曼地亚红豆杉中紫杉醇的提取分离工艺及测定研究

曼地亚红豆杉中紫杉醇的提取分离工艺及测定研究

姓名：王志刚申请学位级别：硕士专业：有机化学指导教师：周春山

20070501

中南大学硕士学位论文摘要摘要本文对曼地亚红豆杉枝叶中紫杉醇的提取和分离进行了系统的研究。从曼地亚红豆杉枝叶提取紫杉醇有其特殊的困难，即枝叶中含有大量的蜡质、色素等，这些物质在进行提取时也会被提取出来从而使得分离过程更加困难。针对这一特点，本文设计了正己烷萃取和碱洗相结合的方法，先以正己烷萃取除去蜡质等低极性物质，再进行碱洗除去高极性杂质，这种方法可以除掉８６％以上的杂质，极大提高了色谱柱的处理效率。经过考察乙醇、甲醇、氯仿、丙酮、乙酸乙酯及丙酮和乙酸乙酯混合液等提取溶剂，从提取率、紫杉醇纯度，提取液处理的难易，及经济因素等方面综合考虑，选定无水乙醇作为提取溶剂，其提取条件经单因素实验和正交实验后得到优化：浸提温度为５０℃，恒温浸提２ｈ，料液比ｌ：２０。紫杉醇的首次提取率为７４．８０％，经三次提取提取率达９９．２１％。同时比较了超声提取和索氏提取两种提取方法。超声提取以无水乙醇为提取溶剂，料液比１：２０，经两次４０ｍｉｎ的提取，其提取率既达９８．４４％。与常规溶剂浸提相比，在较低浸提温度下大大缩短了提取时间，同时保证了提取率。采用索氏提取一小时回流三次，提取６小时，提取得率。索氏提取提取温度高，导致紫杉醇异构化，且提取时间长，提取率反而低下。提取粗产物经层析柱的提纯分离，本文中比较了硅胶，大孔树脂ＡＢ一８两种吸附层析用于从粗产物中分离紫杉醇。在硅胶柱层析中，通过考察层析洗脱速度、进料量、层析柱高等因素，优化操作条件，确定了层析工艺：氯仿湿法装柱，装柱规格为ｍ２５ｘ４００ｍｍ，上样量以０．５．０．７５９为宜，洗脱流速控制为１．１．５ｍＬ／ｍｉｎ之间，先以氯仿进行充分淋洗，后换以３％的甲醇氯仿溶液洗脱。经一次层析，紫杉醇纯度达５．８２％，回收率为９８．７８％。在ＡＢ．８层析中，其层析工艺为：湿法装柱，装柱规格为０２５ｘ４００ｍｍ，洗脱流速控制为１．５ｍＬ／ｍｉｎ，先以３ＢＶ３０％乙醇溶液进行洗脱，后续以３ＢＶ５０％乙醇溶液，再以３ＢＶ７０％乙醇溶液进行洗脱，收集７０％乙醇的洗脱液。经一次层析，紫杉醇纯度达３．２５％，回收率为９９．３６％。二次层析工艺为：先以３ＢＶ６０％乙醇溶液进行洗脱，再以３ＢＶ７０％乙醇溶液洗脱，洗脱速度控制为１．５ｍＬ／ｍｉｎ。经二次层析，此时紫杉醇纯度达到１８．４３％，回收率为中南大学硕士学位论文摘要９６．４６％。实验过程中采用反相ＨＰＬＣ法进行检测分析，通过实验确定其色谱条件为：以Ｃ１８为固定相，甲醇．水（６５：３５）为流动相，检测波长为２２７ｎｍ，柱温（２５±１）℃，流速为０．７ｍＬ／ｍｉｎ。采用外标峰面积法进行定量分析。经分析该曼地亚红豆干杉枝叶中紫杉醇含量为０．０１２６％，ＲＳＤ为１．４６％。关键词：蔓地亚红豆杉，紫杉醇，ＨＰＬＣ，提取，柱层析ⅡＤＩＳＳＥＲｍ盯ＩｏＮＦｏＲＭＡＳ，ｒＥＲ’ＳＤＢＧＲＥＥＡＢＳＴＲＡＣＴＡＢＳＴＲＡＣＴｎｅｅｘｔｒａｃｔｉｏｎａｎｄｐｒｉｍａｒｙｉｓｏｌａｔｉｏｎｏｆｔａｘｏｌ鼢ｔｈｅｌＰａｖｅｓａｎｄｂｒａｎｃｈｅｓｏｆ而阳协ｍｅｄｉａｗａｓｓｔｕｄｉｅｄｓｙｓｔｅｍａｔｉｃａｌｌｙｉｎｔｈｉｓｐａｐｅｒ．Ｓｏｍｅｓｐｅｃｉａｌｄｉｍｃｕｒｉｅｓｅｘｉｓｔｉｎｔｈｉｓｐｒｏｃｅｓｓｂｅｃａｕｓｅｌｅａｖｅｓａｎｄｂｒａｎｃｈｅｓｃｏｎｔａｉｎａｌａｒｇｅａｍｏｕｎｔｏｆｉｍｐｕｒｉｔｉｅｓｓｕｃｈａｓｗａｘ，ｐｉｇｍｅｎｔｔｈａｔｍａｙｂｅｅｘｔｒａｃｔｅｄｄｕｒｉｎｇｔｈｅｓｅｐａｒａｔｉｏｎａｓｗｅｌｌ，ｔｈｕｓ，ｔｈｅｐｒｏｃｅｓｓｄｉｆｆｉｃｕｌｔ．Ｔｏｔｈｉｓｂｅｃｏｍｅｓｍｏｒｅｐｏｉｎｔ，ｔｈｅｐｒｅ－ｔｒｅａｔｍｅｎｔｍｅｔｈｏｄｗｈｉｃｈｃｏｍｂｉｎｅｄｎ－ｈｅｘａｎｅｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｗｉｔｈｂａｓｉｃ．ｓｏｌｕｔｉｏｎｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ，ｗｈｉｃｈｗｉｐｅｄｏｕｔｔｈｅａｐｏｌａｒａｎｄｔｈｅｍｉｌｄｌｙｐｏｌａｒｃｏｍｐｏｕｎｄｓｕｃｈａｓｗａｘｆｉｒｓｔｌｙ，ｔｈｅｎｗａｓｈｅｄｉｍｐｒｏｖｅｄｏｆｆｔｈｅｓｕｐｅｒｉｏｒｐｏｌａｒｉｍｐｕｒｉｔｉｅｓ．ｎ怆ｉｍｐｕｒｉｔｉｅｓｍａｙｂｅｗｉｐｅｄｏｕｔａｂｏｕｔ８０％ｉｎｔｈｉｓｗａｙ，ＳＯｔｈｅｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙｏｆｓａｍｐｌｅｔｒｅａｔｍｅｎｔｗａｓｇｒｅａｔｌｙ．Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｅｆｆｅｃｔｏｆｅｘｔｒａｃｔｉｖｅｓｏｌｖｅｎｔｓｕｃｈａｓｅｔｈａｎｏｌｇｎｅｔｈｏｌ，ｐｕｒｉｔｙｏｆｐｒｏｐａｎｏｎｅ，Ｔｒｉｃｈｌｏｒｏｍｅｔｈａｎｅｗａｓｓｔｕｄｉｅｄｈｅｒｅ．Ｃｏｎｓｉｄｅｍｔｉｎｇｔｈｅｔａｘｏｌｉｎｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ。ｅｘｒａｃｔｉｏｎｓｏｌｖｅｎＬｒａｔｅａｎｄｃｏｓｔ．ｅｔｈａｎｏｌｗａｓｐｉｃｋｅｄｏｕｔａｓｅｘｔｒａｃｔｉｖｅＯｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎｓｅｌｅｃｔｉｏｎｉｎｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｏｆｔａｘｏｌＷａｓｆｏｌｌｏｗｓ：ｈｅｍｉｎｇｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｔｈｒｅｅｈｏｕｒｓｉｎ６０＂０，ｒａｔｉｏｏｆｆｅｅｄ－ｓｔｏｃｋｗｅｉｇｈｔｔｏｔｈｅｖｏｌｕｍｅｏｆｓｏｌｖｅｎｔｉｓ１：２０．ｔｈｅｆｉｒｓｔｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｒａｔｉｏＷａｓ７４．８０％ａｎｄｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｒａｔｉｏｒｅａｃｈｅｄ９９．２１％ｂｖｔｈｒｅｅｅｘｔｒａｃｔｉｏｎＷａｓｐｅｒｆｏｒｍｅｄｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｓ．ＵｌｔｒａｓｏｎｉｃｅｘｔｒａｃｔｉｏｎａｎｄＳｏｘｈｌｅｔａｎｄｃｏｍｐａｒｅｄ．Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ凳ｅｄ．ｓｔｏｃｋｗｅｉｇｈｔｔｏｔｈｅｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｐｒｏｃｅｄｕｒｅＷａｓｆｏｌｌｏｗｓ：ｒａｔｉｏｏｆａｔｔｗｏｖｏｌｕｍｅｏｆｓｏｌｖｅｎｔｉｓｌ：２０：ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ４０ｍｉｎｒｏｏｍｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ．Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｍｔｅｒｅａｃｈｅｄ９８．