DNA的定量分析方法进展

2023-03-17 来源：客趣旅游网

化学与生物工程

　Chemistry&Bioengineering

2009,Vol.26No.7

DNA的定量分析方法进展

武　鑫,李生泉,刘金龙

(山西农业大学,山西太谷030801)

　　摘　要:对近年来脱氧核糖核酸(DNA)的定量分析方法的进展进行了评述,列出了重要的反应体系及分析特征。

关键词:定量分析;脱氧核糖核酸;评述

中图分类号:O657　　　　　文献标识码:A　　　　　文章编号:1672-5425(2009)07-0011-05

　　脱氧核糖核酸(DNA)存在于一切生物体中,是重要的生命基础物质,是生物体内一类含有磷酸基团的生物大分子,是遗传信息的携带者和传递者。DNA不但对生物的生长、发育和繁殖等正常的生命活动具有十分重要的作用,而且与生命的异常情况,如肿瘤发生、放射损伤、遗传疾病等也有密切关系。DNA定量测定是诠释其结构和功能的基础,检测低含量DNA在生物工程、药理学、临床诊断中具有重要的作用,因此,研究DNA定量分析方法意义重大。

DNA的定量测定方法有很多,早期有紫外吸收

2　定磷法由于核酸中都含有磷酸基,且纯的核酸含磷元素

的量为915%左右,故可通过测定磷元素的量来测定核酸含量。适用范围为10～100μg・mL-1核酸。

该方法反应灵敏,用于胎盘组织液核酸含量的测定,RSD为01439%、回收率为9919%[2]。但由于DNA和RNA都含有磷,所以在测定时必须将两者分开。

3　定糖法

核酸分子含有核糖或脱氧核糖,这两种糖具有特殊的显色反应,据此可进行核酸的定量测定。适用范围为40～400μg・mL-1,在此范围内吸收值与核酸浓度呈正比。

二苯胺法是测定核酸方法中较为古老且至今仍使用较多的一种方法。1930年被Dische首次提出用于测定DNA[3],在强酸性条件下,水解后的DNA能与二苯胺反应,生成蓝色产物,其最大吸收波长位于600nm处,由此可测得样品中DNA的含量,测定DNA的浓度范围为25～250μg・mL-1。

与紫外吸收法相比,该方法更准确、灵敏度更高,并且可以测定混合物。然而方法冗长(需16～20h),条件苛刻,且在测定过程中容易造成样品的损失。

法、定磷法、定糖法,目前应用较广泛的有探针技术法、分光光度法、荧光光度法,新兴的有电化学发光法、毛细管电泳法、高效液相色谱法和共振光散射法等。作者就近年来DNA定量测定方法的进展进行综述。

1　紫外吸收法

由于组成DNA的嘌呤碱和嘧啶碱都具有共轭双键,碱基、核苷、核苷酸、核酸在240～290nm范围内有特征吸收。由于结构上的差异,各组分紫外吸收也有区别,其中DNA在260nm附近有最大吸收,据此可用紫外吸收法对DNA进行定量、定性测定[1]。

紫外吸收法具有简便、快速等特点,样品便于回收,但是由于DNA的摩尔吸光系数仅103数量级,灵敏度不高,不适于微量或痕量DNA片段的检出和DNA序列分析的要求。因此,此法要求DNA样品有

4　分光光度法

DNA通常与染料结合后用分光光度法测定其含

相当高的纯度。

基金项目:山西农业大学科技创新基金资助项目(2008021)收稿日期:2009-03-15

作者简介:武鑫(1977-),女,山西文水人,硕士,讲师,主要从事分析化学教学与研究;通讯联系人:李生泉,教授。E2mail:sq_li126

@126.com,wuxin4668@126.com。

武　鑫等:DNA的定量分析方法进展/2009年第7期

量。分光光度法测定DNA具有简便、快速、灵敏、准确的特点,但蛋白质对体系的测定干扰严重,如有蛋白

表1

Tab11

试剂乙基紫甲基紫结晶紫喹哪啶蓝灿烂绿

质存在,需采取适当的方法预先除去。常用的测定DNA的分光光度法见表1。

常用的测定DNA的分光光度法

ThecommonabsorptionspectrophotometryfordeterminingDNA测定对象

ctDNActDNADNActDNAfsDNActDNAfsDNActDNActDNAfsDNActDNADNActDNADNADNActDNADNA

pH值614～7147149156713810～1015810～1015

814814811610910810～81591176155104192615

最大吸收波长/nm

595579589598625625609196091963660858415630546666530425444

线性范围/μg・mL-1

0～3160～5100～50108～21000110～81000115～7100015～1010015～8100～3101～100120～5100

0～70102～71000～100～100120～11800～810

文献

[4][5][6][7][8][8][9][9][10][11][12][13][14][15][16][17][18]

