山东畜牧兽医 ２０１４年第３５卷 ！。 …‘。…。。‘ 。‘ … 文献综述 ；．．．．．．．．．．．．．．．．．．．． 犬瘟热诊断方法研究进展及应用概况 郭伟军 （山西隆克尔生物制药有限责任公司 山西太谷０３０８００） 莫伟强 （山西省长治市畜牧局） 中图分类号：￥８５８．２９２ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００％１７３３（２０１４）０２．００７６．０５ 犬瘟热也称犬瘟，是由副黏病毒￣ｆＰａｒｍｅｙｘｏｖｉｒｉｄａ ｅ）、麻疹病毒属（Ｍｏｒｂｉｌｌｉｖｉｒｕｓ）的犬瘟热病毒（ｃａｎｉｎｅ ｄｉｓｔｅｍｐｅｒ ｖｉｒｕｓ，ｃＤｖ）引起的危害犬科、鼬科、浣熊科及 猫科动物的一种急性、热性、败血性、高度接触病毒性 传染病ｉ”。ＣＤ的死亡率可高达８０％，素有“毁灭性传染病” 之称１２ｌ。ＣＤＶ本病最早发现于ｌ８世纪后叶，１９０５年由 Ｃａｒｔ’ｅ氏首次报道为病毒性疾病，１９２６年由Ｄｕｎｋｉｎ氏及 Ｌａｉｄｌａｗ氏两位确定本病病原是病毒所致。我国从１９７２年 起陆续在貂、犬和狐等动物中发现该病。目前该病呈世 界分布，我国也广为流行，是当前养犬业、毛皮动物养 殖业以及野生动物保护事业危害最大的传染病之一。目 前ＣＤＶ血清型只有一种，但根据分支上Ｈ基因氨基酸序列 同源性高于９５％的毒株可归为同一基因型的原则，到目前 为止ＣＤＶ主要可区分为亚洲Ｉ型（Ａｓｉａ－Ｉ）、亚洲Ⅱ型（Ａｓｉａ－ ＩＩ）、欧洲型（Ｅｕｒｏｐｅ）、美国型（ＵＳＡ或Ａｍｅｒｉｏａ）、北极型 （Ａｒｏｔｉｏ）和疫苗型ＣＣａｏｏｉｎｅ或ＯｌｄＣＤＶｓ）６个基因型［３１ 前５个 基因型均由ＣＤＶ野毒株组成，并且均与起源于上世纪 ５０，－６０年代的弱毒疫苗株在遗传关系上存在较远距离。近 年来，随着生态环境改变和病毒的进化，ＣＤＶ自然感染 的宿主范围正在不断扩大【４Ｉ，已经出现了人感染ＣＤＶ的报 道【，】。Ｉ瞄床上ＣＤＶ感染动物后多继发细菌、病毒感染，症 状多变，难以早期诊断，动物一但发病多预后不良，因 此预防及早期诊断是防治本病的最佳手段。因此，早期 快速而准确的检测ＣＤｖ致病毒株对有效控制ｃＤｖ的流行 具有重要意义。 １病原学诊断方法 １．１病毒的分离鉴定 ＣＤＶ病毒的分离培养鉴定被认为是确诊该病的最根 本的方法，但由于分离过程繁琐，时间长，材料成本较 高，ＤＶ对外界环境的抵抗力很弱，易被光和热灭活，并 且在发病后期由子中和抗体的出现，致使病毒分离成功 率较低［６１。但传统的病毒分离鉴定技术的结果准确、可 靠，一般作为新方法建立的验证方法。常用分离和培养 ７６ ＣＤＶ病毒的有原代培养细胞和传代细胞系。实验室ＣＤＶ 分离成功后，可通过动物回归试验对该病毒的毒力进行 判定，最敏感的实验动物是雪貂，接种后其死亡率可达 １００％１７】。 １．２电镜的病毒检测 电镜技术可以直观、准确的鉴别病毒，根据病毒的 形态、结构和大小等不同特征，可以做出诊断。房红莹 等【明将离子捕获电镜技术与免疫电镜技术结合起来，建立 了改良离子捕获电镜法，效果比单纯离子捕获电镜法 好，提高了完整ＣＤＶ粒子的检测率。电镜观察表明犬瘟 热病毒粒子呈现多形性，多数为球形，病毒粒子的直径 为ｌ１０￣５５０ｎｍ之间。核衣壳呈螺旋状，总长度为 ｌＯ００ｎｍ，螺旋直径ｌ５￣１９ｎｍ，螺旋中，ｌ￣，Ｓｎｍ的孔，螺距 ５￣６ｒｉｍ，核衣壳由囊膜包裹，其内部为Ｍ，厚约５ｒｉｍ，表 面为Ｈ和Ｆ两个糖蛋白组成的纤突，纤突长度为９ｎｍ［ｇｌ。该 方法直观、快速，但该方法比较复杂，一般不作为常规 手段，仅限于以研究为目的的应用。 １．３包涵体检查 在ＣＤＶ感染的细胞中出现一种特征性的形态学变化 包涵体（ｎｉｃｌｕｓｉｏｎ ｂｏｄｙ）。这是ＣＤＶ感染的重要标志之一， 可通过诊断病理学进行检查，这是诊断ＣＤ的重要辅助方 法。采样部位包括皮肤、眼结膜、呼吸道、肺、胃肠 道、膀胱刮取物、阴道黏膜或外周血液等。在光学显微 镜下感染细胞中常可发现呈红色或暗红色、具有清晰的 边界和匀质的边缘的多形性包涵体，一般呈圆形或椭圆 形，也有见到呈镰刀形而紧贴于胞核上者，存在于核内 的包涵体属ＣｏｗｄｒｙＡ型【ｌｏ】。