维普资讯 http://www.cqvip.com 第２４卷第４期 河北职工医学院学报 Ｖｏ１．２４．Ｎｏ．４ ２００７年１２月 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈｅｂｅｉ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｆｏｒ Ｃｏｎｔｉｎｕｉｎｇ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ Ｄｅｅ．２００７ 氟康唑去除细胞培养中的真菌污染 王恩军靳稀王亮 （河北大学医学部，河北保定０７１０００） 摘要：目的探讨一种去除细胞培养中的真菌污染的好方法。方法 采用ＰＤＡ平板鉴定受污染的细胞培养液，１０％的 氟康唑氯化钠注射液处理受污染的细胞。结果氟康唑氯化钠注射液能有效地去除细胞培养中的真菌污染。结论氟康 唑是去除细胞培养过程中真菌污染的一种安全有效的好方法。 关键词：氟康唑；细胞培养；真菌污染 中图分类号：Ｑ９３９．９２ 献标识码：Ａ 文章编号：１００８—６６９２（２００７）０４—０００７—０２ 细胞培养中的污染分为两类，化学污染和生物污染。 １．２污染类型的初步鉴别 生物污染中较为常见的是真菌污染，最常见的真菌有烟曲 １．２．１材料受污染的细胞培养液ＲＰＭＩ一１６４０ １份；增 霉、黑曲菌、孔子霉、毛霉菌、白色念珠菌和酵母菌 。真菌 菌培养基一马铃薯培养基（ＰＤＡ）。 是一种真核细胞型微生物，单细胞真菌称为酵母菌；多细胞 １．２．２方法 在无菌条件下将受污染的细胞培养液 真菌能长出菌丝和孢子且交结成团，称丝状菌，又称霉 ｌＯＯｐ￣Ｌ涂布于ＰＤＡ平板，３００Ｃ倒置培养７２ｈ，观察其菌落 菌 Ｊ。在进行细胞体外培养时，虽然做了大量的消毒和灭 形态。 菌工作，但有时细胞污染现象仍不可能完全避免，尤其在霉 １．３污染的去除吸弃受污染的旧培养液，用ＰＢＳ冲洗培 雨季节进行细胞培养更易污染。笔者在试验过程中经历真 养瓶两遍，换含１０％胎牛血清的ＲＰＭＩ一１６４０培养基，按 菌污染，并对受污染的细胞培养液基进行初步鉴定，应用氟 １０％的剂量加入氟康唑氯化钠注射液（Ｆｌｕｅｏｎａｚｏｌｅ，Ｚｉｎｇ／ｍＬ 康唑处理受污染的细胞，污染得到控制，传代后已用于试 四川科伦药业股份有限公司），每日１次，持续１０ｄ，同时每 验，现将方法介绍如下： 天镜下仔细观察细胞生长情况。 １材料与方法 ２结果 １．１细胞污染现象本人在近期用ＲＰＭ！一１６４０培养Ｈｅ— ２．１ 污染类型的初步鉴别结果７２ｈ后，平板上生长出直 ｌａ细胞时，出现了细胞污染现象。倒置显微镜高倍镜可观 径约２～３ｒａｍ表面湿润、粘稠且隆起的圆形乳白色菌落，怀 察到培养液中有黑色丝团状物夹杂在细胞中生长，有的看 疑为酵母菌。用接种环取少量疑似为酵母菌的菌体，置于 似有根，其上部的黑色丝团状物可随培养液的晃动而晃动。 载玻片中英的无菌生理盐水中，加盖玻片。在高倍镜下观 但培养液澄清，未发生浑浊，细胞生长缓慢。见图１。 察，多数为５～１０ｔｚｍ，的卵圆形单细胞，部分有出芽现象。 初步确定为酵母菌。 ２．２药物处理结果细胞经每日１次的冲洗、换液、氟康 唑处理后，污染得到明显的控制，镜下观察黑色丝团状物逐 日减少，细胞生长趋势尚可，未发现有异常现象。加药过程 中可正常传代，持续１０ｄ后，镜下已无真菌生长，细胞生长 良好，可用于试验，与正常未受污染的细胞无明显差异。 ３讨论 细胞培养过程中被真菌污染是组织培养工作的大敌， 故从一开始就要十分重视，应积极采取措施，防止污染。一 图１ 人宫颈痛Ｈｅｌａ细胞真菌污染形态观察 旦发生真菌污染，如何能去除细胞培养过程中的真菌污染， Ｔｈｅ ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｅＰｉＰｈｙｔｅ ｂｅｔｗｅｅｎ Ｈｅｌａ ｃｅｌｌｓ 一直是非常令人棘手的问题。