４４％ｂｙｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｓ．Ｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｃｏｍｍｏｎｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ，ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃｅｘｔｒａｃｔｉｏｎＷａｓａｔｐｅｒｆｏｒｍｅｄｌｏｗｅｒｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅａｎｄｓｐｅｎｔｌｅｓｓｔｉｍｅ．Ｄｕｅｏｒｔｏｈｉｇｈｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ，ｔａｘｏｌｍａｙｂｅｓｔｅｒｅｏｉｓｏｍｅｒｄｅｇｒａｄｅ，ＳＯｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｍｔｅｂｙＳｏｘｈｌｅｔｅｘｔｒａｃｔｉｏｎＷａｓｌｏｗ，ＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓｏｆｐｕｆｉｆｉｃｍｉｏｎｆｏｒｔａｘｏｌｗｅｒｅｃｏｍｐｌｅｔｅｄｂｙｓｉｌｉｃａｇｅｌｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃｃｏｌｕｍｎａｎｄＡＢ一８ｍａｃｒｏｒｅｔｉｃｕｌａｒｒｅｓｉｎｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃｃｏｌｕｍｎ．Ｆｏｒｔｈｅｓｉｌｉｃａｇｅｌｃｏｌｕｍｎｏｐｅｒａｔｉｎｇｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｗａｓｓｅｌｅｃｔｅｄｂｙｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙｐｒｏｃｅｓｓ，ｓｕｉｔａｂｌｅｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｅｌｕｔｉｏｎｍｔｅａｎｄｄｉａｍｅｔｅｒｏｆｃｏｌｕｍｎ．ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃｐｒｏｃｅｄｕｒｅＷａｓｆｏｌｌｏｗｓ：ｔｈｅｃｏｌｕｍｎｓｉｚｅＷａｓ西２５ｘ４０Ｏｍｍ；ｆｅｅｄ—ｓｔｏｃｋｗｅｉｇｈｔＷａｓｔｈｅｒａｔｉｏｏｆｈｉｇｈｔｔｏＯ．５—０．７５９；ｅｌｕｔｉｏｎｒａｔｅｗａｓ１－１．５ｍＬ／ｍｉｎ．ｔｈｅｅｌｕｔｉｎｇｒｅａｇｅｎｔＷａｓ３ＢＶＩ＇ｄＤＩＳＳＥＲＴＡＴＩＯＮＦＯＲＭＡＳＴＥＲ’ＳＤＥＧＲＥＥＡＢＳＴＲＡＣＴｔｒｉｃｈｌｏｒｏｍｅｔｈａｎｅａｎｄ３ＢＶ３％ｍｅｔｈａｎｏｌｔｒｉｃｈｌｏｒｏｍｅｔｈａｎｅｓｏｌｕｔｉｏｎｓ．Ｔｈｅｐｕｒｉｔｙｏｆｔａｘｏｌｒｅａｃｈｅｄ５．８２％ｗｉｔｈｔｈｅｒｅｃｏｖｅｒｙｏｆ９８．７８％ａｆｔｅｒｔｈｅｓｉｌｉｃａｇｅｌｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃｓｔｅｐ．ＦｏｒｏｎｅｔｈｅＡＢ一８ｍａｃｒｏｒｅｔｉｃｕｌａｒｒｅｓｉｎｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙｐｒｏｃｅｓｓ，ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃｐｒｏｃｅｄｕｒｅ０ｒａｍ；ｅｌｕｔｉｏｎｅｔｈａｎｏｌ。３ＢＶｒａｔｅｗａｓ１．５ｗａｓｆｏｌｌｏｗｓ：ｔｈｅｃｏｌｕｍｎｓｉｚｅｗａｓ西２５ｘ４０ｍＬ／ｍｉｎ：ｔｈｅｅｌｕｔｉｎｇｒｅａｇｅｎｔＷａｓ３ＢＶ３０％３ＢＶ５０％ｅｔｈａｎｏｌａｎｄ７０％ｅｔｈａｎ０１．１１１ｅｐｕｒｉｔｙｏｆｔａｘｏｌｏｎｅｒｅａｃｈｅｄ３．２５％ｆｒｏｍ０．２０％ｗｉｔｈｔｈｅｒｅｃｏｖｅｒｙｏｆ９９．３６％ａｆｔｅｒｔｈｅＡＢ一８ｍａｃｒｏｒｅｔｉｃｕｌａｒｒｅｓｉｎｔｈｅｓｅｃｏｎｄｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃｓｔｅｐ．Ｔｈｅｅｌｕｔｉｎｇｒｅａｇｅｎｔｉｎ３ＢＶ６０％ｅｔｈａｎｏｌｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃｐｒｏｃｅｄｕｒｅＷａｓａｎｄ３ＢＶ７０％ｅｔｈａｎ０１．Ａｆｔｅｒｔｈｅｓｅｃｏｎｄｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃｒｅａｃｈｅｄ１８．４３％ｆｒｏｍｓｔｅｐ．ｎｅｐｕｒｉｔｙｏｆｔａｘｏｌ３．２５％ｗｉｔｈｔｈｅｒｅｃｏｖｅｒｙｏｆ９６．４６％．Ｗａｓｕｓｅｄｔｏｄｅｔｅｒｍｉｎｅａｎｄａｎａｌｙｚｅｔｈｅａｍｏｕｎｔ２２７ｎｍ．ｆｌｏｗＲｅｖｅｒｓｅｄｐｈａｓｅＨＰＬＣｏｆｔａｘ０１．ＴｈｅａｎａｌｙｓｉｓｃｏｎｄｉｔｉｏｎｏｆｔａＸＯｌＷａｓａｓｆｏＵｏｗｓ：Ｃ１８ｃｏｌｕｍｎ，ｍｅｔｈａｎｏｌ：ｗａｔｅｒ（６５：３５ｖ／ｖ）ａｓｍｏｂｉｌｅｐｈａｓｅ，Ｕｖｄｅｔｅｃｔｏｒｒａｔｅａｔｉｓ０．７ｍＬ／ｍｉｎ．硼１ｅｅｘｔｅｒｎａｌｓｔａｎｄａｒｄｍｅｔｈｏｄＷａｓｅｍｐｌｏｙｅｄｆｏｒｔｈａｔｔｈｅｔａｘｏｌａｎｄｑｕａｌｉｔａｔｉｖｅａｎａｌｙｓｉｓ．ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｈｏｗｓｃｏｎｔｅｎｔｉｎＴａｘｕｓｍｅｄｉａｉｓ０．０１２６％ａｎｄＲＳＤｉｓ１．４６％．ｑｕａｒｌｉｔａｔｉｖｅＫｅｙｗｏｒｄ：ｔａｘｏｌ；Ｔａｘｕｓｍａｄｉａ；ＨＰＬＣ；ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ；ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙⅣ原创性声明本人声明，现所呈交的硕士学位论文是在导师指导下进行的研究工作波所取得的研究成果。尽我所知，除了论文中特别加以标注和致谢的地方外，论文不包括其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中南大学或其它单位的学位或证书而使用过的材料。与我共同工作的同志对本研究所作的贡献均已在论文中作了明确的说明。作者签名：王众垌《日期：２００７莎月２日关于学位论文使用授权说明本人了解中南大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留学位论文，允许学位论文被查阅和借阅；学校可以公布学位论文的全部或部分内容，可以复印、缩印或其它手段保存学位论文；学校可根据国家或湖南省有关部门规定送交学位论文。作者魏互幺喇导师虢够劬舭啷年厂月硕士学位论文第一章文献综述第一章文献综述紫杉醇是具有独特抗癌机制的天然产物，属有丝分裂抑制剂，能诱导和促进微管蛋白聚合，从而阻止肿瘤细胞繁殖。１９９２年美国ＦＤＡ批准紫杉醇用于治疗卵巢癌和乳腺癌，目前紫杉醇已在美国、英国、荷兰等四十多个国家上市。紫杉醇被誉为“今日抗癌之星”，是近几年天然抗癌药物领域中的研究热点之一。