发现包涵体对诊断ＣＤ有一定 的意义，但由于与狂犬绢病毒、犬传染性肝炎病毒等所 形成的包涵体及细胞本身某些反应产物难以区分，因此 作出诊断需与其他方法结合【¨１。 ２血清学诊断 ２．１传统血清学试验 ２．１．１琼脂扩散试验（ＡＧＰ） 自从１９６６年Ｗｏｅｍｌｅ将ＡＧＰ ２０１４年第２期（总第２０５ 标准化以来，该方法已经用于ＣＤＶ的检测。任文陟等Ｉ ２１ （１９９４）利用犬瘟热鸡胚成纤维细胞弱毒疫苗免疫动物制备 文献综述 法对疫苗免疫后血清中抗体的情况进行调查。在敏感性 方面，ＥＬＩＳＡ的敏感性比较高。 ２，２．１ 间接ＥＬＩＳＡ该方法主要用于抗体ＩｇＭ和ＩｇＧ的检 了琼脂扩散抗体，并对患犬瘟热病貉肝脏中的抗原进行 检测，与电镜结果相比较，阳性符合率达８５．７％，阴性符 测。付少才 巧 等以犬瘟热病毒（ＣＤＶ）抗原包被酶标板，用 辣根过氧化物酶标记羊抗犬ＩｇＧ，建立了检测犬血清中 ＣＤＶ／ＩｇＧ抗体的间接酶联免疫吸附试验的方法，对４６只小 犬进行了抗体水平测试、犬抗ＣＤＶ血清效价的测定，结 合率为７５％，总体符合率为９０％。虽然琼脂免疫扩散试验 只能粗略的对抗体进行测定，灵敏性较差，但不需要特 殊的仪器。操作简单，适宜于在基层临床中推广使用。 ２．１．２病毒中和试验（ＶＮＴ）通常用抑制病毒检查待检血 果都较满意，此方法与免疫荧光检测方法比较，其灵敏 度高，方便简捷。Ｂｌｉｘｅｎｋｒｏｎｅ．Ｍｏｉｌｅｒ！ 】等建立了检测抗 清中的特异性抗体和抗体效价的测定，该试验敏感、特 异、稳定，并一直被国内外学者作为ＣＤＶ抗体标准检测 方法，用来评价ＣＤ疫苗的免疫效果和检测犬的抗体水 平。乔贵林等ｆ”ｌ采用固定病毒——稀释血清法以ＣＤ弱毒 和自制的高免犬血清建立了检测ＣＤＶ抗体的中和试验。 本方法特异性强、敏感性较高，稳定性较好，是目前诊 断ＣＤ和临床上监测犬免疫力的标准方法，但是诊断所需 时间较长，工作量大，不利于ＣＤＶ的快速诊断。 ２．１．３ ＳＰＡ直接平板协同凝集试验该方法的基本原理是 由于ＳＰＡ能与ｌｇＧ的Ｆｃ片段非特异性结合，同时不影响Ｆａｂ 片段的活性，所以当带有ＳＰＡ的金黄色葡萄球菌与抗体混 合，再加入适量的相应抗原，结果会使出现的凝集反应 更容易观察。遇秀玲等（１９９８）应用酶标ｓＰＡ（葡萄球菌Ａ蛋 白）染色法对接种ＣＤＶ ｌｆ￣，Ｖｅｒｏ细胞进行染色后发现，有相 应ＣＤＶ抗原部位，同样滴：ＪｌｌＣＤＶ阳性血清的对照细胞 片，未见相应反应。ＣＤＶ ＭＤ．７７株感染后３、６、９、 １２ｈ，胞浆可见细小 性颗粒（呈淡黄色至棕褐色着染）； ｌｄ后阳性反应明显增强，多见于胞浆，胞浆亦可见大空 泡：２ｄ后坏死细胞呈强阳性反应，细胞问拉网；３￣４ｄ后 合胞体细胞呈强阳性反应，坏死细胞呈棕褐色至黑褐 色；５ｄ后阳性反应主要见于新生细胞胞浆；６ｄ后合胞体 细胞呈大圆形，阳性反应主要见于胞浆；７ｄ后整个合胞 体细胞呈一棕褐色大团块；８ｄ后大部分细胞脱落，残留 细胞呈强阳性反应【¨１。该法敏感性高、特异性强、重复 性好等优点，与琼脂扩散试验及对流免疫电泳试验比 较，三者之间无明显差异，且操作方法简单、快速、节 省材料，是一种ＣＤＶ的早期病原诊断及流行病学调查的 新技术。 ２．２酶联免疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ） ＥＬＩＳＡ检测法已竟被广泛应用与吃ＣＤＶ的检测， ＥＬＩＳＡ在ＣＤＶ的早期感染、持续感染中均得到应用，并可 以同时用于特异性抗原和抗体的检测。在诊断方面，定 期采ｍ监测正常犬中的ＣＤＶ抗体的ＥＬＩＳＡ效价，根据 ＥＬＩＳＡ抗体升高的程度判断是否存在感染ＣＤＶ。母源抗体 的存在对疫苗的免疫效果产生影响，常应用ＥＬＩＳＡ检测方 犬瘟热病毒ＩｇＭ的ＥＬＩＳＡ，用于犬和水貂的血清抗体检 测，并将检测结果与检测抗犬瘟热病毒ＩｇＧ￣ＥＬＩＳＡ和病 毒中和试验的检测结果进行比较，结果表明该方法可用 于犬和水貂ＣＤＶ早期感染的检测。ＭｅｓｓｌｉｎｇＩ”ｌ等利用杆状 病毒重组表达的ＣＤＶ野生分离株（２５４４／Ｈａｒｔ９５）的Ｎ蛋白做 为包被抗原，建立捕获夹心ＥＬＩｓＡ，并将其用于检测犬血 清中的ＩｇＭ和ＩｇＧ，结果表明在特异性ＩｇＧ的定性测定上， 该方法可以替代病毒中和试验，并且通过对特异性ＩｇＭ的 测定可以弥补病毒中和试验和ＲＴ－ＰＣＲ在诊断急性犬瘟热 方面的不足。 ２．２．２ ＤＯＴ－ＥＬＩＳＡ 该方法是一种以硝酸纤维素膜等固 相化基质膜为载体的ＥＬＩＳＡ，用于检测抗体或抗原，具有 简便、经济、结果判定直观等优点，但是也存在结果判 断主观性强的不足。金鑫等（２ｏ０ｏ）用建立的三抗体夹心法 Ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ检测犬瘟热病毒（ＣＤＶ）抗原，其抗原最低检出 量为１．１５ｕｇ／ｍｌ（０．５７６２５ｎｇ／点），经与常规ＥＬＩＳＡ对１０４份自 然感染犬的血液白细胞样本，６Ｏ份眼结膜分泌物样本， ７３份脾、肝、淋巴结等脏器样本进行检测，检测的阳性 率分别为９２．３１％、６６．６７％、８３．５６％和９０．７２％、６３．２９％、 ８１．８６％；两种方法检出的总阳性率分别为８３．５４％（１９８／２３７） 和８０．１７￣１９０／２３７），总阳性符合率为９５．９６％，表明两者 呈高度正相关（Ｆ０．９２，Ｐ＜０．Ｏ１）。经电子显微镜观察验证 比较，三抗体夹心法Ｄｏｔ．ＥＬＩＳＡ检测的可信度为 ９４．７４ｏ／ｏｆ‘ 。 ２．２－３单克隆抗体（ＭＡｂ） 夹心ＥＬＩｓＡ该方法利用ＭＡｂ包被ＥＬＩＳＡ板，具有极 高的特异性。张鸿ｆ。９】等建立的单克隆抗体夹 ｂＥＬＩＳＡ法， 对纯化的ＣＤＶ最小检出浓度为０．Ｏｌｌ￣ｇ／ｍｌ，敏感性接近于 Ｎ－ＰＣＲ法，两种方法的符合率为８５％。 ２．３胶体金试纸诊断技术 胶体金免疫层析法是将免疫胶体金技术与层析技术 有机结合起来建立的一种快速免疫学检测技术。该技术 最早用作电镜的示踪标记物，并逐步应用于禽病检测。 Ａｎｆ２Ｄ】等利用获得的２株单克隆抗体建立Ｊ＇ＣＤＶ胶体金试纸 山东畜牧兽医 条诊断技术，并用巢式ＰＣＲ进行比较，虽然敏感性（８９．７％ 和８５．７ｏ／ｏ）和特异性（９４．６％和ｌＯＯ％）略低，但其使用方便， 造价低廉，所以更容易在临床上推广。 ． ２０１４年第３５卷 酶切位点相同的产物，且不扩增犬细小病毒、犬腺病毒 和狂犬病病毒犬的三种病原的核酸，在国内首次建立了 ＣＤＶＲＴ－ＰＣＲ诊断方法。初步研究结果表明此方法具有高 度敏感、特异、准确等优点，可用于犬瘟热病毒的临床 诊断和实验研究。Ｆｒｉｓｋ！ 】等运用建立的检测ｃＤＶ核蛋白 的ＲＴ－ＰＣＲ对病犬的血清、全血、脑脊液样品进行检测，、 其检出率分别为８６＊／ｏ（２５／２９）、８８￣／ｏ（１４／１６）、８８％（１４／１６）。 ３病毒ＲＮＡ诊断技术 ３．１ 核酸杂交技术 核酸杂交技术是一种分子水平的检测技术，是利用 碱基互补原理检测目的核有酸片段具有敏感性、特异性 强等特点，其最重要的一环就是特异性探针标记，目前 常用的标记物有同位索、生物素及地高辛等。在利用核 上述结果表明，ＲＴ－ＰＣＲ的敏感性受引物序列的较大影 响，但在犬瘟热的诊断中仍不失为一种高特异性和敏感 酸杂交技术对犬瘟热进行诊断的应用上，国内报道较 少，国外在这方面的研究报道较多。Ｏｇｌｅｓｂｅｅ等１ ‘１利用针 对犬瘟热病毒Ｎ蛋白设计的放射性同位素３２Ｐ标记的双链 ＤＮＡ探针对溶细胞性病毒株（ＯｎｄｏＣＤＶ）感染的Ｖｅｔｏ细胞 和持续性感染细胞株（ＣＣＬ６４－ＲＣＤ￣）感染的水貂肺传代细 胞进行原位杂交实验，在两种细胞中均检测到犬瘟热病 毒核酸，结果表明核酸探针有较高的敏感性和特异性， 同时根据结果显示可以通过减少核酸探针的长度来提高 其灵敏性。Ｇａｅｄｋｅ等ｌ Ｉ针对ＣＤＶ的Ｎ蛋白的ＲＮＡ分别制 作了用地高辛标记的１种单链ＲＮＡ，２种双链ＤＮＡ和一种 只有１Ｏ个核苷酸的寡聚核苷酸链的探针，对感染了ＣＤＶ 的Ｖｅｒｏ细胞和犬的组织进行原位杂交试验，结果表明在 三种核酸探针中，单链ＲＮＡ探针是目前检测组织中ＣＤＶ ＲＮＡ最敏感的探针。核酸杂交技术含量要求较高，操作 繁琐，受多种反应条件的影响，难于临床推广。王宏俊 等 ｌ根据犬瘟热病毒（ＣＤＶ）基因序列的结构特点，在其编 码核衣壳蛋白的高度保守基因区内，设计合成一对特异 性引物。以ＲＴ．ＰＣＲ技术从ＣＤＶ基因中扩增｝ｎ了一段长度 为４３０ｂｐ的核有酸ｅＤＮＡ，并制各出地高辛标记的ＣＤＶ核 酸探针。特异性检测结果表明，该探针能与ＣＤＶ标准株 和地方分离株核酸发生特异性杂交，而与对照的ＮＤＶ、 ＭＶ等病毒的核酸杂交反应均为阴性。