真菌的生长速度较缓，而 ３７￣Ｃ的培养温度已经超过真菌最适生长温度（２５￣Ｃ左右）． 收稿日期：２００７—０５—２４ 因而其生长速度更慢，一般培养７２ｈ左右显微镜下可见真 作者简介：王恩军（１９７７一），男，河北张家口人，讲师，硕士． 菌生长，真菌的形态有丝状、单细胞和长链状排列的细胞， 到９６ｈ时肉眼才观察到棉絮状的菌丝团等 Ｊ。 ——１—— 维普资讯 http://www.cqvip.com ４期 河北职工医学院学报 一２４卷 氟康唑又名大扶康，是一种新型三唑类抗真菌药物，有 广谱抗真菌作用，对真菌细胞色素Ｐ一４５０依赖酶的抑制作 用具有高度选择性，能选择性地抑制真菌的甾醇合成。一 旦发生真菌污染且污染细胞的价值较大，可选用１０％的氟 康唑氯化钠注射液加以去除，污染得到控制后还应在不加 种安全而有效的好方法。 参考文献： ［１］杨吉成，宋礼华，周建华，等．医用细胞工程［Ｍ］．上海： 上海交通大学出版社，２００１．１０２． ［２］曾卫东，董［３］邵荣标，钱青．动物细胞培养中微生物污染的检测 虎，吴巨飞，等．细胞培养法真菌污染控制 药物的培养基中培养４—６代，确定污染是否已被消除。实 验表明，氟康唑能有效的抑制细胞培养基中真菌的生长和 繁殖，而且在有效抑菌浓度范围内氟康唑对细胞无明显毒 性，可应用于细胞培养，是去除细胞培养过程中真菌污染的 ［Ｊ］．浙江畜牧兽医，２００３，２８（２）：１２． 初探［Ｊ］．南通医学院学报，２００２，２２（３）：２７８—２８０． （上接第４页） ［３］Ｐｒｚｙｂｙｌｏｗｓｋｉ Ｔ，Ｂａｎｇａｓｈ ＭＦ，Ｒｅｉｃｈｍｕｔｈ Ｋ，ｅｔ ａ１．Ｍｅｃｈａ－ ｎｉｓｍｓ ｏｆ ｔｈｅ ｃｅｒｅｂｍｖａｓｃｕｌａｒ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ａｐｎｏｅａ ｉｎ ｈｕｍａｎｓ ＬｉＰＰｅｒａ等 最早于１９９７年研究２型糖尿病患者的 ＣＶＲ，他们把８６例２型糖尿病患者按视网膜病变程度分为 ３个亚组，增殖性视网膜病变组、背景性视网膜病变组及无 ［Ｊ］．Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ，２００３，５４８（ｐｔ １）：３２３－３３２． ［４】朱旅云，刘坤申．胰岛素抵抗与内皮功能障碍［Ｊ］．国外 医学内分泌学分册，２００２，２２（５）：３１９～３２１． ［５］Ｔａｎｉｗａｋｉ Ｈ，Ｋａｗａｇｉｓｈｉ Ｔ，ＥｍｏｔｏＭ，ｅｔａ１．Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｂｅ— ｔｗｅｅｎ ｔｈｅ ｉｎｔｉｍａ－－ｍｅｄｉａ ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ ｏｆ ｔｈｅ ｃａｒｏｔｉｄ ａｒｔｅｒｙ ａｎｄ ａｏｒｔｉｃ ｐｕｌｓｅ ｗａｖｅ ｖｅｌｏｃｉｔｙ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｔｙｐｅ ２ ｄｉａｂｅｔｅｓ． 视网膜病变组，用ＴＣＤ检测屏气３０ｓ后ＭＣＡ平均速度对静 息状态下平均血流速度的增加率来评价ＣＶＲ。发现增殖 性视网膜病变组的ＣＶＲ显著低于其他亚组及对照组。由 于视网膜动脉可反映颅内动脉情况，他们认为ＣＶＲ减低反 映了脑血管损害较重。Ｆｕｌｅｓｄｉ等 通过比较静脉注射乙 酰唑胺２０ｍｉｎ后与静息状态下ＭＣＡ平均血流速度的增加 率，来评价２型糖尿病患者的ＣＶＲ。发现病程＞１０年糖尿 病组的ＣＶＲ显著低于≤１０年糖尿病组（Ｐ＜０．