开题报告-产纤维素酶细菌的筛选

山 东 科 技 大 学

本科毕业设计（论文）开题报告

题 目 产纤维素酶细菌的分离和筛选

学 院 名 称 化学与环境工程学院 专业班级 生物工程06-2 学生姓名 董超 学 号 0601111003 指 导 教 师 韩秋霞

填表时间： 2010年4月4日

填表说明

1.开题报告作为毕业设计（论文）答辩委员会对学生答辩资格审查的依据材料之一。

2.此报告应在指导教师指导下，由学生在毕业设计（论文）工作前期完成，经指导教师签署意见、相关系主任审查后生效。

3.学生应按照学校统一设计的电子文档标准格式，用A4纸打印。 4.参考文献不少于8篇，其中应有适当的外文资料（一般不少于2篇）。 5.开题报告作为毕业设计（论文）资料，与毕业设计（论文）一同存档。

设计（论文） 题目 设计（论文） 产纤维素酶细菌的分离和筛选 工程实际 应用研究 实验室建设 理论研究 √ 其它 类型（划“√”） 一、本课题的研究目的和意义 纤维素（cellulose）作为植物光合作用的主要多糖类产物，是高等植物细胞壁的主要成分，是公认的自然界数量最丰富、最廉价的可再生有机物质资源，据估计，纤维素生成量每年高达1000 亿吨[1]。我国每年农作物秸秆总产量为7 亿吨左右，仅农业生产中形成的农作物残渣（如稻草、玉米秸、麦秸等），每年就有5 亿吨之多。纤维素的降解是自然界碳素循环的中心环节。但由于纤维素的结构特点，对纤维素的利用仍然非常有限， 目前仅有20%的纤维素物质被开发利用，大量的纤维素物质因无法分解利用而废弃，不仅造成资源浪费，而且污染环境。随着人口数量的不断增长和人民生活水平的不断提高，能源危机、食物短缺、环境污染等问题日益严重，寻找利用可再生资源、节省粮食、减少环境污染的有效途径显得日趋重要。 采用微生物技术处理秸秆是当前研究最多的一种秸秆处理方法,纤维素酶能将天然纤维素降解,生成纤维素分子链、纤维二糖和葡萄糖,然而目前制约纤维素材料转化为乙醇并实现产业化的关键因素之一是纤维素酶效率低下,从而造成生产成本过高。因此,筛选具有高活性纤维素酶[7]的秸秆降解微生物菌株以及相关研究是当前研究的热点和难点。目前研究较多的是霉菌,其中木霉[2 ]、曲霉、根霉和青霉均具有较强的酶活力,而对细菌的研究很少有报道。由细菌所产生的纤维素酶一般最适pH 为中性至偏碱性。近20年来,随着中性纤维素酶和碱性纤维素酶在棉织品水洗整理工艺及洗涤剂工业中的成功应用,细菌纤维素酶制剂已显示出良好的应用前景。 二、本课题的主要研究内容（提纲） 1、筛选纤维素分解菌所用培养基的选用 2、纤维素分解菌筛选的环境条件 3、纤维素分解菌的菌种鉴定 4、初步测得所筛分解菌的酶活 三、文献综述 1、纤维素分解性细菌 纤维素分解性细菌能分解纤维素的细菌。由于纤维素酶等的作用，纤维素可一直被分解到葡萄糖为止，有时在分解过程中会积累纤维二糖。这类细菌多见于腐植土中。好氧性细菌如纤维单胞菌属、纤维弧菌属、噬胞菌属等能分解纤维素；但在好氧条件下土壤中纤维素的分解，主要是纤维素分解真菌在起作用。而在厌氧条件下纤维素的分解，一些厌氧性的芽孢梭菌属的细菌具有重要作用。纤维素分解细菌亦可栖息于草食动物的消化道、特别是反刍动物的瘤胃中。它们在其中进行分解纤维素的活动，这些细菌是厌氧性细菌，例如产琥珀酸拟杆菌、牛黄瘤胃球菌、白色瘤胃球菌、溶纤维丁酸弧菌等。 2、纤维素酶的种类 纤维素酶是指能够降解纤维素生成葡萄糖的一组酶的总称，是由三类起协同作用且具有不同催化反应功能的酶组成的多酶体系，根据其催化功能的不同将其分为： Cx 酶，又称葡聚糖内切酶、内切型纤维素酶（endo-1.4-β-D,glucanase，EC 3.2.1.4，来自真菌的简称EG，来自细菌的简称Len），这类酶作用于纤维素内部的非结晶区，随机水解β-1,4 糖苷键，将长链纤维素分子截短，产生大量带非还原性末端的小分子纤维素。