美国ＮｃＩ预测，在今后１０～１５年紫杉醇将成为主要的抗癌药物。就目前临床供药而言，紫杉醇的主要来源仍为天然红豆杉属植物。由于紫杉醇在该属植物的树皮中含量极低，现有资料表明，短叶红豆杉树皮中紫杉烷类化合物的含量最高，但也仅为０．００３％－０．０６９％。由于紫杉醇在树皮中的含量低，所以用自然来源方式来获取临床所需的紫杉醇，将给红豆杉属植物带来极大的威胁。相比而言，本文研究的曼地亚红豆杉具有无与伦比的优势。曼地亚红豆杉（Ｔａｘｕｓｍａｄｉａ）是红豆杉科红豆杉属常绿针叶灌木植物，是一种天然杂交品种，其母本为东北红豆杉（Ｔ．ｃｕｓｐｉｄａｔａｓｉｅｂ．ｏｒＺｕｃｃ．），父本为欧洲红豆杉（Ｔ．ｂａｃｃａｔａＬ．）。由于其生长速度快，和５年生的曼地亚红豆杉树皮、枝叶中紫杉醇含量高于７０～８０年天然红豆杉树皮的紫杉醇含量；曼地亚红豆杉植株利用率高，全株均含紫杉醇，都可参与提炼紫杉醇；另外具有生物量大、适应能力强、生物特性稳定等特点。曼地亚红豆杉已被美国ＦＡＤ批准用于提取“紫杉醇”首选的红豆杉品种之一。如今国内大量引种该物种，而以前的提取工艺大部分是针对各种天然红豆杉树皮中紫杉醇的提取，而从曼地亚红豆杉枝叶中提取具有独特的困难，并不能简单的套用以前的工艺。本文正是针对从曼地亚红豆杉枝叶中提取紫杉醇的工艺进行研究，如能开发出适合的工艺是很有意义的，不仅能产生巨大的经济效益，而且能改善天然红豆杉的濒危处境，具有影响深远的生物学意义。１．１紫杉醇概况紫杉醇（Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ，商品名为Ｔａｘ０１）是从红豆杉属（Ｔａｘｕｓｓｐｐ）植物中分离出来的一种三环二萜化合物。紫杉醇的系统名为５ｐ，２０－环氧－１’２ａ＇４，７１３，１０１３，１３ｄ六羟基紫杉烷．１１．烯．９．酮－４，ｌＯ．二乙醇酯．２．苯甲酸酯．１３．【（２’Ｋ３’Ｓ）．Ｎ－苯甲酰－３’．苯基异丝氨酸酯】。分子式为Ｃ４７Ｈ５１ＮＯｌ４，分子量为８５３．９３，元素百分比为Ｃ：６６．１１，Ｏ：２６．２３，Ｈ：６．０２为外观白色结晶或无定型粉末，熔点２１３～２１６℃（分解），【ａ】２０１）－４９。（甲醇），易溶于乙醇、甲醇、丙酮、氯仿等有机溶剂，而不溶于水、石油醚，正己烷等溶剂【１１，在水中溶解度很小，几乎不溶解；紫杉醇热稳定性低，有文献报道【２】，其热分解温度为２３４．５℃。其结构式如图１－１所示。硕士学位论文第一章文献综述早在上世纪６０年代初期，Ｗａｎｉ等发现太平洋短叶红豆杉（Ｔａｘｕｓｂｒｅｖｉｆｏｌｉａ）树皮的提取物在ＫＢ细胞株的实验中显示很强的活性；１９６２年美国农业部（ｕｓＤＡ）、美国国家癌症研究所（ＮｃＩ）开始收集紫杉醇；１９６６年，紫杉醇被分离纯化，即从１２ｋｇ树皮中历时两年分离出０．５９紫杉醇；１９７１年Ｗａｎｉ和他的合作者们首先阐明了紫杉醇的结构式以及它可能具有的抗肿瘤活性【３】。由于紫杉醇的来源有限，且溶解度极低，在随后的ｌＯ年间，对紫杉醇的研究几乎完全停顿。直到１９７９年［４１，发现紫杉醇能促进微管蛋白聚合成稳定的微管并能最终导致细胞死亡后，紫杉醇的研究才又成为药物化学界的研究热点。１９７８～１９８２年间，美国对紫杉醇进行了大量的临床研究，随后的Ｉ、Ⅱ、Ⅲ期的临床试验相继获得成功，并于１９９２年１２月被美国食品与药物管理局（ＦＡＤ）批准作为抗晚期癌症的新药上市，由此引发了全球范围内紫杉醇研究的热潮。目前，对于紫杉醇的研究涉及生物学、化学及工程学等多方面内容，科学家们在这些领域付出了艰苦的努力，也取得了相当的成就，创造了巨大的经济效益和社会效益。然而，仍有许多尚未解决的问题困扰着紫杉醇研究者们，这些问题主要集中在紫杉醇的水溶性制剂，紫杉醇抗癌作用的详细机理，紫杉醇的高效提纯技术以及如何提高细胞培养过程中紫杉醇的合成量等。紫杉醇是继阿霉素和顺铂后的热点抗癌新药，由美国国家癌症研究所（ＮｃＩ）和美国ＢＭＳ公司共同研制开发成功。紫杉醇具有促进微管双聚体装配成微管，使微管稳定，从而阻碍细胞分裂，抑制肿瘤生长的作用，这只是紫杉醇可能的抗癌机制之一一微管动力学稳定机制，各种研究证据表明紫杉醇及其类似化合物的作用机制是十分复杂的【”。由于紫杉醇独特而复杂的抗癌机制、且抗癌作用效果显著，相继被证明对卵巢癌、子宫癌、乳腺癌等十几种癌症具有很好的疗效［６－８１，目前已作为乳腺癌、卵巢癌和非小细胞肺癌的临床一线用药。另外紫杉醇的需求量逐年剧增。据国外最新公布的资料统计，２０００年世界紫杉醇原料药市场总销售额为１．４７亿美元，紫杉醇制剂市场约为１３—１４亿美元，其中美国大约消耗掉９０％．－９５％的紫杉醇原料药。就数量而言，２０００年全球紫杉醇原料药总产量约为３７０ｋｇ，且２硕士学位论文第一章文献综述基本上当年产量全部消耗掉（无库存产品）。由于目前国际市场对紫杉醇原料需求坚挺，预计到２００７年，紫杉醇原料药的销售量将在现有基础上翻一番，达７００ｋｇ以上，届时紫杉醇原料药市场总销售额将达２亿美元左右。１．２红豆杉概况红豆杉（俗称紫杉，ｙｅｗ）按植物学分类属于植物亚门、松杉纲、红豆杉目（Ｔａｘａｌｅｓ）、红豆杉科（Ｔａｘａｃｅａｅ＆ＦＧ喧力中红豆杉属下的红豆杉（Ｔａｘｙｓ．Ｌ．），属常绿针叶乔木，成才需５０～２５０年以上，其胸径可达ｌｍ，是第四纪冰川后遗留下的世界濒危物种。红豆杉科共有５属２３种植物，我国有４属（红豆杉属，自豆杉属，穗花杉属，榧树属）１２种和１个变种。从现有资料来看，发现含有紫杉醇类化合物的植物都属于红豆杉属。此属植物世界上共有１１种，其中我国有４种和１个变种，分别为西藏红豆杉（Ｔａｘｕｓｗａｌｌｉｃｈｉａｎａ）、云南红豆杉（Ｔ．ｙｕｎｎａｎｅｎｓｉｓ）、中国红豆杉（Ｚｃｈｉｎｅｎｓｉｓ）、东北红豆杉（Ｔ．ｃｕｓｐｉｄａｔａ）和南方红豆杉（Ｚｃｈｉｎｅｎｓｉａ，ｖａｒ．ｍａｉｒｅＯ。紫杉醇类化合物主要存在部位为树皮、树叶、根和种子，而且紫杉烷类化合物的含量也会受诸多因素的影响【９】，如植物的部位、生长环境、贮藏加工方法等。通过对包括太平洋短叶红豆杉在内的几种红豆杉中紫杉醇含量的测定，结果表明树皮中含量最高，根次之，此外还发现短叶红豆杉针叶中紫杉醇、巴卡亭Ⅲ和三尖杉磷碱等紫杉烷类化合物的含量由茎基部向枝端递减。Ｋｅｉｓｅｙ等【Ｉｏｌ则发现树荫处的树皮中紫杉醇和三尖杉磷碱的含量比暴露在阳光下的高。根据现有的资料表明，短叶红豆杉树皮中紫杉烷类化合物的含量最高，但也仅为Ｏ．００３％－０．０６９％。由于紫杉醇在树皮中的含量低，所以用自然来源方式来获取临床所需的紫杉醇，将给红豆杉属植物带来极大的威胁。目前太平洋紫杉等几种红豆杉属植物已经被列为濒危树种。因此，研究紫杉烷类化合物其他来源倍受重视。曼地亚红豆杉（Ｔａｘｕｓｍａｄｉａ）Ｉ儿一２１是红豆杉科红豆杉属常绿针叶灌木植物，是一种天然杂交品种，其母本为东北红豆杉（Ｚｃｕｓｐｉｄａｔａｓｉｅｂ．ｅｒＺｕｃｃ．），父本为欧洲红豆杉（Ｔ．ｂａｃｃａｔａ厶）。在美国生长发现已有８０年历史，其生长速度快，生物量大。曼地亚红豆杉经过栽培选育已发展到ｌＯ多个品系，其中，Ｔａｘｕｓ相比，曼地亚红豆杉已成为我国最有发展前景的栽培树种之一，这是因为：（１）红豆杉生长速度快。４—５年生的曼地亚红豆杉树皮、枝叶中紫杉醇含量高于７０＂－－８０年天然红豆杉树皮的紫杉醇含量。国内、外野生红豆杉紫杉醇含量为０．００４０／ｒ－０．Ｏｌ％，而美国曼地亚红豆杉的紫杉醇含量为Ｏ。０１７％！”】￣Ｏ．０４６％ＩＩ卅。（２）曼地亚红豆杉植株利用率高。曼地亚红豆杉全株均含紫杉醇，枝叶含量还在Ｏ．０３％以上，根系部分可达Ｏ．０６％，最高达０．