《医学微生物学与医学免疫学》实验指导
前 言
医学微生物学与免疫学是医学院校必设的基础课程之一，该学科具有理论与实践紧密结合的特点及实验教学在学科中的重要性。本课程设置要求学生不仅要掌握基础理论、基本知识，而且要学习和掌握各项基本技能。本书结合中药学专业的教学工作实际，编实验项目，每个实验说明实验目的，实验原理，实验内容方法，实验要求及注意事项，并附有一定量的思考题。本书依教学进程安排实验次序，可帮助学生巩固基础理论知识，培养学生基本技能，提高教学效果。
实验学时：4学时
形态二 《医学微生物学》实验指导
实验一 细菌分布检测、理化及药物因素对细菌影响的检测
（一）细菌分布的检测 【实验目的与要求】 1.掌握无菌操作技术。
2.熟悉细菌菌落的观察及计数方法。
3.了解微生物在自然界及正常人体的分布，增强无菌观念。 【实验原理】
细菌广泛分布于自然界中，人的体表和与外界相通的腔道中也有细菌存在。通过本次实验理解微生物学科实验中强调无菌操作、防止污染和感染的重要性，为今后在医疗实践中建立牢固的无菌观念打下基础。 【实验仪器、器材与试剂】
1.实验仪器和器材：无菌平皿、普通琼脂平板、血平板、高层琼脂培养基、微波炉、无菌吸管、胶帽、酒精灯、打火机、无菌试管、试管架等。 2.实验试剂：自来水或纯净水、生理盐水等。 【实验项目、方法与步骤】 1.空气中细菌分布的检测——沉降法 （1）取一个普通琼脂平板并作好标记。
（2）置于实验室某处，揭开盖。操作时不要用手接触培养基，以免造成结果误差。 （3）让培养基暴露在空气中30min，然后盖好皿盖，置37℃生化培养箱内培养18～24h。 （4）取出观察并纪录结果。
2.水中细菌分布的检测——倾注培养法 （1）取已灭菌的吸管，套上胶帽。
（2）右手持吸管带胶帽的一端，其余部分迅速通过火焰，以杀灭吸管表面可能存在的细菌。 （3）以挤压胶帽的办法，吸取1ml自来水或纯净水，置于无菌平皿中（注意：不要错放入平皿盖内）。
（4）取已融化并冷却至50℃左右（手握感觉热而不烫手）的高层琼脂培养基，迅速倾15～20ml入已盛有1ml待测水的平皿中，立即加上平皿盖，在实验台上轻轻水平摇动，使琼脂与水样充分混合，静置于台面，等待琼脂凝固。
（5）待琼脂凝固后，将平板倒放（即底朝上，盖朝下），作好标记，并置37℃生化培养箱内培养18～24h。
（6）取出观察结果，计算每ml水的菌落总数，对结果给予评价。 3.咽部细菌分布的检测 （1）取一个血平板，作标记。
（2）在酒精灯火焰旁用无菌棉签沾少许生理盐水后轻轻涂擦被检者的咽部表面，然后涂布接种在血平板表面。
（3）接种完毕，置37℃生化培养箱内培养18～24h。 （4）观察并记录结果。 4.人体表面细菌分布的检测 （1）取普通平板一个。
（2）用无菌操作法取生理盐水，用此含水棉签涂擦皮肤，面积约5×5mm。
（3）左手将琼脂平板打开，在平板的一个区域内，将棉签轻轻的、密密的在琼脂表面上涂布。接种时，平板必须在酒精灯火焰附近进行。已用过的棉签置于废物杯内。接种完毕，作好标记。 （4）置琼脂平板于37℃生化培养箱内培养，18～24h后取出观看结果，并做记录实验结果。 附:棉签沾取生理盐水的方法是点燃酒精灯，右手拇指和食指取无菌棉签一支，左手持无菌生理盐水试管底部，将试管口置酒精灯火焰附近。右手小指和手掌夹住试管的塞子，将其拔出，并始终夹在小指和手掌间，不得将它放置台面上。试管口应通过火焰，使管口灭菌，然后移至火焰旁。将棉签伸入管内蘸取生理盐水，取出棉签后再将试管口通过火焰，然后将塞子塞上试管口，并将试管放回原处。 【注意事项】
1.检测空气中的细菌时，要尽可能地避免人为或外界因素对实验干扰。
2
2.做水中细菌分布的检测过程中，将水加入平皿底中，切勿将其加入皿盖内，加水并盖上皿盖后，切勿将其倒置过来，要等加入培养基且培养基凝固后放可倒置过来。 【实验报告】
1.分别记录空气中、水中、咽部和人体表细菌分布的情况。 2.记录空气中、水中、咽部和人体表细菌菌落总数。 【练习与思考题】
1.水中细菌总数的卫生学意义是什么？
2.假如在本实验结果中，都检测到有细菌存在，在日常生活中，你会注意什么？
3.空气中并不具备细菌生长繁殖所需要的基本条件，假如你能检测到空气中有细菌，请说出原因。
（二）理化及药物因素对细菌影响的检测
【实验目的与要求】
1.掌握紫外线杀菌的原理及其作用特点。 2熟悉常用消毒剂的种类及作用特点。 3.熟悉药敏实验（纸片法）的原理和方法。 【实验原理】 1.紫外线杀菌的原理
紫外线杀菌作用显着的部分在波长300nm以下，其中波长254－257nm的紫外线杀菌作用最强。低压水银石英灯（紫外线灭菌灯）辐射成分中80％为波长254nm的紫外线，故有很强的杀菌作用；其管壁又能将波长短于200nm的紫外线吸收，故产生臭氧。