Cx 酶分子量介于23~146 ku 之间[5 ]。 C1 酶，又称葡聚糖外切酶、外切型纤维素酶、纤维二糖水解酶(exo-1.4-β-D-glucanase),EC 3.2.1.91,来自真菌的简称CBH,来自细菌的简称Cex),这类酶作用于纤维素线状分子末端，水解1，4-β-D 糖苷键,每次切下一个纤维二糖分子，故又称为纤维二糖水解酶[9 ]（cellobiohydrolase），C1 酶分子量介于38~118 ku 之间。 β-葡萄糖苷酶[6 ]（β-1.4-glucosidase，EC 3.2.1.21，简称BG），这类酶一般将纤维二糖水解成葡萄糖分子，β-葡萄糖苷酶分子量约为76 ku。这三类酶均具有专一性，但能相互协调，在这三类酶的协同作用下,将纤维素最终降解成为葡萄糖。 3、筛选方法 样品采集。腐烂的含菌秸秆、腐叶、朽木、土壤等取自湖北、江苏、浙江。 样品处理。将采集到的样品用无菌水洗涤后,吸取上清液进行梯度稀释,将稀释液涂布在选择培养基—羧甲基纤维素钠(CMC) 平板上,28 ℃恒温培养。 菌株纯化。平板培养48 h 后,从培养基上挑取菌落于CMC 平板上划线分离纯化,获得的菌株分别转接于CMC平板上。 初筛 将细菌、真菌的单菌落分别点种在CMC 平板上,37 ℃培养48 h ,用刚果红染色10 min 后,再用NaCl 脱色5min ,根据透明圈直径及其与菌落直径之比的大小选择产酶量高的菌株。 通过刚果红鉴定板来鉴定产纤维素酶菌是一种快速简便的筛选方法,透明圈直径和鉴定板孔径大小的比值能够直接反映该菌产纤维素酶的能力,其原理是刚果红是一种能够和大分子多糖相结合的染色剂,染色之后能和纤维素结合形成红色,产纤维素酶菌在CMC 平板上培养后产生的纤维素酶[8 ]将纤维素水解成小分子的还原糖,在用刚果红染色之后没有被水解的纤维素能够和刚果红结合显红色,而水解的部位则不能和刚果红结合而出现透明圈[4 ] 。 四、拟解决的关键问题 1、纤维素分解菌的土样的选取 2、筛选纤维素分解菌所用培养基的选用 3、纤维素分解菌筛选时环境条件的选择 4、纤维素分解菌产生的透明圈的大小的测定 5、纤维素分解菌的获得及保藏 五、研究思路和方法 研究思路： 首先，样品采集共3 样,用于分离选育纤维素降解菌。配制液体培养基，37℃培养2天富集菌种。然后取富集后的培养液分别配制不同梯度稀释液进行平板涂布操作。将涂布好的培养皿放在37℃下倒置培养65h，进行初筛。配培养基时加入刚果红，通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。最后是产纤维素酶菌酶活测定，采用测定菌的直径和透明圈直径的比值大小，选出产纤维素酶的菌株。 方法 1、样品采集 从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层土3cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。土样的采集要在富含纤维素的环境中进行，这是因为在纤维素含量丰富的环境中，通常会聚集较多的分解纤维素的微生物（如果找不到合适的环境，可以将滤纸埋在土壤中，过一个月左右也会有能分解纤维素的微生物生长）。共3 样,用于分离选育纤维素降解菌。 2、培养基的配制 液体培养基：250mL锥形瓶中装入100mL培养基，用锡箔将瓶口包紧，在外包裹两层包装纸，用线绳扎紧，121℃下高压蒸汽灭菌20min。 