敏感性检测结果表 明，该探针对ＣＤＶ的检出量可达到０１ｌｐｇ。用所制备的核 酸探针对某宠物诊所疑似犬瘟热病例进行临床诊断初步 应用试验，表明该标记探针完全可用于ＣＤＶ的临床检测。 ３．２ ＲＴ－ＰＣＲ ＰＣＲ技术用于ＣＤＶ诊断使诊断技术提高到了基因水 平，该方法具有简便快捷、敏感性强和特异性高的特 点。Ｓｈｉｎ等运用ＲＴ－ＰＣＲ已能检测出患狗外周血单核细胞 中的犬瘟热病毒的核衣壳蛋白基因（Ｎ）及运用ｐＲＶＳＶ载体 成功表达了ｃＤｖ的Ｎ基因 Ｉ。李金中等Ｉ ｑ（１９９９）根据 Ｂａ￣ｅＲ报道的犬瘟热病毒弱毒株ｏＩＩｄｅｒｓｔｅｐ００ｎ的融合蛋白 （Ｆ）基因序列，设计合成了一对能扩增３２４ｂｐ基因片段的引 物，并以此引物进行ＰＣＲ扩增，得到了与设计片段大小和 ７８ 性的诊断方法，并且不受发病类型、体液免疫反应和病 毒分布的限制。在ＲＴ．ＰＣＲ的基础上，国外又有人将巢式 ＰＣＲ应用于犬瘟热的诊断上，并且表现出了更高的敏感 性。：Ｓｈｉｎ等【 ｓ１运用建立的ＲＴ－ＰＣＲ和巢式ＰＣＲ对凝似病犬 的血液、尿液、唾液和鼻腔分泌物样品进行检测，其检 出率分别为ｓｏ％（１１／２２）、５ｏｏ／，（１Ｏ／２Ｏ）、２ｏ％（ｓ／２ｓ）、２２％ （６，２７）和８２％（１８／２２）、７５０／￣１５／２Ｏ）、５６％（１４／２５）、７０％ （１９／２７），结果表明巢式ＰＣＲ的敏感性要高于普通的一步法 ＲＴ－ＰＣＲ，这与Ｊｏｚｗｉｋ 捌报道的结果一致。 ３．３实时荧光ＰＣＲ 近几年来，有不少报道运用荧光定量ＰｃＲ用于传染病 的诊断，表现出了良好的特异性和敏感性，显示出了较 好的应用前景。实时荧光ＰＣＲ与普通ＰＣＲ相比，其特异性 和灵敏度都要更高。Ｇａｂｄｅｌｌａ Ｅｌｉａｄ１ 。１等应用实时定量 ＰＣＲ检测ＣＤＶ获得了较高的敏感性和特异性，最小检测 量为１００个ＲＮＡ，未加病毒的样品和阴性血清样品反应均 为阴性，而且狗的各种组织和器官均可用来检测。黄国 君等【３ 】建立了ＳＹ ＢＲ Ｇ ｒｅｅｎＩ Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＲＴ－ＰＣＲ，该法比 常规ＲＴ－ＰＣＲ高１０３倍，用建立的Ｒｅａ１．ｔｉｍｅ ＲＴ－ＰＣＲ检测１ １ 例临床病例，ＣＤＶ阳性率为１００％。对犬瘟热弱毒活疫苗 中的ＣＤＶ进行定量，其含量在１．２４￣１０５￣４．８８￣１０５拷贝／头 份之间。苏建青等ｌ’ 】根据犬瘟热病毒Ｎ蛋白基因的保守序 列分别设计一对引物及其相应的Ｔａｑｍａｎ探针建立的了荧 光定量ＰＣＲ，反应的灵敏度为１０ＴＣＩＤ５０。ＦＱ－ＰＣＲ具有快 速、灵敏和稳定的特点，适用于临床样品的检验。 ３．４基因芯片技术 基因芯片技术是近年来分子生物学与微电子学等多 学科交叉融合而成的一项高新技术。ＤＮＡ芯片投术检测 疾病具有高通量、并行性和结果判读客观、准确和信息 化的特点。张伟【’ １等应用基因： 片、ＥＬＩＳＡ诊断试剂、病 毒分离和ＰＣＲ方法，对２５８份疑似病料进行了检测效果的 对比研究。研究结果表明，应用基因芯片方法对ＣＤＶ检 测率比ＥＬＩＳＡ法分别高ｆｌ｜２３．４％。基因芯片法同病毒分离 法、免疫法的符合率低，差异极显著＆＜ＯｌＯ１），与ＰＣＲ法 ２０１４年第２期（总第２０５ 文献综述 符合率在９０％以上，灵敏度平均要高出４．８％。 ７６７ ３．５环介导逆转录等温扩增技术（ＲＴ．ＬＡＭＰ） 【ｌＯ】遇秀玲，郑振峰，田克恭等．犬瘟热脏器组织中的抗原定位及病 ＲＴ．ＬＡＭＰ技术室建立在基础ＰＣＲ基础上的一种新型 理形态学观察【Ｊ】．中国兽医杂志，１９９４，６：７－９． 的核酸检测的方法，具有简便、快速高效、敏感性强等 【ｌｌ１ Ｄｕｏａｔｃｌｌｅ Ｃｏｕｓｓｅｍａｎｔ Ｗ，Ｈｏｏｒｅｎ ｅｔ ａ１．Ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｉｏｎｓ ｏｆｃａｎｉｎｅ 优点。Ｃｈｏ！ 】等采用ＲＴ－ＬＡＭＰ技术检测ＣＤＶ基因组， ｄｉｓｔｍｅｐｅｒ ｖｉｒａｌ ａｎｔｉｇｅｎ ｉｎ ｐａｒａｆｆｉｎ ｓｃｏｔｉｎｏｓ ｕｓｉｎｇ ａｌｌ ｕｎａｂｌｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ－ 以ＲＴ．