紫外线的杀菌作用原理与其核酸、蛋白质及酶的作用有关，短波紫外线能破坏细胞或病毒的核酸结构和功能。核酸的吸收光谱与紫外线的杀菌作用光谱几乎完全吻合，核酸中嘌呤和嘧啶对波长260nm的紫外线吸收最强；波长254nm的紫外线主要被核蛋白吸收。核酸吸收短波紫外线后，紫外线的量子破坏核酸分子中的一个或数个化学健，造成核酸或核蛋白的分解或变性，使之失去正常功能，造成细菌和病毒的死亡或变异。此外，紫外线照射尚能影响细菌和病毒中许多酶的活性，使其蛋白分子的结构和功能产生改变，影响蛋白质及核酸的代谢合成，亦可使细菌或病毒的毒性减弱，甚至死亡。 2.消毒剂消毒原理
有些化学药品能杀灭病原微生物，称为化学消毒剂，可分为醇类、酚类、氧化剂、表面活性剂等类型。不同的细菌对不同的化学消毒剂具有不同的敏感性。 3.抗菌药物杀菌原理
抗生素是某些微生物在代谢过程中产生的一种化学物质，能抑制或杀死某些微生物和癌细胞。主要来源于放线菌、某些真菌和细菌除微生物外，一些动植物也能产生抗生素。各种细菌对抗生素的敏感性不同，即使同一种细菌的不同菌株对抗生素的敏感性也有差别。 【实验仪器、器材与试剂】
1.紫外线对细菌的影响：超净工作台、紫外灯管、酒精灯、普通琼脂平板、接种环、金黄色葡萄球菌或大肠杆菌培养物。
2.化学消毒剂对细菌的影响：仪器与器材：棉签、酒精灯、普通琼脂平板等；实验试剂：新洁尔灭、乙醇、洗手液、碘酊、生理盐水等。
3.抗菌药物对细菌的影响：镊子、尺子、普通琼脂平板、黄连、青霉素、链霉素、金黄色葡萄球菌敏感菌株、金黄色葡萄球菌耐药菌株等。 【实验项目、方法与步骤】 1.紫外线对细菌的影响
（1）取琼脂平板2个，大肠杆菌斜面培养物及葡萄球菌斜面培养物各1支。
（2）将大肠杆菌密集划线接种在整个平板表面上，使细菌均匀密集地分布于整个平板。用同法将葡萄球菌接种于另一平板。
（3）在超净工作台内打开皿盖，使已接种细菌的平板暴露一半，在紫外线灯下照射30min。 （4）照射30min后盖好平板，置37℃生化培养箱内培养18～24h，取出观察并记录结果。 2.化学消毒剂对细菌的影响
本实验采用的几种化学消毒剂对细菌的影响实验操作方法基本相同，现以乙醇消毒剂对细菌的影响为例，说明其操作过程： （1）取一根普通琼脂平板，作好标记。
（2）在酒精灯旁边，将棉签沾湿乙醇消毒剂，在操作者手背轻轻来回拭擦，拭擦范围大小约为1x1cm，弃去该棉签。
（3）取另一根棉签，沾湿少许生理盐水，待被拭擦乙醇部位晾干后，在其上轻轻拭擦，打开普通琼脂平板，在培养基表面指定位置划线。
（4）实验对照：将棉签沾湿少许水并拭擦手背的另一处后划线在普通琼脂平板的另一位置上。 （5）然后将平板置37℃生化培养箱中培养18～24h，取出并观察实验结果。 3.抗菌药物对细菌的影响
（1）取琼脂平板一个，在平板底部适当位置做好标记，然后将金黄色葡萄球菌敏感株或耐药株密集划线接种于整个平板表面。
（2）以灭菌镊子分别取含药纸片（直径5～6mm）贴在已接种细菌的琼脂平板表面，纸片间的距离要大致相等，参照图1-1。
（3）然后将平板置37℃生化培养箱培养18～24h。取出观察纸片周围有无抑菌环，并测量和记录此环的直径。然后参考表1-1判定结果。
图1-1 细菌药物的敏感实验
表1-1 细菌对药物的敏感程度
抗生素种类与浓度 抑菌环直径（mm） ≤28 青霉素（10单位/片） － ≥29 ＜11 链霉素（10微克/片） 12～14 ≥15 0 黄连 ＞0 【注意事项】
1.所有的实验都必须严格遵守无菌操作。
2.紫外灯杀菌力虽强，但穿透力弱，故只能用于实验室、病房或手术室的空气及物体表面的消毒。另外，杀菌波长的紫外线对人体皮肤、眼睛等有损伤作用，应注意防护。
3.紫外线对细菌的影响实验中，实验结束后盖上皿盖时，切勿将手跨过暴露的那一边，要从盖住的那一边往暴露的一边盖上盖子。
敏感 试验菌的敏感度 耐药 中介 敏感 耐药 中介 敏感 耐药
4.在做药敏实验时，要严格按照图1-1定好各药片之间的距离，药片间距太近或太远都可能会对抑菌环的测量造成影响。 【实验报告】
1.记录紫外线的杀菌效果。 2.记录化学消毒剂的消毒效果。
3.记录抗菌药物周围有无抑菌环并判断细菌对不同药物的敏感程度。 【练习与思考题】
1. 紫外线的杀菌原理是什么？主要应用在哪些方面？ 2. 如何判断抗菌药物的敏感程度？
实验考核方式
1．实验报告成绩评分。 2．平时实验操作考查评分。
实验项目汇总及课时分配
每组项目 计划实验类型 序号 实验项目名称 学时 验证性 综合性 设计性 1 细菌的分布，理化因素的影响 4 合计数
教研室主任(签字)：运晨霞
2015年9月15日
4 必做 选做 人数 类别 0 √ 1 0 20 √ 1 0
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