天青I灿烂甲酚蓝

)2TZADMABPd(Ⅱ

甲基青莲6B次甲基蓝新品红亚甲蓝中性红二溴羟基卟啉吖啶黄

表2

Tab12

试剂

)282羟基喹啉Sc(Ⅲ

常用的测定DNA的荧光光度法

ThecommonfluorescencespectrophotometryfordeterminingDNA测定对象

ctDNA

pH值6.8～8.83.0～9.1

λex/λem/nm

270/496362/531469/590

线性范围/μg・mL-1

0.00～2.500～25000～1.250～1.50.10～5.000.0078～10.0000

0.1～1.50.01～0.700.03～1.000.1～6.00.048～33.000

0～150.09～91000.1～3.00～10010～6000

文献

[19][20][21][22][23][24][25][26][27][28][29][30][31][32][33][34]

小蘖碱

)Ru(bipy)2PIP(Ⅱ

核酸

ctDNActDNADNActDNADNActDNActDNActDNADNActDNActDNActDNADNADNA

7.056.0～6.56.0～9.9

532.7/578.6487/627506/529360/565310/402545/600624/658365/504.7387/535304/334372/435310/475270/618

荧光素-中性红

AOAO2SDBS

纳米CdS硫酸喹啉中性红甲苯胺蓝碱性品红

)桑色素合镧(Ⅲ

Cu(bpy)22

中性

2～44.58.57.48.0～9.07.46.06.17.0

102苯基232磺酸基2吖啶酮

对二甲氨基偶氮苯邻羧酸

Gatifloxacin铕

武　鑫等:DNA的定量分析方法进展/2009年第7期

5　荧光光度法

有些小分子与DNA结合后,会使原本荧光很弱的核酸分子荧光强度增强很多;而有些小分子与DNA结合后,会发生显著的荧光猝灭作用。利用这些现象,可用荧光光度法检测DNA及获得热力学和动力学数据。由于荧光光度法具有灵敏度高、选择性好、仪器设备简单、操作简便等优点,目前在生物分析中受到人们的广泛关注。常用的测定DNA的荧光光度法见表2。荧光能量转移体系具有单分子水平测定生物大分子结构信息的能力,已在酶活性荧光分析、分子微区分析领域得到广泛应用。能量转移在分析化学中的重要应用是能量转移荧光分析。DNA的存在能够影响荧光能量给予体与荧光能量接受体之间的能量转移,表现为能量转移体系荧光强度的改变,据此可以建立DNA的定量分析方法。高峰等[35]研究了吖啶橙-罗丹明B二聚体能量转移体系作为荧光探针用于DNA的测定。

现,木犀草素的氧化峰电流Ipa与DNA质量浓度在2～12mg・L-1范围内基本呈线性关系,线性回归方程为Ipa(10-5A)=8168-01322cDNA(mg・L-1),相关系数R为01989;建立了定量检测DNA的方法。电化学分析法对静电方式结合的分子可获得其它方法得不到的信息,而且可靠、经济,但使用仪器比较复杂,操作繁琐。

7　电化学发光分析法

电化学发光分析法是20世纪90年代问世的将电化学法和化学发光法巧妙结合的新型核酸定量法。

朱霞萍等[40]利用在硝酸介质中DNA被高锰酸钾氧化而发光,结合流动注射进样测定了DNA的浓度,检出限为62μg・mL-1,该法可应用于人体血清中DNA的测定。用于测定DNA的化学发光体系还有:

92羧基吖啶2H2O22KOH、Ce2Ru(phen)2金32H2SO4、属卟啉等。

8　高效液相色谱法

高效液相色谱法(HPLC)是一项采用高压输液泵和高灵敏度检测器的高效迅速的分离分析新技术,是具有高分离效能的柱液相色谱法。它广泛用于核酸、氨基酸等物质的分析;还用于分析以二苯胺作标记并通过酶链反应扩大了的双螺旋DNA的片段,此外还用于DNA的诊断。液相色谱—质谱联用可用于DNA加成化合物的分析,HPLC法还可用于核酸组分

6　电化学分析法

由于探针分子与核酸相互作用后,分子的特征氧

化还原电流会明显降低,峰电位也有移动,因此,可用

电化学方法测定核酸的含量。Palecek[36]基于核苷酸在汞电极上的反应建立了测定DNA的吸附伏安法。王振永等[37]运用电化学方法研究了灿烂甲酚蓝(BCB)与DNA的相互作用,并提出了以其为电化学探针测定DNA的方法。该方法的线性范围为8100×10-7～6100×10-5mol・L-1,应用于微量核酸试样的分析,结果令人满意。

王瑞侠等[38]研究了联苯胺(BZ)与DNA的电化学行为。当DNA存在时,联苯胺的一对氧化还原峰的峰电流定量减少。峰电流的减小主要是由于DNA与BZ生成了化合物。在最佳条件下,峰电流的减小与DNA的浓度在710×10-5～610×10-3g・L-1范围内呈线性关系,检出限为310×10-5g・L-1。该方法具有较好的回收率和选择性,并已应用于样品中DNA的测定。

