菠菜色素的提取与分离

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摘要：利用石油醚，甲醇为萃取剂萃取叶片中的叶绿素，在薄层层析中时分别

在两种不同的展开剂中展开比较展开剂的极性，在柱层析中选用适当的洗脱剂进行层析，当第一个有色成分即将滴出时，取一锥形瓶收集的橙黄色溶液即胡萝卜素.

关键词：菠菜色素、 萃取、 薄层色谱分析法、 柱色谱

正文： 1. 前言

菠菜叶中含有叶绿素、胡萝卜素、和叶黄素等多种天然色素. 叶绿素是植物进行光合作用所必需的催化剂, 也是食用的绿色色素, 可用于糕点、饮料水等中, 添加于胶姆糖中还可消除口臭. 胡萝卜素的三种异构体中B-异构体具有维生素A 的生理活性, 可代替维生素A 使用, 也可作为食品工业中的色素使用, 最新研究报道, B-胡萝卜素还有防癌功能. 叶黄素是胡萝卜素的羟基衍生物, 在光合作用中能起收集光能的作用. 由此可见, 叶绿素等天然色素有广泛的用途, 对于色素的提取与分离就显得很重要了。

叶绿体色素提取与分离实验比较复杂, 但又非常重要。实验用层析法来进行, 根据叶绿体色素各成分在层析液中分配系数的不同, 将不同的叶绿素逐一分开, 但在实验中, 常因实验材料中色素含量低提取制备较难, 层析分离后色带清晰度差, 甚至色带种类不全等诸多因素, 最后影响了实验结果。其中叶绿体色素的提取制备、过滤与点样、分离与层析是取得良好的实验结果的关键问题,绿色植物如菠菜叶中含有叶绿素（绿）、胡萝卜素（橙）和叶黄素（黄）等多种天然色素。 2. 实验部分 2.1实验目的

通过绿色植物菠菜色素的提取和分离，了解天然物质分离提纯方法；

通过柱色谱和薄层色谱分离操作，加深了解微量有机物色谱分离的原理。 2.2实验原理

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色谱法是分离色谱法是分离色谱法是分离色谱法是分离、提纯和鉴定有机化合物的重要方法。

其分离原理是利用混合物中各个其分离原理是利用混合物中各个成分的物理化学性质的差别，当选择某一个条件使各个成分流过支持剂或吸附剂时，各成分可由于其物理性质的不同而得到分离。与经典的分离提纯手段不同，色谱法具有微量、快速、简便和高效等优点。按其操作不同，色谱可分为薄层色谱、柱色谱、纸色谱、气相色谱和高压液相色谱等。 1. 柱色谱原理

液体样品从柱顶加入，流经吸附柱时，即被吸附在柱中固定相（吸附剂）的上端，然后从柱顶加入流动相（洗脱剂）淋洗，由于固定相对各组分吸附能力不同，以不同速度沿柱下移，吸附能力弱的组分随洗脱剂首先流出，吸附能力强的组分后流出，分段接收，以此达到分离、提纯的目的。 2. 薄层色谱原理

由于混合物中的各个组分对吸附剂（固定相）的吸附能力不同，当展开剂（流动相）流经吸附剂时，发生无数次吸附和解吸过程，吸附力弱的组分随流动相迅速向前移动，吸附力强的组分滞留在后，由于各组分具有不同的移动速率，最终得以在固定相薄层上分离。其应用主要有：跟踪反应进程；鉴定少量有机混合物的组成；分离；寻找柱色谱的最佳分离条件等。

绿色植物如菠菜叶中含有叶绿素（绿）、胡萝卜素（橙）和叶黄素（黄）等多种天然色素。 叶绿素存在两种结构相似的形式即叶绿素a(C55H72O5N4Mg)和叶绿素b(C55H70O6N4Mg)，其差别仅是a中一个甲基被b中的甲酰基所取代。它们都是吡咯衍生物与金属镁的络合物，是植物进行光合作用所必需的催化剂。植物中叶绿素a的含量通常是b的3倍。尽管叶绿素分子中含有一些极性基团，但大的烃基结构使它易溶于醚、石油醚等一些非极性的溶剂。