ＰＣＲ相对比，敏感性达１００％，特异性为９３．３％，但 ｅｎｚｙｍｅｍｅｔｈｏｄ叨．Ａｍ ＪＶｅｔ．Ｒｅｓ，１９８０，４１（１１）：１８６０－１８６２． 其检测时间更短，仅用ｌｈ，还可以进行位点检测。胡嘉 【１２】任文陟，陈秀芬，母连志．犬瘟热琼脂扩散试验方法的建立及初 欣等【 Ｉ建立了ＣＤＶ ＲＴ．ＬＡＭＰ检测方法，可以检测到 步应用【Ｊ】．中国兽医学报，ｌ４（４）：３９８－４０１ ＲＮＡ的浓度为５．６￣１０－６ｎｇ／ＵＬ，试验过程比ＲＴ－ＰＣＲ缩短了 ｆ１３］乔贵林，夏威柱，王度林等．瘟热病毒抗体检测方法的比较研究 １．５ｈ，灵敏度高１０３倍，具有极高的灵敏性。该方法具备 【Ｊ】．中国兽医学报，１９９７。ｌ７（１）：２６－２９１ 耗时短、灵敏度高、简单易行等特点，在实验室快速诊 【Ｉ４】遇秀玲，田志恭．吴娜等．犬瘟热病毒ＭＤ－７７株在Ｖｅｔｏ细胞上增 断中是一种检测ＣＤＶ的有效方法。 殖规律的观察．中国兽医杂志，１９９８，２４（５）：１１－１２． ４小结 【ｌ５】付少才．检测犬瘟热病毒（ＣＤＶ）ｌｇＧ抗体酶联免疫吸附实验方法 目前ＣＤＶ病原学诊断、血清学诊断、分子生物学检 的建立哪养犬，２００３，４（１）：５－６． 测的方法在广度和深度上已经有了很大的发展，但是各 【１６】Ｂｌｉｘｅｎｋｒｎｏｅ－Ｍｏｉｌｅｒ Ｍ￣Ｐｅｄｅｒｓｅｎ Ｉ ｇ，Ａｐｐｃｌ Ｍ Ｊ，ｃｔ ａ１．Ｄｅｔｅｃｔｉｎｏ ｏｆ 种方法各有优缺点，每一种方法都很难做到，快速、简 ＩｇＭ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｇａｉｎｓｔ ｃａｎｉｎｅ ｄｉｓｔｅｍｐｅｒ ｖｉｓｍ ｉｎ ｄｏｇ ａｎｄ ｍｉｎｋ ｓ０ｆａ 便、灵敏、特异、经济和实用。因此对ＣＤＶ感染的诊断 ｅｍｐｌｏｙｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ（ＥＬＩＳＡ）【Ｊ１．Ｊ Ｖｅｔ Ｄｉａｇｎ 必须建立在临床初步诊断的基础上，结合实验室诊断手 ａｌｖｃｓｔ．１９９１，３（１）：３－９． 段，快速确定病原，然后根据判定结果，制定相对应的 【１７】Ｍｅａｓｌｎｉｇ Ｖ ｖｏｎ，Ｈａｒｄｅ Ｔ Ｃ；Ｍｏｅｎｎｉｇ Ｖ ｅｔ ａ１．Ｒａｐｉｄ ｎａｄ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ 免疫程序，达到快速防治ＣＤＶ感染的目的。 ｄｃｔｅｃｔｉｎｅ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｍ（ＩｇＭ）ａｎｄ ｌｇＧ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｇａｉｎｓｔ ｃ￣ｉｎｅ 参考文献 ｄｉｓｔｅｍｐｅｒ ｖｉｒｕｓ ｂｙ ａ Ｂｆｗ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｎｕｃｌｅｏｏａｐｓｉｄ －ｂａｓｅｄ 【１１殷震，刘景华．动物病毒学Ｄ ．第２版．北京：科学出版社，１９９７． ｅｎｚｙｍｅ ｌｎｉｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｓｂｅｎｔ ａｓｓａｙ川．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏ１．１９９９，３７（４）： ７５６・７６２． １０４９－１０５６． 【２】周庆国，张更利．犬瘟热与常见相似疾病临诊特征的比较ｆｆ］ｌ商 Ｉｌ８】金鑫，鲁承，吕相哲等，Ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ检测犬瘟热病毒抗原的研究． 牧与兽医，２０００，３２（３）：３２－３３． 中国兽医科技，２０００，３０（６）：２１－２３． ［３１ Ｌａｎ Ｎ Ｔ，Ｙａｍａｇｕｏｈｉ Ｋａｗａｂａ￣Ａ，ｅｔ ａ１．Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ 【ｌ９】张鸿，胡传莉， 生中．