０９６％，全株都可提取炼紫杉醇，而ｍａｄｉａ是美国ＦＡＤ批准用于提取“紫杉醇”首选的红豆杉品种之一。与其他天然红豆杉硕士学位论文第一章文献综述天然红豆杉的紫杉醇主要分布在树皮中，整株利用率低。（３）曼地亚红豆杉适应能力强。其主根不明显，侧根发达，枝叶茂盛，萌发力强，能耐－３ｔｒＣ低温，在全国大部分地区均可栽植。（４）我国已成功引种曼地亚红豆杉，且生物特性稳定，紫杉醇含量接近原产地，部分样品含量还高于原产地。曼地亚红豆杉自然形态优美，它终年常绿、树形优雅，春季幼芽鲜绿、秋季红豆满枝，是天然林保护工程，退耕还林工程等国家重点生态建设工程的首选树种之一。综上所述，曼地亚红豆杉是目前紫杉醇的最佳来源。１．３紫杉醇的来源目前，紫杉醇的来源主要有以下几种：（１）天然红豆杉植物提取；（２）人工栽培；（３）半合成；（４）全合成；（５）生物合成；（６）真菌发酵（７）植物组织细胞培养。下面对它们分别进行简单介绍。１．３．１天然红豆杉植物提取紫杉醇最直接来源是红豆杉属植物，具体介绍见于２．２。由于这些植物数量极少，种群密度小，自身繁殖度低，生长缓慢，且紫杉醇在这些植物树皮中的含量又极低，每千克树皮最多只能得到５０－－１５０ｒａｇ的纯紫杉醇，生产１克紫杉醇需砍伐３ｑ棵６０年树龄的大树，正是由于这一原因，从紫杉醇发现到１９８９年，ＮＣＩ仅生产了不到３公斤的产品１１５１。在这种情况下，要获得足够的紫杉醇用于临床研究和基础研究，单纯靠从天然植物树皮中提取紫杉醇必将给红豆杉属植物的在自然界的长期留存带来极大的危险。但由于从树皮中提取紫杉醇的工艺已经成熟且已经工业化，因此，人们利用人工栽培的方法来解决天然资源不足的问题。１．３．２人工栽培Ｃｏｅｉａｎｃｉｃｈ“”发现在Ｔ．Ｍｅｄｉａ“Ｈｉｃｋｓｉｉ”和Ｔ．Ｍｅｄｉａ“Ｈｉｌｌ”的根中紫杉醇的含量高达０．０８％４）．１５％，至少是其他种属红豆杉属植物的４倍；同时，巴卡亭Ⅲ和１０．去乙酰巴卡亭Ⅲ的含量分别为０．０２％－４）．０６％和０．０３～０．０８％（这两种物质可以作为半合成紫杉醇的原料）。这个树种正是我们现在所说的曼地亚红豆杉。从工业上讲，这些植物可通过大田种植，三年收割，从而为紫杉醇提供一个相对稳定和长期的来源。美国ＢＭＳ公司于１９９１年种植了４００万株，以后每年种植１０００万株。我国云南农科院高原经济植物所繁育了５万株，成活率达９４．３％，湖南绥４硕士学位论文第一章文献综述宁县农业局繁殖幼苗３０００多株，现已移栽大田，黑龙江中医学院人工育苗也获成功。人工植物栽培的成功，为紫杉醇的获取开辟了广阔的前景。１．３．３半合成半合成法指的是将红豆杉属植物中所含的紫杉醇类似物经过某些化学反应，将其转化为紫杉醇。由于巴卡亭Ⅲ和１０．去乙酰巴卡亭Ⅲ在植物中的含量相对较高，因而半合成的研究工作主要集中在对这两种物质的研究上。Ｍａｎｇａｔａｌｔｌ７】等人采用的第一个方法研究结果不理想，他们选择的反应路线立体选择性和区域选择性都较差，但他们意外地从合成产物中发现了生物活性优于紫杉醇的紫杉醇衍生物Ｔａｘｉｔｅｒｅ，其活性是紫杉醇的２．７倍，且通过化学修饰可以增强其亲水性，消除剂量限制表面活性剂，并可降低过敏性。他们的第二个方法获得了较大的成功，最终紫杉醇的总产率达到了３８％【１８１。利用取代的Ｂ内酰胺与相应的Ｂａｃｃａｔｉｎ衍生物缩合，可以以很高的产率得到紫杉醇。此外，Ｃｏｍｍｅｒｃｏｎ等人的合成方法也获得了较大的成功。半合成法可以更大限度地利用植物资源，但仍不能从根本上解决植物资源的匮乏问题。１．３．４全合成巨大的社会效益、经济效益和极为重要的学术价值吸引了全球范围内的卯多个一流的研究小组从事紫杉醇的全合成工作。１９９４年初，Ｈｏｌｔｏ［１９～２０］和Ｎｉｃｏｌａｏｕｌ２ｌ埘】几乎同时宣告紫杉醇的全合成获得成功。二者的全合成工作完成的十分出色，但合成路线均太长，且中间步骤的收率又相差很大，导致紫杉醇的最终收率均很低。Ｈｏｌｔｏｎ的方法紫杉醇总收率达到了２．７％，Ｎｉｃｏｌａｏｕ的合成路线虽具有较前者简明的优点，但其总收率却远远低于前者，仅为０．０７％左右。因而目前来看，紫杉醇的化学全合成还仅具有研究意义，缺少商业价值。１．３．５生物合成研究紫杉醇在天然红豆杉属植物中的生物合成路线及条件，对于未来紫杉醇的生产具有重要意义。因为一旦这两个问题得以解决，人们就可以通过添加紫杉醇的生物合成前体来增加其产量。Ｆｌｏｓｓ等人【５】通过紫杉醇侧链生物合成前体的同位素实验，证明苯丙氨酸是紫杉醇侧链生物合成的前体；另外，乙酸酯和马来酸酯在某些红豆杉属植物中也显示为紫杉醇的生物合成前体。目前对紫杉醇母核生物合成途径的研究进展不大。弄清紫杉醇的生物合成途径，还可以通过对参与紫杉醇生物合成关键酶的基因密码研究来增加紫杉醇的产量。了解紫杉醇的生物合成途径，对于增加紫杉醇硕士学位论文第一章文献综述在植物细胞中的产量和利用突变手段来改变关键基因以增强其衍生物酶的效率均具有重要意义。目前这一领域的首要问题是：必须确定紫杉醇生物合成途径中的速度限制步骤，并利用基因技术来增加它们的速率。１．３．６真菌发酵Ｓｔｒｏｂｅｌ等嘲人发现，寄生于某种红豆杉上的真菌能产生紫杉醇，尽管其产率很低，仅２４～５０ｘ１０。９９／Ｌ，但由于真菌的基因操作比植物容易得多，因而，有可能通过传统的方法和基因工程的方法来增加紫杉醇在真菌中的产量。另据报道㈣，我国西安一枝刘制药公司的研究人员从中国红豆杉树皮中分离出一种真菌，使其重组诱变，通过菌种优化培养，紫杉醇和巴卡亭Ⅲ在培养液中的浓度均达到２ｘ１０。ＵＬ，有望实现产业化。１．３．７植物组织细胞培养利用植物细胞来生产紫杉醇是目前紫杉醇研究的另一热点。国内外学者对此均做了大量的工作，取得了丰硕的成果［２８－３ｎ。１９８９年美国农业部首先发现了红豆杉的植物细胞能够产生紫杉醇并获得了专利［３２１。美国的ＰｈｙｔｏｎＣａｔａｌｙｔｉｃ公司取得此专利后，通过多种优化手段使每升发酵液中可产生ｌ－３ｍｇ的紫杉醇。该公司１９９１年宣称该方法可在２￣５年内实现商业化。该公司的Ｓｍｉｔｈ等人通过分析许多种属的红豆杉愈伤组织中紫杉醇的含量后，发现我国出产的红豆杉（Ｔ．Ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ）培养出的愈伤组织中紫杉醇的含量远远高于其他国家出产的红豆杉所培养出的愈伤组织中的紫杉醇的含量。ＰｈｙｔｏｎＣａ组ｉｙｆｉｃ公司利用Ｔ．Ｃｔａｎｅｎｓｉｓ组织细胞培养，最终使得紫杉醇的含量达到了０．０９８％。日本一个研究小组也宣称他们用Ｔ．Ｂｒｅｖｉｆｏｌｉａ的愈伤组织得到了Ｏ．０５％的紫杉醇。ＦｅｔｔＮｅｔｏ的研究小组详细研究了Ｔ．Ｃｕｓｐｉｄａｔａ的组织细胞代谢、生长和紫杉醇的产生情况，取得了较为系统的实验数据。目前对于组织细胞培养的一些工艺条件，如外植体、光照、会养基组成等因素对细胞培养及紫杉醇生产的影响已基本探清，正在研究反应器的放大技术和新的技术生长点，可望实现由红豆杉细胞培养生产紫杉醇。据报道，美国有关公司已具备生产４ｔ紫杉醇的技术，现正在进行２０ｔ规模的工业放大研究。１．４紫杉醇的分离提取研究现状虽然现在开发了多种紫杉醇的制备方法，利用半合成、全合成、生物合成、真菌发酵、植物组织细胞培养等技术手段获得紫杉醇的研究工作也取得了较大的进展，但是要实现这些技术的工艺扩大和工业放大生产还存在一些问题，而从树６硕士学位论文第一章文献综述皮中提取紫杉醇的工艺已经成熟且工业化，因此目前从植物中直接提取分离仍是紫杉醇的主要制备方法。另外现在人工栽培曼地亚红豆杉可以提供足够的原料，经济效益又好，这能缓解天然红豆杉濒临灭绝的趋势，所以在今后很长一段时间内这种方法仍占上风。