胡萝卜素（C40H56）是具有长链结构的共轭多烯。它有三种异构体，即a-,β-和γ-胡萝卜素，其中β-异构体含量最多，也最重要。在生物体内，β-体受酶催化氧化即形成维生素A。目前β-胡萝卜素已可进行工业生产，可作为维生素A使用，也可作为食品工业中的色素。

叶黄素（C40H56O2）是胡萝卜素的羟基衍生物，它在绿叶中的含量通常是胡萝卜素的两倍。与胡萝卜素相比，叶黄素较易溶于醇而在石油醚中溶解度较小。

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CH2CHH3CRCH2CH3NMgNNNH3CCH3OCO2CH3CH3CH3CH3叶绿素a（R = CH3） 叶绿素b（R = CHO）

CH2CH2O

CH3CH3O

H3CCH3CH3CH3CH3H3CRRCH3CH3H3CCH3

β-胡萝卜素（R = H） 叶黄素（R = OH）

提取制备中加入适量CaCO3( 碳酸钙)

在植物叶片的液泡中含有机酸, 研磨提取叶绿体色素时, 加入适量的CaCO3 粉末, 可以防止叶绿体色素被破坏, 从而保持叶片的生理活性。我们从对比实验中发现, CaCO3 对提取液影响较大, 不加Ca-CO3 的提取液放置一段时间以后容易变黄, 而加Ca-CO3 的提取液则无明显变化, 这说明不加CaCO3 的提取液容易受到外界破坏。在加CaCO3 时, 用量应掌握在每克绿叶用0. 2~ 0. 4 克CaCO3 粉末为宜。 2.3试剂与仪器

试剂：95％乙醇, 丙酮,硅胶G，中性氧化铝，甲醇，石油醚（60-90℃），丙

酮，乙酸乙酯。

仪器：电子天平、研钵、布氏漏斗 、圆底烧瓶、 电炉、 滴管、显微载玻片、

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广口瓶、滤纸、少量脱脂棉、层析柱 材料：新鲜菠菜叶片 2.4 实验装置

抽滤装置

2.5实验方法与步骤 实验流程图：

实验方法：Ⅰ薄层层析法 Ⅱ柱层析 实验步骤：

<1> 菠菜色素的提取（提取液可为石油醚-甲醇、丙酮、CCl4、无水乙醇）

取20g 新鲜菠菜叶于研钵中拌匀研磨5 分钟，残渣用20mL 的石油醚-乙醇（2:1）混合液进行提取，共提取两次。把浸取液合并过滤，滤液转移到分液漏斗中，加入等体积的水洗涤后弃去下层的水-乙醇层、石油醚层再用等体积的水洗涤两次，以除去乙醇和其它水溶性物质。石油醚层用无水Na2SO4进行干燥、浓缩为2 mL。取一半做柱层析分离，其余留作薄层层析分析。

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Ⅰ柱色谱分离（常用的吸附剂：氧化铝，硅胶，氧化镁，碳酸钙，活性炭等） （1） 色谱柱的装填

将10g中性氧化铝与10mml石油醚将拌成糊状，冰凝将其慢慢加入预先加了一定石油醚的色谱柱中，同时打开活塞，让石油醚流入锥形瓶中（以稳定速度装柱，不时敲打色谱柱，是色谱柱装的均匀）。在装好的柱子上放0.5cm厚的石英砂或一张滤纸，并不时用石油醚洗脱，以使色谱柱流实。然后放掉过剩的石油醚，直至液面刚刚达到石英砂或滤纸的顶部，关闭活塞。 （2）洗脱

将得到的色素滤液用滴管小心夹到色谱柱顶，加完后，打开活塞，让液面下降到柱面以上1mm左右，关闭活塞，加数滴石油醚，打开活塞，使液面下降，经几次反复，使色素全部进入柱体。待色素全部进入柱体后，在柱顶小心加约1.5cm高度洗脱剂石油醚-丙酮溶液9:1（体积比）。打开活塞，让洗脱剂逐滴放出，层析即开始进行，用锥形瓶收集。 （3） 分离

