基因工程
一、基因工程的概念
基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，并通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的额，因此又叫做DNA重组技术。 基因工程的别名 操作环境 操作对象 操作水平 基本过程 基因拼接技术或DNA重组技术 生物体外 基因 DNA分子水平 剪切→ 拼接→ 导入→ 表达 实质（原理） 基因重组 克服远缘杂交不亲和的障碍，定向改造生物的遗传特性 结果改造的方向 二、基因工程的基本工具
1、限制性核酸内切酶-----“分子手术刀” 2、DNA连接酶-----“分子缝合针”
3、基因进入受体细胞的载体-----“分子运输车”
1．“分子手术刀”——限制性核酸内切酶（限制酶） （1）存在：主要存在于原核生物中。 （2）特性：特异性，一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并且能在特定的切点上切割DNA分子。 （3）切割部位：磷酸二酯键 （4）作用：能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。 1 / 10
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（5）识别序列的特点：
（6）切割后末端的种类：DNA分子经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式——黏性末端和平末端。当限制酶在它识别序列的中轴线两侧将DNA的两条链分别切开时，产生的是黏性末端，而当限制酶在它识别序列的中轴线处切开时，产生的则是平末端。
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2．“分子缝合针”——DNA连接酶
（1）作用：将限制酶切割下来的DNA片段拼接成DNA分子。 （2）类型 相同点：都连接磷酸二酯键 3．“分子运输车”——载体 (1)载体具备的条件： ①能在受体细胞中复制并稳定保存。 ②具有一个至多个限制酶切点，供外源DNA片段插入。 ③具有标记基因，供重组DNA的鉴定和选择。种类 来源 功能E·coliDNA连接酶 大肠杆菌 T4DNA连接酶 T4噬菌体 只能将双链DNA片段互补缝合两种末端，但的黏性末端之间的磷酸二连接平末端之间的酯键连接起来 效率较低 特性
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(2)最常用的载体是质粒，它是一种裸露的、结构简单的、独立于细菌拟核之外，并具有自我复制能力的双链环状DNA分子。
(3)其他载体：λ噬菌体的衍生物、动植物病毒。 (4)载体的作用:
①作为运载工具，将目的基因送入受体细胞。 ②在受体细胞内对目的基因进行大量复制。 【解题技巧】
(1)限制酶是一类酶，而不是一种酶。
(2)限制酶的成分为蛋白质，其作用的发挥需要适宜的理化条件，高温、强酸或强碱均易使之变性失活。
(3)在切割目的基因和载体时要求用同一种限制酶，目的是产生相同的黏性末端。 (4)获取一个目的基因需限制酶剪切两次，共产生4个黏性末端或平末端。
(5)不同DNA分子用同一种限制酶切割产生的黏性末端都相同，同一个DNA分子用不同的限制酶切割，产生的黏性末端一般不相同。
(6)限制酶切割位点应位于标记基因之外，不能破坏标记基因，以便于进行检测。
(7)基因工程中的载体与细胞膜上物质运输的载体不同。基因工程中的载体是DNA分子，能将目的基因导入受体细胞内；膜载体是蛋白质，与细胞膜的通透性有关。 (8)基因工程中有3种工具，但工具酶只有2种。
例1．限制酶MunⅠ和限制酶EcoRⅠ的识别序列及切割位点分别是－C↓AATTG－和－G↓AATTC－。如图表示四种质粒和目的基因，其中，箭头所指部位为限制酶的识别位点，质粒的阴影部分表示标记基因。适于作为图示目的基因载体的质粒是（ ）
A
限制酶的应用特点
