实验设计方案
一、前言：
葡萄酒是用新鲜的葡萄或葡萄汁经发酵酿成的酒精饮料。通常分红葡萄酒和白葡萄酒两种。前者是红葡萄带皮浸渍发酵而成；后者是葡萄汁发酵而成的。我们所要酿造的是红葡萄酒。
葡萄酒有增进食欲，滋补作用的作用。葡萄酒中含有糖、氨基酸、维生素、矿物质。这些都是人体必不可少的营养素。它可以不经过预先消化，直接被人体吸收。非凡是对体弱者，经常饮用适量葡萄酒，对恢复-健康有利。同时还有助于消化，葡萄酒能刺激胃酸分泌胃液，每60-100克葡萄酒能使胃液分泌增加120毫升。
自酿的葡萄酒，不用添加发酵剂，也不添加任何防腐剂和澄清剂。家酿的葡萄酒利用葡萄皮上的野生酵母菌分解葡萄中的糖份转化为酒精，另加点糖提高酒精度。一般保质期不超过两年，所以成酒后应在两年内喝光。
二、实验目的：
1、熟悉酿造葡萄酒的过程和原理。 2、学会葡萄酒中酵母菌的分离纯化。 3、熟悉酵母菌形态观察和菌落计数法
4、对比来说明，酵母菌对葡萄酒发酵的影响，杀菌剂(SO2)对发酵过程的影响。
三、材料和仪器：
（一）材料：葡萄3斤（因葡萄还未上市，可用提子代替，苏果超市有，但比较贵）。 白糖半斤
（二）仪器：1、主发酵器：玻璃罐（坛、瓶）、陶瓷坛、能耐受酒精又对人无害的塑料瓶罐等均可。
2、二次发酵容器及装酒的容器：可以用空酒瓶、饮料瓶、矿泉水瓶等都可 3、一根细塑料管。用来在发酵完成后利用虹吸法将葡萄酒从发酵容器中倒出。
4、木棒或筷子。用来在发酵过程中搅拌葡萄皮和葡萄汁。 5、丝袜或细纱布。用来过滤葡萄酒汁。
四、实验步骤：
（一）葡萄酒的酿造
1、清洗：将主发酵器（即玻璃坛等）充分洗干净，控干。
2、浸泡：将葡萄摘除蒂，把剪好的葡萄冲洗干净后用淡盐水浸泡十分钟左右，这是为了去掉葡萄皮上的农药和其他有害物质，再次冲洗，晾干至表面没有水珠。
3、装瓶：将葡萄捏破，葡萄肉连同葡萄皮挤到主发酵器中。当把葡萄装到发酵器容量的70%左右时，停止装葡萄，盖上盖子，但不要完全拧紧。
4、发酵：将装好葡萄的发酵器放在28℃恒温培养箱内。葡萄装入发酵器后，大约会在12个小时以内启动发酵，表现为葡萄汁中有较多气泡产生。在发酵启动后，每天两次用木棒或筷子将葡萄皮压入酒液中，然后盖上盖子。
5、加糖：发酵启动后一到两天内，放入250g白糖，作用是提高酒精度。发酵启动后三到四天时，再次放入白糖250g，将糖浸入葡萄汁中搅拌均匀。
6、二次发酵：当酒精发酵完成后，首先利用虹吸法，将葡萄酒汁倒入二次发酵器，然后将剩下的葡萄皮、籽、糟等用丝袜或细纱布过滤，过滤后的酒液也混入二次发酵器中。葡萄皮、籽、糟扔掉。注意二次发酵器留有1/10空隙，盖子也不要拧的很紧。放在阴凉处。二次发酵主要是苹果酸-乳酸发酵，不再产生酒精。
7、加入澄清剂，加入少量酒精。二次发酵完成，即得到葡萄酒原酒。 8、口味：自酿出的葡萄酒是酸的,还有一些的刺激性味。 附：葡萄酒的质量检测
葡萄酒的质量指标是现行国家标准GB/T15037-94中规定的检验指标； 色泽：紫红、深红、宝石红、红微带棕色
澄清程度：澄清透明、有光泽、无明显悬浮物（使用软木塞封口的酒允许有3个以下不大于1mm的软木渣）。葡萄酒应是澄清的，若酵母菌生长，则会出现浑浊，所以要检测出我们自酿的葡萄酒中酵母菌的含量是否合格。
香气：具有纯正、优雅、怡悦、和谐的果香 甜味：具有纯净、幽雅、爽怡的口味和新鲜 （二）酵母菌的分离纯化
1、制备葡萄酒稀释液
取发酵2-3天时的葡萄酒液，称量1g于盛有99mL无菌水的三角瓶中，充分振荡，此即为10-2浓度的菌悬液。用无菌移液管吸取悬液0.5mL于4.5mL无菌水试管中，用移液管吹吸三次，摇匀，此即为10-3浓度。同样方法，依次稀释到10-7。稀释过程需在无菌室或无菌操作条件下进行。（稀释倍数是根据微生物的数量进行选择，不固定。可以直接涂布、或划线法分离纯化。）
2、涂布法分离（酵母菌定量分离用）