扬州大学学报（农业与生命科学版）第３２ ａｎｄ ｇｒｏｗｔｈ ｐｆｏｐ￣￣￥ｆｏｒ ｔｗｏ ｄｉｆｅｒｅｎｔ ｃａｎｉｎｅ ｄｉｓｔｅｍｐｅｒ ｖｉｒｕｓ ｃｌｕｓｔｒｅｓ， 卷第４期；１５－１８． Ａｓｉａ Ｉ ａｎｄ ２ ｉｎ Ｊａｐａｎ［Ｊ］．Ｊ Ｖｅｔ Ｍｅｄ Ｓｏｉ。２００７，６９（７）：７３９－７４４． ［２０】ＡｎＤ Ｊ，ＫｉｍＴＹ，ＳｏｎｇＤ Ｓ，ｅｔ ａ１．Ａｎｉｍｍｕｎｏｏｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ａｓｓａｙ 【４】Ａｐｐｅ ＩＭＪ，Ｙａｔｃｓ ＲＡ，Ｆｏｌｅｙ ＧＬ，ａｔ ａ１．Ｃａｎｉｎｅ ｄｉｓｔｍｏｐｅｒ ｅｐｉｚｏｏｔｉｃ ｉｎ ｆｏｒ ｒａｐｉｄ ａｎｔｅｍｏｒｔｅｍ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ ｄｏｇｓ ｓｕｓｐｅｃｔｅｄ ｔｏ ｈａｖｅ ｃａｎｉｎｅ ｌｉｏｎｓ，ｔｉｇｅｒｓ，ａｎｄ ｌｅｏｐａｒｄｓ ｉｎ Ｎｏｒｔｈ Ａｍｅｒｉｃａ［Ｊ］．Ｊ Ｖｅｔ Ｄｉａｇｎ Ｉｎｖｅｓｔ，１９９４． ｄｉｓｔｅｍｐｅｒ［Ｊ］．Ｊ Ｖｉｒｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，２００８，１４７（２）：２４４－２４９． ６：２７７－２８８． ｆ２１】Ｏｇｌｅｓｂｃ￣Ｍ Ｊａｃｋ＇ｗｏｏｄ Ｄ，Ｐｅｎｉａｅ Ｋ ｅｔ ａ１．Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｄｅｔｅｃｔｉｎｏ ｏｆ 【５】Ｈｏｙｌａｎｄ ＪＡ，Ｏｉｘｏｔｔ ＪＡ，Ｂｅｒｒｙ几，ｅｔ ａ１．Ａ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｉｎ ｃａｎｉｎｅ ｄｉｓｔｅｍｐｅｒ ｖｉｒｕｓ ｎｕｏｌｅｉｏａｏｉｄ ｗｉｔｈ ａ ｖｉｒｕｓ・ｓｐｅｃｉｉｆｃ ｃＤＮＡ ｐｒｏｂｅ ｂｙ ｓｉｔｕｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｎｏ，ＴｅＶＣＦＳｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｆｉｎｏ（ＲＴ－ ｄｏｔ－ｂｌｏｔ ａｎｄ ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ．１９８６，１４（３－４）： ＰＣＩ ａｎｄｉｎ ｓｉｔｕ－ＲＴ－ＰＣＲｆｏｒｄｃｔｅｏｔｉｎｏｏｆｃａｎｉｎｅｄｉｓｔｅｍｐｅｒｖｉｒｕｓＲＮＡｉｎ ｌ９５－２Ｉ１． Ｐａｇｅｔ’ｓ ｄｉｓｃａｓｃｐ１．Ｊ Ｖｉｒｏｌ Ｍｃｔｈｏｄｓ，２００３．１０９（２）：２５３・２５９． ［２２】Ｇａｃｄｋｃ Ｋ，Ｚｕｒｂｆｉｇｇ￣ｌ Ａ，Ｂａｕｍｇａｒｔｎｅｒ Ｗ．ＩＩＩ ｖｉｖｏ∞ｄ ｉｎｖｉｔｒｏ 【６】李金中，夏成柱，胡桂学等．我国犬瘟热病毒的生态学调查研究 ｅｄｔｃｏｔｉｎｏ ｏｆ ｃａｎｉｎｅ ｄｉｓｔｃｍｐｅｒ ｖｉｒｕｓ ｎｕｏｌｃｏｐｒｏｔｃｉｎ ｇｅｎｅ ｗｉｈｔ ．畜牧兽医学报，１９９９，４：８８－８９，９１－９２． ｄｉｇｏｘｉｇｏｎｉｎ・ｌａｂｅｆｌｅｄ ＲＮＡ，ｄｏｕｂｌｅ・ｓｔｒａｎｄｅｄ ＤＮＡ ｐｒｏｂｅｓ ａｎｄ 【７】ＨａｉｇＤＡ．Ｆｒｅｌｕｎｉｎａｒｙｎｏｔｅｏｎｔｈｃ ｃｕｌｉｆｖａｆｏｎ ｏｆＧｒｅｅｎ’ｓ ｄｉｓｔｍｅｐｅｒｏｉｄ ｏｉｉｇｏｎｕｏｌｅｏｔｉｅｄｓ ｂｙ ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｎｏ ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｃｔｒｅｉｎａｒｙ ｖｉｒｕｓ ｉｎ ｆｅｒｔｉｌｅ ｈｅｎ ｅｇｇｓ［Ｊ１．ｏｎｄｅｎｔｅｐｏｏｒｔ Ｊ ｖｅｔ ｓｃｉ Ａｎｉｍ ｌａｄ，１９４８． Ｍｅｄｉｏｉｎｃ．－Ｓ￣ｆｉｃｓ－Ｂ．１９９７，４４（６）：３２９・３４０． ２２３（１－２）：１４９－５５ 【２３】王宏俊，丁少忠，核酸探针检测犬瘟热病毒方法的建立和初步应 【８】房红莹，陆承平，马勋等．