当第一个有色成分即将滴出时，取另一锥形瓶收集，得橙黄色溶液，它就是胡萝卜素。 用石油醚-丙酮7:3（体积比）作洗脱剂，分出第二个黄色带，它是叶黄素。再用丁醇-乙醇-水3:1:1（体积比）洗脱叶绿素a（蓝绿色）和叶绿素b（黄绿色）。

（溶剂的洗脱能力按递增次序排列如下：己烷（石油醚）、四氯化碳、甲苯、苯、二氯甲烷、氯仿、乙醚、乙酸乙酯、丙酮、丙醇、乙醇、甲醇、水。）

表1 不同洗脱剂对叶黄素的洗脱效果比较

洗脱剂 分层情况 用量 速度 Ⅱ薄层色谱的操作方法 （1）点样

将样品用低沸点的溶剂配成1-5％的溶液，用内径小于1 mm的毛细管点样。点样前，先用铅笔在薄层板上距一端1 cm处轻轻划一横线作为起始线，然后用毛细管吸取样品，在起始线上小心点样，斑点直径不超过2 mm；如果需要重复

石油醚—丙酮( 7∶3) 黄—绿 较慢 石油醚—丙酮( 6∶4) 无明显分层 100 - 80 mL — 石油醚—乙酸乙酯( 7∶3) 黄—青绿—墨绿 较快 第 5 页 共 7 页

点样，则待前次点样的溶剂挥发后，方可重复点样，以防止样点过大，造成拖尾、扩散等现象，影响分离效果。若在同一板上点两个样，样点之间距离在1-1.5 cm为宜。待样点干燥后，方可进行展开。 （2）展开和展开剂

薄层展开要在密闭的器皿中进行，加入展开剂高度为0.5 cm。把带有样点的板（样点一端向下）放在展开器中，并与器皿成一定的角度。盖上盖子，当展开剂上升到离板的顶部约1 cm处时取出，并立即标出展开剂的前沿位置，待展开剂干燥后，观察斑点的位置。 （3） 显色

若化合物不带色，可用碘薰或喷显色剂后观察，若化合物有荧光，可在紫外灯下观察斑点的位置。

表2 菠菜色素的比移值（Rf） 展开剂 石油醚—丙酮 石油醚—丙酮 石油醚—丙酮 石油醚—乙酸乙酯 石油醚—乙酸乙酯 石油醚—丙酮—苯 苯—丙酮

体积比 8∶2 9：1 7：3 6:4 7:3 2:1:2 8:2 胡萝卜素 0.82 0.84 0.88 0.96 0.90 0.90 0.89 叶绿素 0.27 — a=0.44 b=0.36 0.78 a=0.42 b=0.33 0.64 0.50 叶黄素 0.44 0.23 0.55 0.85 0.61 0.76 0.71

2.6操作要点及注意事项

（1） 薄层层析时，薄层板的制备要厚薄均匀，表面平整光洁。

（2） 点样与展开应按要求进行，点样不能戳破薄层板面。展开时，不要让展

开剂前沿上升至底线。否则，无法确定展开剂上升高度。即无法求得RF值和准确判断粗产物中各组分在薄层板上的相对位置。

2.7物理常量

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名称 叶黄素 物态 棱格状黄色晶体，有金属光泽 熔点 190 °C 溶解性 不溶于水，易溶于油脂和脂肪溶剂 不溶于水，易溶于有机溶剂 叶绿素 绿色或褐色，主要存在于叶绿体中 紫红或暗红色的结晶性粉末 — Β-胡萝卜素 176～180℃ 不溶于水，易溶于醚，脂类 3.实验记录

操作 实验现象 参考文献：

[1] 作者：李好样、冯轶雪 题目：菠菜色素的提取与分离 杂志：太原师范学院学报（自然科学版）2004年9月 第三卷第3版 （64～66页）

[2] 作者；欧阳菲 题目：关于5叶绿体色素提取与分离的难点分析及其改进方法 杂志：伊利教育学院学报 2001年6月 第14卷第2期 （39～95页） [3] 罗一鸣、唐瑞仁《有机化学实验指导》（中南大学出版社）195～197页 [4] 王兴涌、尹文萱、高宏峰《有机化学实验》（科学出版社）183～185页 [5] 王福来《有机化学实验》（武汉大学出版社）111～113页

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