依前法向无菌培养皿中倾倒已融化并冷却至45～50℃的马铃薯葡萄糖培养基，待平板冷凝后，用无菌移液管分别吸取三个不同稀释度（10-4,10-5,10-6）菌悬液0.1mL-0.2，依次滴加于相应编号已制备好的马铃薯葡萄糖培养基平板上，右手持无菌玻璃涂棒，左手拿培养皿，并用
拇指将皿盖打开一缝，在火焰旁右手持玻璃涂棒于培养皿平板表面将菌液自平板中央均匀向四周涂布扩散，切忌用力过猛将菌液直接推向平板边缘或将培养基划破。
3培养观察接种后的所有平板倒置与适宜温度培养箱中培养。大约28-30度，时间两到三天。将葡萄分为两组发酵，一组为空白对照，另一组加入提取出的酵母菌，观察其在发酵过程中酵母菌的生长对葡萄酒发酵时间的影响。
4、酵母菌形态观察
将每个发酵阶段的葡萄汁用显微镜观察其中酵母菌的菌体特征 （三）酵母菌的检测
利用血球计数法测定 材料与仪器：
葡萄酒汁，血球计数板，显微镜，盖玻片，无菌毛细管。 操作步骤： 1、镜检计数室
在加样前，先对计数板的计数室进行镜检。若有污物，则需清洗后才能进行计数。 2、加样品
将清洁干燥的血球计数板盖上盖玻片，再用无菌的细口滴管将稀释的葡萄酒汁由盖玻片边缘滴一小滴（不宜过多），让菌液沿缝隙靠毛细渗透作用自行进入计数室，一般计数室均能充满菌液。注意不可有气泡产生。 3．显微镜计数
静止5分钟后，将血球计数板置于显微镜载物台上，先用低倍镜找到计数室所在位置，然后换成高倍镜进行计数。在计数前若发现菌液太浓或太稀，需重新调节稀释度后再计数。一般样品稀释度要求每小格内约有5—10个菌体为宜。每个计数室选5个中格（可选4个角和中央的中格）中的菌体进行计数。位于格线上的菌体一般只数上方和右边线上的。如遇酵母出芽，芽体大小达到母细胞的一半时，即作两个菌体计数。计数一个样品要从两个计数室中计得的值来计算样品的含菌量。
4．清洗血球计数板
使用完毕后，将血球计数板在水笼头上用水柱冲洗，切勿用硬物洗刷，洗完后自行晾干或用吹风机吹干。镜检，观察每小格内是否有残留菌体或其他沉淀物。若不干净，则必须重复洗涤至干净为止。 实验结果： 次数 1 2 3 各中格中细胞数 1 2 3 4 5 平均菌液浓度/(个/ml） 4 5 注意事项：
1、各类容器一定要洗干净，葡萄在酿制过程中不能碰到油污、铁器、铜器、锡器等，但可以接触干净的不绣钢制品。
2、在发酵时，发酵器的盖子一定不要盖死，防止爆炸。
3、糖不要多放，那样会影响发酵过程，产生我们不希望的成分，如果想喝甜葡萄酒，可以在发酵完成后饮用时加糖。
五、具体操作过程和实验现象及分析
（一）第一次发酵：
葡萄的清洗，捏碎，装罐，加盖（稍微透氧）做成两个瓶葡萄酒，一瓶对照（加入分离纯化后的酵母菌），一瓶空白。将两个发酵罐放在28恒温培养箱中发酵。 注意不要太用力搓洗葡萄，以防把葡萄皮上的野生酵母菌洗掉。
每天都到实验室里，将浮在上面的葡萄按下去，以便皮上的酵母菌得到充分的利用。 加糖：第一次加糖发酵两天后，第二次发酵五天后。每次每瓶加75克糖。 （二）第一次培养和观察：（1-3天）
实验准备：制备PDA培养基，灭菌，低温保存；培养皿灭菌，制备无菌水并保存。 1、据实验方案，12小时后酒精发酵启动，所以1天后，我们提取了适量葡萄汁，进行酵母菌的分离培养。取0.5ml的葡萄汁，梯度稀释成10-1，10-2……10-6，采用平板涂布的方法，进行第一次培养。取10-4,10-510-6的三个梯度的稀释菌液进行涂布接种，每个梯度三个培养皿。涂布完成后，放入28℃恒温培养箱倒置培养，一到两天。
2、葡萄汁的制片观察：
取适量葡萄汁和无菌水混合，再附上载玻片，置于十倍镜下观察
现象：由于葡萄汁成分非常多，所以镜头里背景很模糊，而且，只能观察到很少的类似于酵母菌的单个细胞，放置于40倍镜下，观察也不是很清楚，其他大多是杂菌和杂物在乱跑。（分析，发酵未真正启动，葡萄皮上的酵母菌，还未在葡萄汁中大量繁殖，所以是视野里的现象模糊，酵母菌很少）