犬瘟热的微生物学诊断研究【Ｊ】．中国兽 用 １中国兽药杂志，２００６，４ｏ（５）：１９－２２． 医学报。１９９７，２：１４８－１５１． ［２４】Ｓｈｉｎ Ｙ，ｅｔ ａｉ．，Ｖｅｔ．Ｍｅｄ．Ｓｏ１．１９９５，５７（３）：４３９－４４５．【２５】Ｓｈｉｎ Ｙ＇ｃｔ ａ１．， 【９股震，刘景华．动物病毒学，北京：科学出版社第二版，１９９７．９】７３６． Ｖｅｔ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．１９９７，５９（１）：５１・５３． 山东畜牧兽医 ２０１４年第３５卷 氨基酸螯合铁的优越性及在养猪生产中的应用 董冬华杨维仁 （山东农业大学动物科技学院山东泰安２７１０００） 中图分类号：￥８１６．４１ 文献标识码：Ａ 文蠢编号：１００７．１７３３（２０１４）０２．００８０．０３ 铁是动物机体所必需的一种微量元素，主要表现 在，铁是血红蛋白和肌红蛋白所必需的组成成分，并与 细胞色素酶、过氧化氢酶、过氧化物酶、乙酰辅酶、琥 ２氨基酸螯合铁的优越性 ２．１氨基酸螯合铁比无机铁有更高的吸收率Ｈｏｐｐｉｎｇ等 （１９６５）￣７］研究认为铁是以氨基酸螫合铁的形式吸收的。研 究表明，位于具有五员环或六员环鳌合物中的金属离 珀酸脱氢酶等酶的活性密切相关。铁参与机体组织内氧 的正常运输，直接影响机体的能量和蛋白质代谢，三羧 酸循环中一半以上的酶和因子含铁或铁存在时才能发挥 其作用，而且还会影响动物体的免疫机能…。 到目前为止，铁添加剂的发展已经历了三个阶段， 相应的出现了三代产品：无机铁；简单的有机铁；氨基 子，可以直接通过小肠绒毛刷状缘。可见，氨基酸鳌合 铁是铁吸收的原始模式之一。螯合状态下的微量元素是 利用配位体的转运系统，而不是金属的转运系统吸收 的，避免了金属离子在肠道吸收时的竞争拈抗，从而提 高了吸收效率。无机铁被动物吸收及蓄积的量很低，吸 酸整合铁。而多数研究表ⅡＪＪ，氨基酸螯合铁的吸收利用 率远远高于前两代【２一Ｉ。关于氨基酸螯合铁的研究推动了 无机铁向氨基酸整合铁在动物生产中的应用。 收率仅为１０％，大部分随粪便排出体外，影响环境，破坏 地力，引起农作物中铁的富集，危害人畜健康。在常规 日粮基础上，以氨基酸整合物形态存在的微量元素吸收 率是无机态微量元素的１．８￣４．０倍【Ｂ１。 ｌ氨基酸螯合物 １９９６年美国饲料管理官员协会（ＭＦＣＯ）确定微量元素 氨基酸鳌合物的概念：由某种可溶性金属盐中的一个金 属元索离子同氨基酸按一定的摩尔比以共价键结合而 成，水解氨基酸的平均分子量为１５０左右，生成的鳌合物 的分子量不超过超过８００［ １。但也有认为金属氨基酸螯合 ２．２氨基酸螯合铁比无机铁生物学效价更高 许多研究 结果证明，氨基酸螫合铁比无机铁有更高的生物利用 率，且对动物的生长、生殖、健康及饲料转化率等有明 显的促进作用。Ｋｅｇｌｅｙ（２００２）研究表明，以血红蛋白含量 为标识。给３日龄仔猪补给蛋氨酸铁．２１日龄时，相对于 硫酸亚铁，蛋氨酸铁的相对生物学效价为ｌ ８０ｏ／ｏＩ Ｉ。Ｓｐｅａｒｓ 物的真正定义为由元素周期表中的第一过渡区元素（Ｃｒ、 Ｍｎ、Ｆｅ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｃｕ、Ｚｎ）与氨基酸共价结合形成的一 种稳定的、电中性的环状结构的螯合物【６１。 （１９９２）Ｉ１￣１研究了蛋氨酸铁对哺乳仔猪的相对生物学效价为 １８３％。在妊娠母猪日粮中添加氨基酸螯合铁，铁通过胎 基金项目：ＬＵ东省现代农业产业技术体系生猪创新团队建设项目（ＳＴＤＡＶ－０１１－０６－０５） ｉ ｉ ０ ● ｉ ’ ● ０ ‘ ● ０ ０ ● ● ０ －：０＇’ ● － ０ ｉ ● ’ ０ ● ●＝０ ‘ ● ０ ● ● ０ －＝● ０ － ● ｉ ● － ● ’ ● － ’ －＝ｉ ’ ● ● ｉ ‘ ● ０ ０ － ０ 【２６】李金巾，何洪彬，夏咸杜等．犬瘟热病毒反转录．聚合酶链反应诊 断方法的建立和初步应用【Ｊ Ｊｌ病毒学｝ｌｆ，１９９９，１５（２）：１８０－１８４． 【２７】ＦｒｉｓｋＡＬ，ＫｏｎｉｇＭ，ＭｏｒｉｔｚＡｅｔａ１．Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃａｎｉｎｅ ｄｉｓｔｅｍｐｅｒ ｖｉｒｔｕ；ｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ ＲＮＡ ｂｙ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ－ＰＣＲ ｕｓｉｎｇ ｓｅｎｌｍ， ２００６，１３６【４）：１７１－１７６． 【３１１黄国君，岳华，汤承等．ＳＹＢＲ Ｇ ｒｃｅｎＩ荧光定量ＲＴ－ＰＣＲ检测犬瘟 热埔毒方法的建立及应用【Ｊ】ｌ中国预防兽医学报，２００８，３Ｏ（６）：４５０－ ４５４． ｗｈｏｌｅ ｂｌｏｏｄ，ａｎｄ ｃｅｒｅｂｒｓｐｉｏｎａｌ ｌｆｕｉｄ ｆｒｏｍ ｄｏｇｓ ｗｉｔｈ ｄｌｓｔｅｍｐｅｒ［Ｊ］．Ｊ Ｃｌｎ ｉＭｉｏｒｏｂｉｏ１．１９９９，３７（１ １）：３６３４－４３． 【３２］苏建青，郑学星，候小强；，ＴａｑＭａｎ探针实时荧光定￣ｔＰＣＲ诊断 犬瘟热病毒方法的建立 ．中国农学通报第２３卷第ｌ１期：３３￣３７． 【２８】ＳｈｉｎＹ Ｊ｜ＣｈｏＫ０，ＣｈｏＨＳ，ｅｔａ１．Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆｏｎｅ－ｓｔｅｐＲＴ－ＰＣＲ ａｎｄ ａ ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃａｎｉｎｅ ｄｉｓｔｅｍｐｅｒ ｖｉｅｓｒ ｉｎ ｃｌｎｉｉｃａｌ 【＝Ｉ３】张伟，吴时友，尹燕博等．犬常见传染病诊断基因芯片的研究与 应用【Ｊ】．中国兽医学报，２００７年第２７卷第４期：４８１＂－－４８９． 【３４】Ｃｈｏ Ｈ Ｓ，Ｐｅｒｋ Ｎ Ｙ．Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃａｎｉｎｅ ｄｉｓｔｅｍｐｅｒ ｖｈ＇ｕｓ ｉｎ ｂｌｏｏｄ ｓａｍｐｌｓ ｂｙ ｆｅＣＶＣＩ＇Ｓｅ ｔｒａｎｓｏｒｉｐｔｉｏｎ ｌｏｏｐ－ｍｅｄｉａｔｄ ｉｅｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｉｃａｔｆｉｏｎ ｓａｍｐｌｅｓ［］．ＡｕｓｔＪ Ｖｅｔ Ｊ＇２００４，８２（１／２）：８３－８６． 【２９１ ＪｏｚｗｉｋＡ，Ｆｒｙｍｕｓ Ｔ．Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆｔｈｅ ｈｎｍｔｍｏｆｌｕｏｒｓｏｃｎｅｅ ａｓｓａｙ ｅｗｉｌｌＩ ＲＴ－ＰＣＲ ａｎｄ ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ ｎｉ ｔｈｅ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ ｃａｎｉｎｅ ｄｉｓｔｅｍｐｅｒ［］．ＶｅＪｔ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ，２００５，２９（４）：／＊％５９． 【Ｊ】．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆＶｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｓｅｒｉｓ ｅＢ，２００５，５２（９）：４１０・４１３． 【３５】胡嘉欣，温水俊，霍志云．犬瘟热病毒ＲＴ－ＬＡＭＰ检测方法的建立 及初步应用中国畜牧兽医．２０１２年第３９卷第８期：４５．．４８． ［３０１Ｅｌｉａ Ｇ’Ｄｅｃａｒｏ Ｎ＇Ｍａｒｔｅｌｌａ Ｖ，ｅｔ ａ１．Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃａｎｉｎｅ ｄｉｓｔｅｍｐｅｒ ｖｉｒｕｓ ｉｎ ｄｏｇｓ ｂｙ ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＲＴ－ＰＣＲ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ， （收稿日期：２０１３一ｌｌ－２１） ８０