但从植物中提取紫杉醇的工作十分复杂，难度很大，生产工艺上也存在很多问题，国内外学者围绕着紫杉醇的提取分离开展了大量卓有成效的工作，一些现代新型的分离技术也开始进入这一领域。以下简介紫杉醇提取分离的主要困难和一些工艺技术。１．４．１紫杉醇分离提取工作面临的困难从红豆杉属植物树皮、枝叶中提取分离紫杉醇的方法和工艺的研究属于天然产物化学的范畴。作为一种天然产物，紫杉醇的分离提取纯化面临着许多困难，具体表现在以下几个方面：１）紫杉醇在原料中含量极低紫杉醇无论是在红豆杉属植株体内还是在细胞培养物种的含量都很低。目前，紫杉醇含量最高的曼地亚红豆杉中也只达到Ｏ．０１７％ｔ１３ＬＯ．０４６％ｔ１４１。２）紫杉醇类似物很多紫杉醇类似物是在自然界中存在的或在细胞培养过程中诱导产生的结构、性质比较详尽的紫杉烷类化合物。几种常见的有三尖杉磷碱（ｃｅｐｈａｌｏｍａｎｎｉｎｅ）、巴卡亭ＨＩ（ｂａｃｃａｔｉｎＨＩ）、１０－去乙酰基紫杉醇（１０－ｄｅａｃｅｔｙｌｔａｘ０１）、７－表．紫杉醇（７－ｅｐｉ－ｔａｘ０１）等，由于结构与性质比较相近，使得紫杉醇与其他类似物的分离十分困难，这也是研究者们面临的一个重要难题。３）紫杉酵在分离过程中容易转化紫杉醇作为一种生物大分子物质，受温度、有机溶剂、酸、碱等环境条件的影响，易降解或异构生成其他紫杉烷类物质，如紫杉醇在强酸性或弱碱性环境条件下会降解为巴卡亭Ⅲ或发生表位异构生成７．表．紫杉醇；温度较高时也会发生降解反应，生成相应的小分子物质。４）植株内部分紫杉醇以结合态存在研究表明［３３１，紫杉醇除了以游离态存在于植物体中外，还常常以结合态存在，即形成紫杉醇键合物如７．木糖紫杉醇、７－木糖基．１０．去乙酰紫杉醇等。因为糖基是水溶性的，这些紫杉醇键合物是水溶性的，不溶于脂，而紫杉醇在水中溶解度很低，属于脂溶性物质，所以结合态紫杉醇在分离过程中一般会有损失。５）实际应用对紫杉醇的纯度要求较高紫杉醇是一种药品，所以在使用时对其纯度要求更高，一般要大于９８．５％。另外，就本课题中从曼地亚红豆杉枝叶中提取分离紫杉醇有着特有的困难：７硕士学位论文第一章文献综述枝叶中色素、蜡质、鞣质酸等含量比树皮中要高，杂质处理更加困难；人们推测紫杉醇键合物可能是紫杉醇在植物体内运输的一种特殊形式【３３１，一般认为紫杉醇的合成部位是嫩芽、枝叶或根、茎等，而储存部位是树皮，所以以一般方法从曼地亚红豆杉整株中提取紫杉醇将会损失更多的结合态紫杉醇。１．４．２紫杉醇的提取分离工艺概述紫杉醇的提取分离工艺开展较早，最早的分离工艺１３４］是１９６６年采用４００根试管的逆流分配色谱法，从１２ｋｇ太平洋短叶红豆杉树皮中提取了０．５９紫杉醇，共历时两年，这种工艺十分繁琐，收率极低。随着紫杉醇科学技术的不断进展，提取分离工艺也获得了很大的改进，收率大为提高，分离时间大大缩短，一般说来，紫杉醇的分离工艺可以分为初提和纯化两个阶段，具体过程可用下图（图１－２）表示：红豆杉枝叶、树皮、树枝的采集Ｉ原料的干燥及粉碎ｌ初级萃取１次级萃取水相（含键合相紫杉醇）有机相Ｉ色谱纯化ｌ纯品紫杉醇囤卜２紫杉醇提取分离工艺１．４．３紫杉醇初提工艺紫杉醇的提取过程可分为粗提阶段和分离纯化阶段。初提阶段的目的在于从原料液中尽可能多的提取目标产物，所得到的物料再进行后续的提纯直至获得纯品。硕士学位论文第一章文献综述粗提过程中初级萃取和次级萃取所采用的溶剂不同。目前用于提取紫杉醇的最普通的初级萃取剂是甲醇和水，Ｘｕ和Ｌｉｕｔ３５】采用的是９５：５的甲醇和二氯甲烷的混合物，萃取时间为３５－－６０分钟；而Ｈｏｋｅｌ３６１和Ｐｏｗｅｌｌｌ３７】都选择的是纯甲醇，所需萃取时间则为１６－－４８小时。在大多数情况下还需对甲醇初级萃取物进行次级萃取。一般是在初级萃取物中加入二氯甲烷和水的混合物，即液液萃取。因为该方法可以有效的除去萃取液中５００，６（质量比）的非紫杉烷类物质。Ｃａｒｄｅｌｌｉｎａ［３８】曾采用了一个较为复杂的分离系统，包括正己烷和氯仿之间的分相以及后来乙酸乙酯和水的分相，他发现所有的紫杉醇都在氯仿相中。次级萃取除了可采用各种有机溶剂进行液液萃取外，还可以采用固相萃取法和超临界流体萃取法。固相萃取法能节省提取时间，而超临界流体萃取法则提取效率较高，后续处理简单。这两种方法的共同特点是有机溶剂用量少，减少了环境污染。如果用红豆杉植物体的枝叶作为紫杉醇的来源，由于枝叶特别是叶片中含有许多色素和蜡质，无疑将大大增加紫杉醇提取分离的难度。这要求首先在甲醇粗提物中加入低极性溶剂如正己烷以除去此类物质。研究发现【３９ｌ该法可除去红豆杉枝叶中多达７２％的可溶于正己烷的杂质。（１）液液萃取液液萃取法是最常用的紫杉醇的粗提方法［４０－４５１。粗提阶段又可分为初级萃取和次级萃取。在这两级萃取过程中，溶剂的选择对于粗提产物的质量和过程经济性具有重要影响。初级萃取和次级萃取一般采用的溶剂系统不同。各个时期的研究者对这两个过程的溶剂系统地研究结果已有详细的总结１４２】。目前从植物中提取紫杉醇常用甲醇、乙醇、甲醇．二氯甲烷（１：１）等有机溶剂浸提。最近，日本学者对紫杉醇提取的种类进行了详细地研究［４３１，其结果表明：在乙酸乙酯、乙醚、乙腈、丙酮、甲酵、己烷、异丙酮、乙酸乙酯．甲醇、乙酸乙酯．二氯甲烷、乙酸乙酯一丙酮、乙酸乙酯．乙醚等溶剂中，以乙酸乙酯．丙酮（１：１）混合溶剂提取的效果最好，所得浸膏仅为植物干重的７．７００，６，紫杉醇的含量高达浸膏的０．０８４％，而用甲醇提取所得浸膏为植物干重的２０．９８％，紫杉醇的含量为浸膏的０．０２７％，尚需多次抽提才能得到紫杉醇含量较高的浸膏。现在看来利用乙酸乙酯．丙酮（１：１）一次便可以是紫杉醇提出量高于以往常用溶剂所能得到的量，这就为提取后的分离及纯化工作带来很大的方便，由于乙酸乙酯．丙酮（１：１）的价格和甲醇的价格相当，且可回收再利用，因此，这一提取方法的经济性较为合理。另外，值得指出的是，在初级萃取过程中引入超声技术，可以大大缩短初级９硕士学位论文第一章文献综述萃取过程的时间。Ｋａｓｉｔｕ等ｍ】采用甲醇或乙醇作为提取溶剂，在４０℃条件下对红豆杉植物进行提取，所需时间长达２４－４８ｈ。在溶剂系统不变的情况下，采用微波技术，提取时间缩短到１０ｍｉｎ以内；采用超声技术，在２０～３０℃条件下，所需提取时间仅为０．５～ｌｈ。超声或微波技术的引入，除可大大缩短提取时间外，还可以使得提取在低温下进行，从而避免了紫杉醇在高温下转化为其他物质而造成收率降低【４７】。以上研究均是对于原料物质采取了一种粗提方法，而Ａｄｅｌｉｎｅ等人在分离紫杉碱Ｂ，异紫杉碱Ｂ和１０－去乙酰巴卡亭Ⅲ时，对于碱性紫杉烷类物质和中性紫杉烷类物质分别采用了不同的提取方法。对于碱性紫杉烷类物质，首先是将研碎的红豆杉针叶用２踹的氨水浸润，再用二氯甲烷在室温下萃取７天，将萃取液浓缩后用２％的盐酸溶液萃取。水相用２５％的氨水调整至ＤＨ．穆后再用二氯甲烷萃取。将两次得到的二氯甲烷溶液合并后用水清洗并用无水硫酸钠干燥。对于中性紫杉烷类物质，则采用９５％的甲醇作为初级萃取剂，然后再在二氯甲烷和水溶液中进行分相。这些方法都忽视了植物体内存在的紫杉醇键和物，即紫杉醇与糖基结合，由于紫杉醇的糖基化可以使其水溶性大大提高，因此使用以往的萃取、柱层析分离纯化的方法往往损失掉了进入水相的紫杉醇。Ｄｕｒｚａｎ等【４８ｌ使用设法提高了紫杉烷类化合物的量，尽管酶解法的效果很好，但因其成本高，故还是无法被实际生产所采用。Ｃａｒｖｅｒ等利用甲醇浸提短叶红豆杉树皮或叶片，然后将所得的浸提液经过氧化铝柱处理，经过ＨＰＬＣ分析后表明紫杉醇的含量是未经氧化铝柱处理的４．１倍。