叶绿体色素的提取分离与理化性质鉴定

一、实验目的

1、学会叶绿体色素提取和分离的方法。

2、介绍叶绿体色素的荧光现象、皂化反应等化学性质。 二、实验原理

叶绿体中所含绿色素（包含叶绿素a和叶绿素b）和黄色素（包含胡萝卜素和叶黄素）两大类，这两类色素都不溶水，而溶有机溶剂，故需用乙醇或丙酮等有机溶剂抽取。 提取液可用色层分析的原理加以分离。因吸附剂对不同物质的吸附力不同，当用适当的溶剂推动时，混合物中各成分在两相（流动相和固定相）间具有不同的分配系数，所以它们的移动速度不同，经过一定时间层析后，便将混合色素分离。

叶绿素就是一种二羧酸――叶绿酸与甲醇和叶绿醇构成的繁杂酯，故可以与碱起至皂化反应而分解成醇（甲醇和叶绿醇）和叶绿酸的盐，产生的盐能溶水中，需用此法将叶绿素与类胡萝卜素分离；叶绿素与类胡萝卜素都具备光学活性，叶绿素稀释光量子而转变成激发态，激发态的叶绿素分子很不平衡，当它变小返回基态时可以升空出红光量子，因而产生荧光。叶绿素中的镁可以被h+所替代而变成褐色的回去镁叶绿素，后者突遇铜则沦为绿色的铜代叶绿素，铜代叶绿素很平衡，在光下难于毁坏，故常用此法制作绿色多汁植物的冲泡标本。 三、实验器材 新鲜的植物叶片。

研钵；漏斗；100ml三角瓶；玻璃棒；剪刀；滴管；培养皿；定性滤纸条（5cm×1.5cm）。

毛细管；试管；试管架；石棉网；烧杯（100ml）；酒精灯；铁三角架；刻度吸量管2ml、5ml各1两支。 四、实验试剂

1、95%乙醇；石英砂；碳酸钙粉

2、推动剂：按石油醚：丙酮：苯（10：2：1）比例配制（体积比）3、醋酸铜粉末；5%的稀盐酸4、甲醇、koh 五、实验步骤 1．叶绿体色素的提取

（1）挑菠菜或其他植物新鲜叶片4~5片（2g左右），晒干，擦拭，换成中脉，剪碎，放进研钵中。

（2）研钵中加入少量石英砂及碳酸钙粉，加2~3ml95%乙醇，研磨至糊状，再加10ml95%乙醇，暗处放置3~5min，上清液过滤于三角瓶中，残渣用10ml95%乙醇冲洗，一同过滤于三角瓶中。 2.叶绿体色素的拆分

（1）取一块预先干燥处理过的定性滤纸，将它剪成长约10cm，宽约1cm的滤纸条。 （2）用毛细管汲取色素提取液。在滤纸条的一端（约距这一端的1cm处为）划一条滤液细线，等滤液潮湿后，再重复划出4～5次。

（3）将滤纸条的另一端（约距这一端1cm处）折成“v”字形，并将它挂在放有层析液的烧杯壁上（注意：色素线要略高于层析液面，且滤纸条下端最好不要碰到烧杯壁），盖上培养皿。3.叶绿体色素的性质鉴定(1)荧光现象的观察

挑1两支20ml刻度试管重新加入5ml叶绿体色素乙醇提取液，在直射光下观测溶液的反射光与反射光颜色有何相同？表述原因。 (2)皂化作用（绿色素与黄色素的分离）

在搞过荧光现象观测的叶绿体色素乙醇提取液试管中重新加入1.5ml20%koh-甲醇溶液，充份容器。片刻后，重新加入5ml苯，容器，再沿试管壁慢慢重新加入1～1.5ml蒸馏水，轻轻搅匀（勿惨烈德帕伦），于试管架上静置分层。若溶液不分层，则用滴管汲取蒸馏水，沿管壁碱液，边碱液边晃动，直至溶液已经开始分层时，静置。可以看见溶液逐渐分成两层，下层就是叶唇柱的乙醇溶液，其中溶存有皂化的叶绿素a和b（以及少量的叶黄素）；上层就是苯溶液，其中溶存有黄色的胡萝卜素和叶黄素。 (3)h+和cu++对叶绿素分子中mg++的取代作用

挑上述色素乙醇提取液少许于试管中，重新加入5%hcl数滴，容器，直到溶液发生褐绿色，当溶液变褐后，再重新加入少量醋酸铜粉末，微微冷却，观测记述溶液颜色变化情况。六、注意事项

1、为了避免叶绿素的光分解，操作应在弱光下进行。2、研磨时间尽可能短些，以不超过两分钟为宜。

3、在低温下出现皂化反应的叶绿体色素溶液，极易乳化而发生黑絮状物，溶液混浊，且不分层。可以惨烈容器，放到30～40℃的水浴中冷却，溶液很快分层，絮状物消失，溶液显得纯净透明化。七、实验报告

1、将纸层析法分离叶绿体色素的实验结果贴在实验报告纸上，并给予分析。八、思考题

1、研磨抽取叶绿素时重新加入caco3存有什么促进作用？

2、叶绿素a、叶绿素b、叶黄素和胡萝卜素在滤纸上的分离速度不一样，这与它们的分子量有关吗？