初筛（复筛）培养基：两个500mL锥形瓶中装入400mL培养基，用锡箔将瓶口包紧，在外包裹两层包装纸，用线绳扎紧，121℃下高压蒸汽灭菌20min。 3、富集 在无菌条件下，取样品粉末各5g，分别加到3个无菌三角瓶(含30mL 富集培养基)中,37 ℃ 条件下, 用封口膜包扎后摇床培养48h。记录菌液的形态、颜色等。 4、初筛 取富集后的培养液分别配制不同梯度稀释液,等比稀释到10 – 6、10 – 7、10 – 8、10 – 9稀释度，并按照由10 – 9至10 – 6稀释度的顺序分别吸取0.1mL进行平板涂布操作。将涂布好的培养皿放在37℃下倒置培养65h。随着培养时间的延长，会有不同的菌落产生。菌落的数量、形态等，做好记录。通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。 5、复筛 选择有明显透明圈的菌落的平板，无菌条件下，用接种针挑取单菌落点种于复筛掊养基上，37 ℃ 条件下,倒置培养48h左右，直到得到纯菌落为止。测量透明圈直径和菌落直径，根据透明圈直径和透明圈直径与菌落直径的比值的大小，得到的比值较大的为高产纤维素酶高产菌。也可测水解圈直径, 并计算酶的相对比活力: A= 水解圈直径/ 天数，其水解圈直径/ 天数比值大致反映酶活力高低。 6、菌种鉴定 通过革兰氏染色对初筛酶活较高的菌株[19]作形态学观察，并观察是否有芽孢产生，从而对细菌作出鉴别。 7、菌种保存 在无菌条件下，将所得菌种接种于斜面培养基中37 ℃培养48h ,然后4 ℃低温保存，以备后用。 8、纤维素酶活测定 利用DNS法以测定葡萄糖的产生量测定纤维素酶的活力。 9、结论 通过CMC 固体培养基培养,刚果红染色、NaCl 脱色,根据透明圈直径和透明圈直径与菌落直径之比的大小及DNS法测定纤维素酶的活力获得了产纤维素酶活较高产纤维素酶菌种。 六、本课题的进度安排 第1～2周：查阅和整理文献资料，确定实验方法。 第3周：准备实验所需药品试剂。 第4周：进行出发菌株土样的选择。 第5周：对出发菌株进行富集培养，制作菌悬液。 第6～9周：对菌悬液浓度梯度稀释涂布进行初筛。 第10～12周：挑取含透明圈的菌落进行涂布复筛。 第13周：纤维素分解菌菌株的保藏。 第14～15周：实验数据整理，论文撰写。 七、参考文献 [1]曾青兰.纤维素分解菌的分离筛选.安徽农业科学. 2007,35 (36):1946- 1947 [2]肖春玲,徐常新.微生物纤维素酶的应用研究.微生物学杂志,2002,22(2): 33-55. [3]魏雅琴,李红玉.纤维素高产菌选育研究进展及未来趋势.兰州大学学报,2008,44(7):107-114. [4]刘海波,王义强,陈介南等.一株高产纤维素酶菌的筛选与鉴定.生物学杂志,2005,25(3):16-20. [5]马学军,舒跃龙. 精编分子生物学实验指南.科学出版社.2005,1105-1109. [6]Larkin MA ,Blackshields G,Brown NP ,et al . Clustal Wand Clustal X ver2 sion 2.0.Bioinformatics,2007,(23):2947-2948. [7]张年风,赵允麟.纤维素酶菌株的选育及其产酶条件.粮食与饲料工业,2003, (5):23-25. [8]封晔,来航线,郑真等.高产纤维素酶菌株的筛选及其产酶条件研究.西北农林科技大学学报,2007,35(10):136-138. [9]潘建梅.产纤维素酶细菌的筛选及其产酶条件的研究.淮海工学院学报，2008,1 7(1):65-67. 指导教师意见 指导教师（签名）： 年 月 日 所在系（所）意见 负责人（签章）： 年 月 日