屈凌波等[39]研究了木犀草素在0104mol・L-1

B2R缓冲溶液(pH=4100)中于+01478V(vs1SCE)和+01450V(vs1SCE)处有一对氧化还原峰。当向该溶液中加入DNA分子后,通过比较电化学参数转移系数α和表观电子传递速率常数ks的变化,可知木犀草素嵌入DNA碱基对之间形成了非电活性的超分子化合物,从而使得峰电位正移,峰电流下降。研究发

及其衍生物的测定及人体癌细胞中DNA和RNA的同时测定。反相高效液相色谱法可以用来测定大鼠肝组织中DNA的碱基含量。

9　毛细管电泳法

毛细管电泳(CE)是近年来迅速发展起来的经典电泳技术与现代柱分离技术相结合的一种分析技术。CE法可用于DNA的分离和测定;应用尺寸筛选毛细管电泳与错配酶相结合可进行DNA错配位点的检测和识别;CE法还可用于快速灵敏地检测超螺旋DNA,用于其片段的分析;还可用来研究阳离子表面活性剂与DNA形成的配合物。

10　共振光散射法

共振光散射(RLS)技术是一项在普通荧光分光光度计上进行光散射检测的分析技术。自从1993年Pasternack等首次应用共振光散射法对卟啉类化合物在核酸上的聚集进行研究以来,共振光散射技术逐渐

武　鑫等:DNA的定量分析方法进展/2009年第7期

见光谱的特性及其分析应用[J].光谱实验室,2004,21(1):1602

162.

[9]　李韧韬,龙云飞,张永婷,等.天青I分光光度法测定DNA[J].光

得到广泛应用[41],如用于对纳克级核酸进行定量分析。其最大特点是试剂安全廉价、快速、灵敏度高和特异性强[42]。但还存在技术方面的问题,如染料与核酸结合不稳定。常用的测定DNA的共振光散射法见表3。

表3

Tab13

谱实验室,2004,21(2):2992302.

[10]　杨孝荣,刘志昌,刘凡,等.灿烂甲酚蓝标记分光光度法测定核酸

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)2TZADMAB络合物与鱼精子DNA作用的[11]　谭英,胡光富.Pd(Ⅱ

常用的测定DNA的RLS方法

Thecommonrayleighlightscatteringmethods

fordeterminingDNA

试剂

FLBG

分光光度法研究[J].高等函授学报(自然科学版),2004,17(2):

13216.

[12]　林旭聪,谢增鸿,郭良洽,等.核酸-甲基青莲6B分子作用体系

测定对象

ctDNActDNActDNActDNActDNActDNActDNAfsDNADNA

pH值6～87.3～7.69.2～10.59.5～10102.212.0～2.89.325.332.20

最大RRS峰nm400470512482291308467340320343358339

　线性范围　μg・mL-1

0.04～3.100～1.20～0.9

的研究与应用[J].光谱学与光谱分析,2004,24(2):1692172.

文献

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[15]　司文会.分光光度法测定脱氧核糖核酸———基于其与亚甲蓝的

结晶紫孔雀石绿铝离子小蘖碱固黄O桃红B

)铁(Ⅲ

0.0216～0.0640[46]

0～5.00～0.6

[47][48]

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[54]

吖啶橙ctDNA

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11　其它方法

由于其它分子与DNA碱基对之间产生堆积效应,DNA稳定性增加、熔点升高、粘度增大,因此还有许多其它物理化学方法,诸如:平衡渗析、粘度测定、电镜等被用于DNA靶向分子与DNA相互作用机理研究。

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ProgressofMothodsforQuantitativeDeterminationofDNA

WUXin,LISheng2quan,LIUJin2long

(ShanxiAgriculturalUniversity,Taigu030801,China)

Abstract:AreviewontherecentprogressofmethodsforquantitativedeterminationofDNAispresented.Theimportantreactionsystemsandtheiranalyticalcharacteristicsarelisted.

Keywords:quantitativedetermination;deoxyribonucleicacid(DNA);review

(上接第10页)

ResearchProgressonBiotransformationofActiveConstituents

fromTraditionalChineseMedicine

LIUYang2yang,SHIJie,LIUPing2huai

(CollegeofMaterialsandChemicalEngineering,HainanUniversity,Haikou570228,China)

Abstract:Atpresent,researchersinthechemicalindustryareexploringtheuseofrenewablefeedstocktoimprovecontinually,andthispromptstheexplorationofbioprocessesfortheproductionofchemicalstoagreatextent1Inthechemicalindustry,producingactiveconstituentsbybiotransformationisanimportantapproachfortheindustrializationoftraditionalChinesemedicine1Thisreviewdealswithrecentprogressonthebiotransfor2mationofactiveconstituentsfromtraditionalChinesemedicine,anddiscussestheexistentcorrelativeproblemsandthepossibleapproaches.

Keywords:biotransformation;traditionalChinesemedicine;secondarymetabolites;plantcellculture

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