他们推测当浸提液与氧化铝接触时可产生放热反应，所放出的热量足以使糖基化紫杉醇的糖基脱落下来，这样再以有机溶剂萃取便可使自由态和糖基化的束缚态紫杉醇几乎同时都能得到有效的提取。该法可提高紫杉醇提取分离的产量，简便易行，实用前景很好。最后就以除杂效果来说，吴倩等［４９１对萃取、碱液洗涤、酸碱液沉淀和离子交换树脂四种方法进行了比较，发现在紫杉醇前处理工艺中，碱液洗涤法为最优方法，其过程中没有紫杉醇的损失，而且碱液洗涤法还具有操作方便，溶剂用量低的优点，可用于紫杉醇的大规模生产。（２）固相萃取尽管人们在对红豆杉树植物体或细胞培养物进行粗提时大量使用了液液萃取法，而且技术也相当成熟，固相萃取法作为一种新型萃取方法，与液液萃取相比具有某些独特的优点，如节省时间、降低了有机溶剂用量、选择性和回收率高，该方法主要是出去与紫杉醇极性较大的杂质。１０硕士学位论文第一章文献综述固相萃取法使用的主要设备是滤筒。滤筒的使用从１９７８年就开始了，目前已有部分学者将其用于紫杉烷类物质的分离纯化中。通常的做法是将含有紫杉烷类物质的原料加入滤筒，然后进行梯度洗脱。这种方法在完成液液萃取所能达到的效果的同时还能从一定程度上达到初次色谱分离的效果脚】。所用填料主要有硅胶、氧化铝和Ｃ１３反相硅胶。陈振德等【５ｌ】以红豆杉科榧属植物（Ｔｏｒｒｅｙａ）的假种皮为原料，直接对乙醇提取物进行硅胶柱层析，降低了制备紫杉醇的成本，扩大了其原料的来源，保护了植物资源。Ｍａｔｈｉｎａ提出了用Ｃ１３固相提取法从粗提物中大量分离收集紫杉烷类化合物，并认为同上述的液液分配相比，固相萃取法具有省时间和减少溶剂用量的优点。但是在紫杉醇制备工艺中，液液萃取法和固相萃取法多串联使用。由于植物提取物中杂质含量数万倍于紫杉醇，若用固相萃取法直接处理提取物，将不仅降低紫杉醇的处理量、加重填料的回收负荷、缩短填料的使用寿命，并且，因传质阻力大，固定相对紫杉醇的吸附不彻底，会增大紫杉醇的损失。因此，为了有效地克服固相萃取法的这些缺点，通常的做法是将液液萃取法置于固相萃取法之前。（３）超临界流体萃取超临界流体萃取（ＳＦＥ）技术作为一种分离不易挥发性物质的技术已经日益受到人们的广泛关注。如果加以调控使用超临界流体作为天然产物的萃取剂不会破坏其化学结构，另外由于其减少了含氯有机溶剂的使用，避免了对环境的污染，近年来被逐渐应用于紫杉醇的分离纯化过程中。现在一般采用无毒性的超临界Ｃ０２流体作为溶剂进行紫杉烷类物质的分离。最早将超临界流体用于紫杉酵分离的是Ｊｅｎｎｉｎｇｓ和Ｈｅａｔｏｎ［５２１等人。他们发现使用使用超临界ｃ０２流体作为萃取剂可以从太平洋短叶红豆杉树皮中获得含量为０．００８％的紫杉醇，这与通常报道的０．０１％的产量一致。Ｖａｎｄａｎａ掣５３】利用超临界的Ｎ２０和Ｎ２０／ＥｔＯＨ混合物，对太平洋短叶红豆杉树皮中的紫杉醇也作了提取研究，发现利用超临界的Ｎ２０，以乙醇为助溶剂，可以把树皮中的大部分紫杉醇提取出来，比以乙醇为助溶剂的超临界Ｃ０２流体萃取更加有效。虽然超临界流体萃取技术在紫杉醇的提取中具有收率高、节省时间和有机溶剂等优点，但该方法对仪器设备要求较高，限制了其应用。（４）紫杉醇其他粗提工艺紫杉醇的其他提取方法还有沉淀法［４７１、树脂层析法、膜分离法㈣等。紫杉醇在己烷溶液中能产生沉淀，这个性质可用来提取紫杉醇。Ｐａｎｄｅ等将紫杉醇促提物用醇、丙酮等极性溶剂溶解，通过添加己烷、石油醚或轻汽油等非极性溶剂将紫杉醇沉淀析出，非极性杂质则残留于母液中被除去。Ｆｏｏ等则向醇硕士学位论文第一章文献综述等极性溶剂溶解的醇提物中添加水使紫杉醇沉淀析出。Ｂｕｉ．Ｋｈａｃ等用甲醇溶解紫杉醇浸膏后，向溶液中加入碱性水溶液或酸性水溶液，将紫杉醇等目标无沉淀析出，酸性或碱性杂质则残留于母液中被除去，但是过程中生成的沉淀非常细微，在高速离心条件下也难以回收完全，导致紫杉醇的较大损失。紫杉醇是二萜类化合物，具有多环结构，容易被带苯环的吸附剂特异性吸附，所以，近年聚苯乙烯型树脂被较多的应用到紫杉醇的前处理中，用于出去色素等杂质。元英进等［５４１的研究结果表明，聚苯乙烯型强碱树脂（Ｐｓ－Ａ）及多乙烯多胺．环氧氯丙烷缩聚型弱碱树脂（Ｐｃ．Ａ）对二氯甲烷粗提物的吸附及脱色性能较好，有望用于紫杉醇的纯化分离。另外，各中心新开发的分离技术如膜分离法也被应用到该领域。１９９４年，Ｃａｒｖｅｒ等人采用平板式、中空纤维式和管式膜组件，对超滤膜和反渗透膜在紫杉烷类物质的分离过程中的应用进行了研究，结果表明：采用膜分离方法可以进一步浓缩粗提过程中所的浸膏，是紫杉烷类物质的浓度提高５倍左右，相当于对浸膏又进行了一次预处理，从而减少了后续色谱分离的负担和紫杉醇的损失。Ｒａｙｍｏｎｄ等人用０．２ｐｍ的尼龙膜和聚偏氟乙烯膜（ＰＶＤＦ）处理紫杉醇的组织培养液也发现有分离作用，不过在选择性洗脱紫杉烷类物质效果上并不理想。研究者认为通过对尼龙膜进行化学修饰，将可以实现从紫杉烷类混合物中选择性洗脱紫杉醇的目标。综上所述，对紫杉醇的提取和初分离工艺的研究已取得了长足的进展，一些新的技术和手段不断应用于这一领域，显示出诸多优势和良好前景。但从目前情况来看，初分离工艺中液液萃取一圃相萃取串联技术仍发挥这主要作用。树脂层析法操作简便，生产成本低，也不失为一种良好的紫杉醇前处理方法。１．４．４紫杉醇的纯化工艺（１）柱层析法柱层析是分离紫杉醇和紫杉烷类物质的常用方法之一，具有简单、高效的特点，适用于从组织培养液中分离紫杉醇。比较常用的有硅胶、氧化铝、纤维素、离子交换柱层析等。硅胶柱层析在物质分离领域应用很广泛。一般情况下，紫杉醇在硅胶柱上的保留较强，用ＣＨＣｌ３淋洗时紫杉醇不会被洗脱。用ＣＨＣｌ３和甲醇的混合溶液洗脱可分离出两个峰【５５ｌ。如果在色谱流动相中添加０．０５％水时，分离出的紫杉醇纯度有所提高，分离速度加快，经常压硅胶柱层析可获纯度）１４％，回收率）９８％的紫杉醇。在中压快速硅胶柱层析的条件下ｔ４“，用ＣＨ２Ｃ１２、甲醇梯度洗脱，可使紫杉醇的纯度达到４０％－，．６０％。硕士学位论文第一章文献综述由于苯基反相介质在分离多环化合物方面有独特的作用，因此可用于紫杉醇分离。苯基．硅胶介质以硅胶为基质，ｒ－氨丙基三氧基硅烷（Ａｌ玎Ｓ）为连接臂，通过液相法（分别用三乙胺、吡啶、吗啡啉为催化剂）和气相法合成，采用甲醇．水（６５：３５）为流动相，这样获得了很不错的实验结果。在比较层析介质性能肛３ｌ研究中，通过比较固相萃取、硅胶柱层析、氧化铝柱层析以及制备薄层色谱，可知用氧化铝柱层析能获得４０倍以上的纯化倍数，极性比紫杉醇弱的物质基本被除去，然后通过一步ＣＩｓ固相萃取便可除去极性比紫杉醇稍强的杂志，用氧化铝柱层析初分离工艺不单纯化倍数高，而且其回收率大于１４０％。对氧化铝柱层析中氧化铝的酸碱性等条件的优化选择【３３】结果表明：用碱性氧化铝，流动相中含水Ｏ．０３％、甲醇１．５％，反应时间在３０ｍｉｎ左右，洗脱速度在ｌ～３ｍＬ／ｍｉｎ之间时效果最好，可以使紫杉醇的含量从小于ｌ％提高到大于２７％，紫杉醇的表观回收率大于１７００，４。这说明有其他非游离的紫杉醇转化成了游离的紫杉醇，研究表明通过碱性氧化铝柱层析后，有５０％的７．表．紫杉醇可以转化成游离紫杉醇，使紫杉醇的回收率可达１７０％。（２）色谱法色谱法１２Ｊ尤其是高效液相色谱技术（ＨＰＬＣ，ＨｉｇｈＰｅｒｆｏｒｍａｎｃｅＬｉｑｕｉｄＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）是目前世界上对复杂混合物分离效率最高的方法之一。将ＨＰＬＣ技术应用于紫杉醇的分离提取，具有产品纯度高，产物组分多和操作方便等优点。从现有的提取工艺来看，要获得纯品紫杉醇，都需要经过色谱纯化。