3、葡萄酒的观察现象
从之前强烈的果香味转变为有淡淡的酒香味，而且3-4天时，发酵罐中有大量的气泡，葡萄皮颜色变暗，葡萄汁增多，且颜色更深。
葡萄酒中的酵母菌的观察，此时，由于，酵母菌的大量繁殖，在显微镜的视野里已经能，观察到很清晰的酵母菌个体，而且数量较多，图像背景亮了很多，（可能是酵母菌的生长抑制了其他杂菌的生长，是的葡萄之中的杂质变得很少了。）
4、三天后，去取培养好的九个培养基，观察其中菌落的生长情况
现象：实验结果似乎没有那么理想，培养基中的菌落，可谓五彩缤纷，有白色的菌落，有黄色的粉状的菌落，有绿色的干燥的菌落，最多的就是黑色霉菌的菌落，散发出来的味道更偏于霉菌的味道，而且，大多的菌落干燥，且成绒毛丝状。
显微镜观察：尽量挑取一些，纯净的白色菌落的菌种，和无菌水混合置于显微镜下观察，发现，菌种不纯，有一些清晰可见的酵母菌细胞，但也参杂着一些霉菌的特征结构。
结果处理方案：挑取一些疑似的白色菌种，进行涂布培养，方法同上，培养1-2天。 同时，也要再做一个备份，万一，白色的菌落不是酵母菌，所以，再取此时的葡萄汁，再做六个培养基，进行培养，原理同上。 （三）第二次培养观察：（4-5天）
葡萄酒里发酵现象的观察：葡萄酒里产生了浓郁的酒精味到，而且葡萄酒里有很多泡沫。
疑似菌落的观察：观察上次疑似菌种培养基的培养结果，发现效果还是不佳，虽然有很少备份培养基的观察：有意外的收获，发现，备份的六个培养基，酵母菌生长的都很好，有很多的乳白色的圆形斑点，湿润且光滑，闻起来有酒香味，且没有其他的杂菌，很符合，酵母菌的菌落培养特征。且通过显微镜的观察，观察到了很清晰的酵母菌细胞。
对比分析：第一次培养的失败的原因：
1、可能是刚一开始，葡萄汁中的酵母菌很少，而稀释的倍数太大，导致涂布培养时，其他杂菌的数量优势甚于酵母菌，所以才会出现那样的结果。
2、也有可能在超净工作台进行涂布操作时，没有严格做到无菌，培养基被污染。 3、而备份成功的缘由是3-4天时，酵母菌生长旺盛，抑制了其他杂菌的生长，使得生长出来的菌落，很纯净。
（四）第三次培养观察：（6-7天）
准备工作：PDA培养基的制备，麦芽汁培养基的制备，培养皿的灭菌。
将备份培养基中长出的酵母菌，进行涂布接种，在10-4、10-5、10-6三个稀释度，每组做四个培养基（两个PDA，两个麦芽汁），做好后放入28度恒温的培养箱内进行培养。
观察：两天后取出观察，PDA培养基上菌落长势良好，10-4的两个培养基上菌落数过多，无法计数，而10-5、10-6的培养基上，菌落分布均匀，可以计数。
可能是由于涂布不均匀的问题，麦芽汁培养基上菌落，太过集中，没有PDA上生长的好。 由于时间的有限，我们将此组培养基的菌种接种到对照的葡萄酒中。由于7天左右已经是酒精发酵的后期，我们发现在空白的葡萄酒中，已经几乎看不到气泡，而在对照的试验中，我们发现还有很多的泡沫，而且酒精味更浓。 （五）第二次发酵
8-9天后，过滤进行第二次发酵，发现葡萄果肉大部分已变为酒，发酵基本完成，过滤出的葡萄酒，颜色呈暗紫色，而且很浑浊。葡萄酒放入到第二次发酵罐中进行二次发酵。二次发的的黑色霉菌生长，但是通过显微镜观察，发现，它应该是霉菌的一种，而不是酵母菌
酵过程中，葡萄酒中会有一些很细腻的小泡冒出，葡萄酒在慢慢变得澄清。由于发酵过程控制的好，葡萄酒没有发生酸败，而是酒精度很高，味道很冲。
六、实验建议：
1、酵母菌的纯化需要一定的时间，要充分估计自己的时间。
2、将纯化后的酵母菌接种进行发酵，需要培养获得一定的数量，即种子的制备，建议将分离的酵母菌用麦芽汁培养基进行培养，需要一定的体积，按照5%的接种量进行培养种子，以利于加快发酵速度。
3、制备葡萄酒是否有足够的时间，请考虑。按照设计量，不进行也可以。 4、若没有葡萄，可用提子代替。
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