毒素耐受性,呈剂量依赖性地减少内毒素所诱导的TNF、CSF及IL21

γ等细胞因等的释放,原因可能是MPLA刺激IFN2

子的聚积,使巨噬细胞预致敏,诱导位于细胞膜LPS

κ受体下游和细胞内MAPK及NF2B激活链分支点上

游的关键LPS信号转导分子处于不应期,从而诱导

16〕

LPS耐受性〔。目前用MPLA预防内毒素血症及休

循环中LPS的代谢清除涉及肝细胞和脂蛋白。

低密度载脂蛋白(LDL)和HLD等能通过结合和中和LPS调节机体对GNB感染的应答。Kasravi等研究发现富含甘油三脂的脂蛋白如乳糜微粒(CM)和极低密度脂蛋白(VLDL)能促进LPS向肝细胞转运和内化、诱导脂蛋白受体(LDLR、LRP)介导的对炎症因

α和IFN2γ)刺激的耐受,降低肝细胞子(IL21、TNF2

α、TNF2NO和急性期蛋白的产生,可见内毒素血症发生时血中富含甘油三脂的脂蛋白升高对宿主有保护

20〕作用〔。脂蛋白可能通过以下途径减轻LPS毒性:①直接结合游离LPS阻止LPS激活炎症细胞;②促进已与炎症细胞结合的LPS发生解离。

血清淀粉样P组分(SAP)是一种高度保守的血浆糖蛋白,由10个糖蛋白小亚基组成,每个亚基至少有3个类脂A结合区(如pep27～39、pep61～75和pep186～200),这些位点相应的人工合成肽可抑制

LPS诱导的炎症反应,延长实验动物的存活期;但发

现SAP可抑制补体介导的溶菌作用,因此必须重新

21〕

评价SAP在GNB感染中的作用〔。人阳离子抗微生物多肽(hCAP)主要包括CAP18和CAP37,主要存在于人中性粒细胞颗粒中。CAP及其衍生肽pep106～142、pep20～44可与类脂A结合,阻止LPS2LBP复合物的形成,减少LPS与TLR2和TLR4结合,从而

克的II期临床试验正在进行。

3.4　LPS受体拮抗物

应用抗CD14抗体治疗内毒素血症已有许多报

56　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　微生物学免疫学进展2004年第32卷第2期〔3〕　HaziotA,GuoRW,LinXY,etal.RecombinantsolubleCD14pre2

ventsmortalityinmicetreatedwithendotoxin(lipopolysaccharide)

降低LPS毒性作用。LPS信号传导途径中的关键分

κ子NF2B的抑制物,如吡咯烷2二硫代氨基甲酸酯和α2苯甲酰氨基21,42萘醌等在脓毒血症动物治疗中显示一定的治疗效果。

另外,多种清热解毒的中草药如黄连、黄芩、板蓝根等能中和内毒素,降低LPS毒性。3.6　降低LPS合成和释放的策略

临床治疗GNB感染时,不适当的抗生素治疗会增加败血症死亡率,因此选择敏感抗生素时还应考虑其引起的LPS释放。多种抗菌药如β内酰胺类、氨基糖苷类抗生素可引起不同程度LPS释放。特别是β内酰胺类,如哌拉西林(Piperacillin)、头孢呋辛(Cefuroxime)、氨曲南(Aztreonam)等能诱导多种细菌释放大量LPS。抗生素诱导GNB释放LPS的能力与其对不同类型青霉素结合蛋白(PBP)的亲和力有22〕关〔,上述三种低剂量应用(小于最低抑菌浓度)时主要与PBP3结合,可使GNB菌体裂解前出现丝状棒样变化,生物量集聚缓慢释放大量LPS;高剂量应用(大于10倍最低抑菌浓度)时与PBP1结合,引起GNB球样改变,快速裂解释放少量LPS。其他与PBP1/2结合的药物如碳青霉烯(Carbapenems)、万古霉素(Vancomycin)、太古霉素(Teicoplanin)等可快速杀灭GNB菌释放少量LPS,可供选择应用。4　结语

在临床前和临床干预试验中己证实LPS在GNB感染性疾病及其休克发生中的关键作用。虽然一些抗LPS制剂治疗GNB感染动物模型获得了一定的效果。但抗LPS治疗能否明显降低感染性休克的病死率仍无足够的临床依据,无法证实去除内毒素对已形成败血症休克的病人有何益处,仍需进一步验证特异性内毒素抑制剂的治疗价值。抗LPS治疗策略的研究方向可从以下几个方面深入:①进一步阐明LPS释放、致病和耐受形成的分子机制,采用多位点药物阻断疗法和诱导LPS耐受的方法;②筛选合理有效的抗LPS制剂与抗生素的联合用药方案;③开发安全高效的LPS特异性中和蛋白/肽类基因工程制剂;④从基因水平上寻找可调节宿主对入侵病原体及其产物的应答能力的治疗策略。参考文献:

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・读者・作者・编者1

正确使用统计学符号根据国家《统计名词及符号》的规定,算术平均数用英文小写斜体󰁡x;标准差用英文小写斜体s;标准误用英文小写斜体s加下角,即s󰁡x;t检验用英文小写斜体t;F检验用英文大写斜体F;卡方检验用希文小写斜体χ2;相关系数用英文小写斜体r;自由度用希文小写斜体υ(组);概率用英文大写斜体P;样本数用英文小写斜体n。

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