早期的色谱纯化紫杉醇工艺是采用多根硅胶层析柱串联的一种操作，因为硅胶对紫杉醇的不可逆吸附造成的损失很大，使得紫杉醇的收率很低，仅为０．００４％左右。近年来，随着色谱技术的进步，不但有新的色谱技术被引入到紫杉醇的分离提取过程中来。除了Ｉ－ＩＰＬＣ（其中包括正相．ＨＰＬＣ，反相．ＨＰＬＣ）外，还有薄层色谱法（ＴＬＣ，ＴｈｉｎＥｌｅｃｔｒｏｋｉｎｅｔｉｃＣｕｒｒｅｎｔＬａｙｅｒＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ），胶束电动色谱（ＭＥＫＣ，ＭｉｃｅｌｌａｒＳｐｅｅｄＣｏｕｎｔｅｒＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ），高速逆流色谱（ＨＳＣＣＣ，ＨｉｇｈＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）等。各种类型的ＨＰＬＣ和ＴＬＣ的共同缺点是：负载量小，不适合日常大量样品的处理，仅能达到半制备规模的水平。为此，Ｗｉｃｋｒｅｍｅｓｉｎ提出对甲醇粗提物通过Ｃｌｓ的反相柱进行浓缩，然后再用Ｃ１８反相制备ＨＰＬＣ进行纯化。Ｍａｔｔｉｎａ等人和Ｇｌｏｕｎｉａｋ等人则提出了用Ｃ１８固相萃取法从粗提物中大量收集浓缩紫杉烷类混合物，结果表明固相萃取法优于薄层色谱法纯化过程，而且具有节省时间和溶剂用量少的优点。ＨＳＣＣＣ是一种基于液液分配原理的新技术，它利用螺旋管的方向性与高速行硕士学位论文第一章文献综述星式运动相结合，产生一种独特的流体动力学现象，使两相溶剂在螺旋管中实现高效的接触、混合、分配和传递。从目前文献报道情况来看，ＨＳＣＣＣ有望成为一种新的大规模制备生产紫杉醇的方法。这种方法的主要优点是：具有较高的样品负载量，奋力周期短，操作简便，由于这种色谱自身无固体载体，避免了分离样品与固体表面产生化学反应而变性和不可逆吸附造成的样品损失。不足之处在于紫杉醇和三尖杉磷碱不能完全分开，约有一半左右的二者混合物需经制备ＨＰＬＣ或ＴＬＣ再次分离，才能得到紫杉醇样品。另外，在ＨＳＣＣＣ种，容积系统的选择对于分离效果影响较大，宜选用两相分层时间短，样品在两相溶剂各个组分中的分配系数差别较大的溶剂系统。胶束电动色谱虽然具有分离效率高、溶剂消耗小、速度快等优点，但其处理量小，操作复杂的缺点限制了它的应用范围，目前只能用于分析检测。（３）化学反应法化学反应法【４８ｌ（ｃｈｅｍｉｃａｌ把ａｃｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄ）是先把不易与紫杉醇分离的物质通过化学反应转化为容易与紫杉醇相分离的物质，然后再经过适当途径加以分离。Ｋｉｎｇｓｔｏｎ等用Ｏｓ０４处理紫杉醇与三尖杉磷碱混合物，Ｏｓ０４能选择性地氧化三尖杉磷碱ｃ－１３侧链末端的双键，使之形成二元醇，而紫杉醇却不受影响。Ｍｕｒｒａｙ等利用含１％一１０％０３的空气氧化三尖杉磷碱、紫杉素（ｔａｘｍｍ）等中的某些烯键，而对紫杉醇、三尖杉磷碱、紫杉素等中的另一种烯键却不起反应，通过硅胶柱层析就可以有效的纯化其中的紫杉醇。从这些结果不难看出，化学反应法免去了过色谱主层析等繁琐手段，分离纯化紫杉醇的效果非常好，有望成为紫杉醇大规模分离纯化的一种理想方法。（４）药理作用靶点法药理作用靶点法（ｐｈａｒｍａｃｏｌｏ百ｃａｌａｃｔｉｖｅｔａｒｇｃｔｐｏｍｔｍｅｔｈｏｄ）是肖剑于１９９９年１２Ｊ首次提出的一种全新的紫杉醇分离纯化方法。药物的作用靶点是指药物在生物体内发生作用时进攻或结合的组织。紫杉醇的药理作用结果表明，紫杉醇的药理作用靶点是体内的微管，微管是微管蛋白的聚合态。微管蛋白的最主要特征是高温下聚合成微管，低温下解聚成微管蛋白。与紫杉醇最难分离的三尖杉磷碱不具有这种特性。通过初步研究，在一定的条件下，紫杉醇与三尖杉磷碱的混合物经药理作用靶点法纯化后，紫杉醇的纯度可达９５％以上。１．５紫杉醇的分析检测方法高效准确的分析检测方法，对于紫杉醇的提纯研究工作是必不可少的。１４硕士学位论文第一章文献综述在紫杉醇的各种提取工艺中，目前的主要分析方法是高效液相色谱法（｝Ⅱ，Ｌｃ）法。对于ＨＰＬＣ分析技术在这一领域中的应用，国内外的分析工作者都进行了广泛的研究，并形成了一种高效、快速、准确的定量分析方法而被紫杉醇的研究者所广泛采用【ｓ㈨】。围绕ＨＰＬＣ在紫杉醇分析中的应用，国内外学者开展的工作涉及柱型、流动相、洗脱方式、检测器等多个方面ｍ‘鲫。一般来说，常用的紫杉醇分析柱有以下几种：Ｃ１３柱、苯基柱和氰基柱，有的研究者和公司还为此开发了紫杉醇的专用柱。常用的流动相为甲醇、水和乙腈，通常为其二者或三者按一定比例配成的混合物。洗脱方式随柱型和样品的不同而采用等度洗脱或梯度洗脱，分析一个样品的时间从２０多分钟到６０分钟不等。检测器一般采用紫外（ＵＶ）检测器，检测波长一般为２２７ｎｍ或２２８ｎｍ，不同时期的研究者略有差异，但目前公认的紫杉醇紫外吸收特征波长为２２７ｎｍ。在ＨＰＬＣ分析中，当被分析的样品中组分较多时，一般需要进行梯度洗脱，才能得到较好的分离效果，但Ｋｅｔｃｈｕｍ［６３］等人采用一种紫杉醇专用柱，在等度洗脱的条件下，使８个紫杉烷类化合物得到了很好的分离，如图２－３所示。呵一●Ｉ■·●图２．３除了ＨＰＬＣ技术外，在紫杉醇的分析中，其他分析方法，如：超临界流体色谱（ＳＦＣ，ＳｕｐｅｒｃｒｉｆｉｃａｌＦｌｕｉｄＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）、胶束电动色谱（ＭＥＫＣ）、双质谱联用技术（ＴＭＳ，ＴａｎｄｅｍＭａｓｓＳｐｅｃ舡ｏｍｅｔｒｙ）和酶标法（ＥＬＩＳＡ，Ｅｎｚｙｍｅ－ＬｉｎｋｅｄＩｍｍｕｎｏＳｏｒｂｃｎｔＡｓｓａｙ）等，在紫杉醇的分析检测中也有应用，其中ＳＦＣ是一种较实用的分析方法。１．６本章小结１）紫杉醇的来源有七种方法：天然红豆杉植物提取、人工栽培、半合成、全合硕士学位论文第一章文献综述成、生物合成、真菌发酵和植物组织细胞培养。目前科研和临床所需紫杉醇主要靠从植物中提取，半合成法可提供少量紫杉醇。２）曼地亚红豆杉是美国ＦＡＤ批准用于提取“紫杉醇”首选的红豆杉品种之一，与其他天然红豆杉相比，曼地亚红豆杉已成为我国最有发展前景的栽培树种之一，这是因为：红豆杉生长速度快，生物量大；曼地亚红豆杉全株均含紫杉醇，植株利用率高；曼地亚红豆杉适应能力强；我国己成功引种曼地亚红豆杉，且生物特性稳定；曼地亚红豆杉自然形态优美，它终年常绿、树形优雅，春季幼芽鲜绿、秋季红豆满枝，是天然林保护工程，退耕还林工程等国家重点生态建设工程的首选树种之一。３）目前紫杉醇的提取纯化工艺有溶剂萃取法、固相萃取法、制备色谱法、膜分离法、超临界萃取法、离子交换法、键合物解离法、药理作用靶点法和化学反应法。这些工艺各有优缺点，其中溶剂萃取法和制备色谱法是最简单、最常用的方法，也已经成功应用于工业生产，但仍需改进。４）紫杉醇研究中采用的分析方法有ＨＰＬＣ法、ＳＦＣ法、ＭＥＫＣ法、ＴＭＳ法和ＥＬＩＳＡ法等，主要的分析监测方法为ＨＰＬＣ法，￥ＦＣ法也是一种高效的分析方法。１６硕士学位论文第二章曼地亚红豆杉枝叶中紫杉醇含量的测定第二章曼地亚红豆杉枝叶中紫杉醇含量的测定红豆杉中不仅紫杉醇含量极低，而且其中紫杉烷类化合物结构相差不大，采用一般的化学分析很难实现其分离分析，目前，ＨＰＬＣ方法是常用的比较有效的方法。本试验对ＨＰＬＣ各色谱条件即测定波长、流动相、流速等进行对比试验，以确定最佳色谱条件，为后续工作打下坚实的基础。