０５）及对照 组（Ｐ＜０．０５），ＣＶＲ与糖尿病病程呈负相关（ｒ＝一０．５３，Ｐ ＜０．０１）。本研究发现２型糖尿病患者内中膜正常组的脑 血管反应性虽然较对照组ＣＶＲ有减低的趋势，但差异无显 著性，而内中膜增厚组的ＣＶＲ较内中膜正常组和对照组均 Ｖｅｓｓｅｌ Ｗａｌｌ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｉｎ ｔｙｐｅ ２ Ｄｉａｂｅｔｅｓ［Ｊ］．Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｃａｒｅ，１９９９，２２（１１）：８５１—８５７． ［６］ＬｉＰＰｅｒａ Ｓ，Ｇｒｅｇｏｒｉｏ Ｆ，Ｃｅｒａｖｏｌｏ ＭＧ，ｅｔ １．Ｄｉａａｂｅｔｉｃ ｒｅｔｉｎｏｐ— ａｔｈｙ ａｎｄ ｃｅｒｅｂｒａｌ ｈｅｍｏｄｙｎａｍｉｃ ｉｍｐａｉｒｍｅｎｔ ｉｎ ｔｙｐｅ ＩＩ ｄｉａ— ｂｅｔｅｓ［Ｊ］．Ｅｕｒ Ｊ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ，１９９７，７（２）：１５６—１６２． ［７］Ｆｕｌｅｓｄｉ Ｂ，Ｌｉｍｂｕｒｇ Ｍ，Ｂｅｒｅｃｚｋｉ Ｄ，ｅｔ ａ１．Ｃｅｒｅｂｒｏｖａｓｃｕｌｒ ａｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｔｅｓｅｒｖｅ ｃａｐａｃｉｔｙ ｉｎ ｔｙｐｅ ＩＩ ｄｉａｂｅｔｅｓ ｍｅｌｌｉｔｕｓ． Ｊ Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｃｏｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ［Ｊ］．１９９９，１３（４）：１９１—１９９． 明显减低，这表明颈动脉内中膜增厚者脑血管储备能力减 低，并进一步提示脑血管硬化程度更为严重。本研究表明 颈动脉内中膜增厚与颅内血管的损害具有密切关系，颈动 脉病变可作为反映颅内动脉病变的一个窗口。 参考文献： ［１］Ｕｌｉｒｃｈ ＰＴ，Ｂｅｃｋｅｒ Ｔ，ＫｅｍＰｓｋｉ ＯＳ．Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｅｒｅｂｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｆｌｏｗ ａｎｄ ＭＣＡ ｆｌｏｗ ｖｅｌｏｃｉｔｙ ｍｅａｓｕｒｅｄ ｉｎ ｈｅａｌｔｈｙ ｖｏｌ— ｕｎｔｅｅｒｓ ｄｕｒｉｎｇ ａｃｅｔａｚｏｌａｍｉｄｅ ａｎｄ Ｏ２ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｊ Ｎｅｕｒｏｌ Ｓｃｉ，１９９５，１２９（２）：１２０—１３０． ［２］Ｅｎｇｅｌｈａｒｄｔ Ｍ，Ｐｆａｄｅｎｈａｕｅｒ Ｋ，Ｚｅｎｔｎｅｒ Ｊ，ｅｔ ａ１．Ｉｍｐａｉｒｅｄ ｃｅｒｅｂｒａｌ ａｕｔｏｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｉｎ ａｓｙｍｐｔｏｍａｔｉｃ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｃａ— ｒｏｔｉｄ ａｒｔｅｒｙ ｓｔｅｎｏｓｉｓ：ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ａｃｅｔａｚｏｌａｍｉｄｅ－ＳＰＥＣＴ ａｎｄ ｔｒａｎｓｃｒａｎｉｌａ ＣＯ２一ｄｏｐｐｌｅｒ ｓｏｎｏｇｒａｐｈｙ［Ｊ］．Ｚｅｎｔｒｌａｂｌ Ｃｈｉｒ。２００４，１２９（３）：１７８．１８２． 图１ 大脑中动脉血流参数测量图 一８一