（1）在获取目的基因和切割载体时通常用同种限制酶，以获得相同的黏性末端。但是如果用两种不同限制酶切割后形成的黏性末端相同时，在DNA连接酶的作用下目的基因与载体也可以连接起来。 （2）为了防止载体或目的基因的黏性末端自己连接，可用不同的限制酶分别处理目的基因和载体，使目的基因两侧及载体上具有两个不同的黏性末端 五种酶的比较
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限制性内切酶 作用底物 DNA分子 作用部位 磷酸二酯键 形成产物 黏性末端或平末端 重组DNA分子 DNA连接酶 DNA片段 磷酸二酯键 DNA聚合酶 脱氧核苷酸 磷酸二酯键 子代DNA DNA解旋酶 DNA分子 碱基对间的氢键 脱氧核苷酸单链 RNA聚合酶 核糖核苷酸 磷酸二酯键 核糖核苷酸单链 三、基因工程的操作步骤 1、目的基因的获取 2、基因表达载体的构建 3、将目的基因导入受体细胞 4、目的基因的检测与鉴定 1、目的基因的获取 获取目的基因的方法： （1）直接分离法
从基因文库中获取目的基因
将含有某种生物不同基因的许多DNA短片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因，称为基因文库。包括基因组文库和cDNA文库。 直接从基因组中获取目的基因最常用的方法是： “鸟枪法”。 （2）人工合成法
化学合成法：片段较小，核苷酸序列已知的目的基因，直接利用DNA合成仪用化学方法合成，不需要模板。
反转录法：以RNA为模板，在逆转录酶作用下合成目的基因DNA（cDNA）。 （4）利用PCR技术扩增目的基因
PCR技术：是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。由于PCR过程在高温下进行，因此需要使用热稳定的DNA聚合酶。
目的：通过指数式扩增获取大量的目的基因
前提：要有一段已知目的基因的脱氧核苷酸序列，以便合成引物。 2．基因表达载体的构建——基因工程的核心
(1)目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。
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(3)基因表载体的构建程： 3．将目的基导入受体细目的基因进受体细胞并且在受体胞内维持稳和表达的过
称为转化。转化的关键是目的基因整合到受体细胞染色体基因组中。 金榜 P185
达过因胞 入内，细定程，
生物种类 植物细胞 农杆菌转化法 体细胞 动物细胞 微生物细胞 常用方法 显微注射技术 感受态细胞法 受精卵 原核细胞 受体细胞 转化过程 将目的基因插入到Ti质粒 的T－将含有目的基因的表达载体Ca2＋处理细胞→感受态细胞DNA上→农杆菌→导入植物细胞→提纯→取卵(受精卵)→显微→重组表达载体与感受态细整合到受体细胞的染色体DNA上→注射→受精卵发育→获得具胞混合→感受态细胞吸收DNA表达 有新性状的动物 分子 4．目的基因的检测与鉴定
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[误区警示]
(1)标记基因的作用——筛选、检测目的基因是否导入受体细胞，常见的有抗生素抗性基因、发光基因(表达产物为带颜色的物质)等。
(2)受体细胞常用植物受精卵或体细胞(经组织培养)、动物受精卵(一般不用体细胞)、微生物(大肠杆菌、酵母菌)等。要合成糖蛋白、有生物活性的胰岛素则必须用真核生物酵母菌(需内质网、高尔基体的加工、分泌)；一般不用支原体，原因是它营寄生生活；一定不能用哺乳动物成熟的红细胞，原因是它无细胞核，不能合成蛋白质。 (3)基因表达载体中，启动子(DNA片段)≠起始密码子(RNA)；终止子(DNA片段)≠终止密码子(RNA)。基因表达载体的构建是最核心、最关键的一步，在体外进行。
(4)目的基因与载体的连接方式有多种，如目的基因－目的基因、目的基因－载体、载体－载体等。 例3.下列有关基因工程操作的叙述中，正确的是 ( ) A A．用同种限制酶切割载体与目的基因可获得相同的黏性末端
B．以蛋白质的氨基酸序列为依据合成的目的基因与原基因的碱基序列相同 C．检测到受体细胞含有目的基因就标志着基因工程操作的成功
D．用含抗生素抗性基因的质粒作为载体是因为其抗性基因便于与外源基因连接 例4 金榜P187 T2
四、基因工程的应用与蛋白质工程
1．乳腺生物反应器与工程菌生产药物的比较 (1)含义：
①乳腺生物反应器是指将外源基因在哺乳动物的乳腺中特异表达，利用动物的乳腺组织生产药物蛋白。
②工程菌是指用基因工程的方法，使外源基因得到高效表达的菌类细胞株系。 (2)两者区别：
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比较项目 乳腺生物反应器 工程菌 基因结构 动物基因的结构与人类基细菌或酵母菌等生物基因的结构与人因的结构基本相同 类基因的结构有较大差异 基因表达 合成的药物蛋白与天然蛋细菌细胞内没有内质网、高尔基体等细白质相同 胞器，产生的药物蛋白可能没有活性 受体细胞 动物的受精卵 微生物细胞 2．蛋白质工程与基因工程的比较 （金榜P189） 导入目的基 区别与因的方式定向改造或生产人类联系 实质 所需的蛋白质 显微注射法感受态细胞法 蛋白质工程 定向改造生物的遗传特基因工程 性，以获得人类所需的需严格灭菌，严格控预期蛋白质功能→设获取目的基因→构生物类型或生物产品 不需严格灭菌，温制工程菌所需的温可生产自然界没有的只能生产自然界已有的计预期的蛋白质结构建基因表达载体→生产条件 度等外界条件对其结果 蛋白质 蛋白质 pH、营养物质浓度、过程 →推测应有的氨基酸将目的基因导入受影响不大 ①蛋白质工程是在基因工程基础上延伸出来度等外界条件 序列→找到相对应的体细胞→目的基因联系 的第二代基因工程 ②基因工程中所利用的药物提取 脱氧核苷酸序列从动物乳汁中提取 的检测与鉴定从微生物细胞中提取 某些酶需要通过蛋白质工程进行修饰、改造
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蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活的需求。 3、基因工程的应用： 金榜P189 4、基因治疗：
（1）概念：指利用正常基因置换或弥补缺陷基因的治疗方法。
（2）方法：基因置换、基因修复、基因增补、基因失活等。如：腺苷酸脱氨酶（ADA）基因缺陷症的基因治疗。
（3）基因治疗的途径
体外基因治疗：先从病人的体内获得某种细胞进行培养，然后在体外完成基因转移，再筛选成功转移的细胞扩增培养，最后重新输入患者体内。如腺苷酸脱氨酶基因的转移。
体内基因治疗：用基因工程的方法，直接向人体组织细胞中转移基因的治病方法。 5、基因诊断
（1）概念：又称DNA诊断，是采用基因检测的方法来判断患者是否出现了基因异常或携带病原体。 （2）方法：DNA分子杂交技术。它的基因原理是：互补的DNA单链能够在一定条件下结合成双链，即能够杂交，这种结合是特异的，即严格按照碱基互补配对的原则进行。当用一段已知基因的单链作探针（常用同位素、荧光分子等进行标记），与变性后的单链基因组DNA接触时，如果两者的碱基完成配对，互补地结合成双链，表明被测基因组DNA中含有已知的基因序列。 [误区警示]
(1)基因治疗后，缺陷基因没有改变。基因治疗是把正常基因导入受体细胞中，以表达正常产物从而治疗疾病，对原来细胞中存在缺陷的基因没有清除或改变。
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(2)对蛋白质分子进行改造，其本质是改变其基因组成。如果对蛋白质直接改造，即使改造成功，被改造的蛋白质分子还是无法遗传。
(3)DNA分子作探针进行检测时应检测单链，即将待测双链DNA分子打开。 (4)青霉素是青霉菌产生的，不是通过基因工程产生的。
例5．下列关于蛋白质工程和基因工程的比较，不合理的是( )
A．基因工程原则上只能生产自然界已存在的蛋白质，而蛋白质工程可以对现有蛋白质进行改造，从而制造一种新的蛋白质
B．蛋白质工程是在基因工程的基础上发展起来的，蛋白质工程最终还是要通过基因修饰或基因合成来完成
C．当得到可以在－70℃条件下保存半年的干扰素后，在相关酶、氨基酸和适宜的温度、pH条件下，干扰素可以大量自我合成
D．基因工程和蛋白质工程产生的变异都是可遗传的
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