然后在最佳色谱条件下进行实验作出紫杉醇标准曲线，并进行日内精确度、重复性、稳定性、加样回收率等方面的分析。２．１实验原理色谱学是现代分离分析的一个重要方法，也是一门新兴学科，近卯年来，色谱学各分支发展迅猛，并广泛地用于许多领域。色谱法是一种分离方法，它利用物质在两相中分配系数的微小差异，当两相作相对移动时，使被测物质在两相之间进行反复多次分配，这样使原来的微小分配差异产生很大的效果，使各组分分离，以达到分离、分析及测定一些物理化学常数的目的。容量因子ｋ是一个重要的色谱热力学参数，其定义为分配平衡条件下固定相中分子个数与流动相中分子个数的比值：ｋ＝姐。／吐＝（ｔ，－ｔｏ）／ｔｏ（２—１）容量因子作为一个描述样品组分保留值的参数，对于特定组分，它还与流动相的组成有关。高效反相液相色谱过程中，容量因子与流动相的关系可用下式表示：Ｉｎｋ＝ａ＋ｂＣＢ（２－２）式３—２中ｃＢ为有机相即强洗脱剂浓度，如甲醇一水流动相中甲醇浓度，ａ，ｂ称作用指数，ａ为通常与柱子种类、特性有关的常数，同时与流动相的种类有密切关系；而ｂ则是与流动相体系有关的常数。对于特定的色谱系统、流动相体系，影响溶质保留值和选择性的参数，在高效液相色谱中主要是流动相的组成，因此通常通过调节强洗脱剂的浓度来改变ｋ值，从而获得较好的峰形及分离度。分离度Ｒ用于描述色谱流出曲线邻近两峰的分离情况；１７硕士学位论文第二章曼地亚红豆杉枝叶中紫杉醇含量的测定Ｒ＿２（ｔｒｌ－ｔｒ２）／（Ｗｖ，Ｉ＋Ｗ憎）（２－３）当Ｒ＞１．５时认为两峰完全分离。在实际色谱操作中，应当优化各种色谱条件，以获得较好的分离度。理论塔板数则为评价柱效的重要参数：ｎ＝１６（ｔ，／ｗ）２＝５．５４５（ｔｒ／ｗ％）２以下介绍ｔｔＰＬＣ色谱条件确定的原则：（１）吸收波长的选择（２—４）紫外吸收检测器是ＨＰＬＣ中用得最早而又最广的检测器之一，具有选择性高、灵敏度高、使用范围广、稳定性好等优点。这种检测器是通过测定物质在流动池中吸收紫外光的大小来确定其含量的。对于单色光，物质在流动池中的吸收服从Ｂｅｅｒ定律：Ａ＝ｌｏｇ（ＩＪＩ）＝￡ＣＬＴ＝Ｉ／Ｉ。（２～５）式中：Ａ＿一消光度；Ｉ。一一入射光强度；Ｉ一一透射光强度；ｅ一一摩尔吸光系数；Ｃ一一溶质浓度；Ｌ——流通池中的光程长度；Ｔ——透过率。从式（３－３）右边可以看出，对于给定的池体积，在固定的波长下，待测物的消光度正比于其浓度。一般都选择对欲分析物有最大吸收波长进行工作，以获得最大的灵敏度和抗干扰能力；测定波长的选择取决于待测物的成分和分子结构。一般通过紫外分光光度计扫描确定最大吸收波长。在选择测定波长时，必须考虑到所使用的流动相组成，因为各种溶剂都有一定的透过波长下限值，超过了这个波长，溶剂的吸收会变得很强，就不能很好的测出待测物质的吸收强度。反相色谱常用试剂甲醇、乙腈的最大吸收波长均为２ｌＯａｍ。（２）流动相的选择在反相色谱中，水是常用的洗脱剂弱组分，Ｃ。是常用的填充载体，重要的是选择洗脱剂的强组分。常用的强组分有甲醇、乙腈和四氢呋喃，甲醇一般可以满１８硕士学位论文第二章曼地亚红豆杉枝叶中紫杉醇含量的测定足要求，反相色谱流动相和添加剂的推荐规则如下：１）含有两个以下氢键作用基团（如—ｃ００Ｈ，—ＮＨ２，—０Ｈ等）的芳香烃邻、对或邻、间位异构体，由于这些基团氢键作用力的差别较大，因此可以选择甲醇／水为洗脱剂。２）含有两个以上Ｃ１，Ｉ，Ｂｒ邻、间、对位异构体或极性取代基的间、对位异构体以及双键位置不同的异构体，可选用苯基或ｃ。。键合固定相、乙腈／水为流动相。３）当分子结构通道中获得溶质的ｋ’值大于３０时，应在反相色谱系统的甲醇／水流动相中加入适量的色散作用力较强的溶剂（如四氢呋喃、氯仿和丙酮），以使被分离溶质的ｋ’保持在适当范围内；同时还可以减少固定相表面键合碳链浓度或缩短碳链长度来获得这一效果。、＼≥ＮＨ或／４）如果样品中含有—ＮＨ２，７，Ｎ一这一类基团，就用在流动相中加入适量添加剂有机胺以抑制氨基或残余硅羟基的相互作用，从而提高样品保留值的重现性和色谱峰的对称性。．＞ＮＨ５）如果样品中含有—Ｃ００Ｈ，—Ｓ０３Ｈ、—Ｈ２Ｐ０４及其酚羟基或—ＮＨ：和／这一类基团，则在流动相中加入适量磷酸盐、乙酸盐或有机胺试剂，以控制这些基团的解离。对于复杂的物质的分离，流动相的选择应该进行一系列的实验来确定。２．２实验仪器与材料表２＿１主要实验药品和原材料简表药品名称甲醇药品规格分析纯分析纯分析纯分析纯生产厂家天津市大茂化学试剂厂天津市大茂化学试剂厂湖南师大化学试剂厂天津市恒兴化学试剂制造有限公司天津市密欧化学试剂开发中心河北省保定化学试剂厂天津市大茂化学试剂厂Ｓｉｇｍａ公司鲫乙醇冰醋酸三氯甲烷环己烷Ｋ，ＣＯ，分析纯分析纯分析纯纯度大于９８％１９ＮａＣｌ紫杉醇标样硕士学位论文第一二章曼地亚红豆杉枝叶中紫杉醇含量的测定曼地亚红豆杉干枝叶湘西本草制药公司ＨＰＬＣ仪ＢＴ８１００ＢＴ８２００ｃ＿Ｒ３ＡＢｉｏｔｒｏｎｉｃ公司Ｂｉｏｔｒｏｎｉｃ公司Ｓｈｉｍａｄｚｕ公司Ｂｉｏｔｒｏｎｉｃ公司咿ＬＣ紫外检测器｝ＩＰＬＪｃ记录仪Ｄｙｎａｍｉｃ混合器ＩｎｔｅｒｔｅｘＣｌＢ，缸２５０ｘ４．６弧ｊ２５０＆４．６０商ｎＮ２０００７５６聃Ｃ天津市琛航科技仪器有限公司美国Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ公司ＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘＰｒｏｄｉｇｙＯＤＳ３双通道色谱工作站紫ＳＦ－可见分光光度计Ｅｘｐｌｏｒｅｒ全自动电子天平旋转蒸发仪浙江大学智达信息工程有限公司上海精密科学仪器有限公司瑞士０ＨＡＭＳ公司Ｒ－２０１上海申科机械研究所郑州长城科工贸有限公司上海申生科技有限公司上海沪超超声波仪器有限公司北京市医疗设备厂湘仪科学仪器设备有限公司江苏望华科教仪器厂循环水式多用真空泵恒温水浴锅超声波清洗器不锈钢电热恒温水浴锅磁力加热搅拌器调速多用振荡器２．３实验方法２．３．１溶液的制备ＳＨＢ—Ｂ９６＾Ｗ２０１ＯＱ－６ＧＳＹ－Ⅱ７８－１ＺＤ－２（１）对照品溶液的制备精密称取紫杉醇对照品５．１ｍｇ，以甲醇溶解并定溶于ｌＯｍｌ容量瓶中．铝４成５１０９ｐＪｍｌ的紫杉醇对照品储备液。分别吸取０．１ｍＬ，０．６ｍＬ，０．８ｍＬ，０．２ｍＬ，０．４ｍＬ，１．ＯＯｍＬ对照品储备液，以甲醇定溶于５ｍｌ容量瓶中，制成浓度分别为１０．２．ｇ／ｍＬ，２０．４ｇｇ／ｍＬ，４０．８ｐ咖Ｌ，６１．２ｐ咖Ｌ，８１．６ｐ咖Ｌ，１０２ｍｌｐ咖Ｌ的标准液，供绘制标准曲线时使用。（２）供试品溶液的制备：精密称取５．００００ｇ曼地亚红豆杉干枝叶粉末，加入１００无水乙醇，冷浸过夜，超声处理４０ｒａｉｎ，静置过滤，滤渣再以ｌＯＯｍｌ无水乙醇超声４０ｒａｉｎ，静置过滤，合并滤液，于４５℃真空浓缩至１８Ｉｎｌ左右，加入２ｍｌ蒸馏水，以５０ｍｌ正己烷萃取，再以２５ｍｌ正己烷萃取两次。乙醇相于４５℃真空浓缩至无醇，浓缩物以５０“氯仿充分溶解，加入５０ｎｌｌｌｍｏｌ／Ｌ碳酸钾溶液（含５％氯化钠）搅拌２０ｒａｉｎ，静置分层，氯仿相再以２５ｍｌ该碳酸钾溶液洗涤两次。氯仿相转移至５０ｍｌ容量瓶，并以氯仿定容，作供试品溶液。硕士学位论文第二章曼地亚红豆杉枝叶中紫杉醇含量的测定２．３．２色谱条件流动相：不同体积浓度的甲醇一水溶液（甲醇：水＝５０：５０，６０：４０，６５：３５，６７．５：３２．５，７０：３０）以及加入了Ｏ．５％体积醋酸的溶液，使用前超声波脱气２０～３０ｍｉｍ流速０．７ｍＬ／ｍｉｎ；检测波长为２２７ｎｍ：柱温（２５４－１）℃。取样品溶液６ｐＬ进样，以保留时间定性，峰面积定量。２．４结果与讨论２．４．１测定波长的选择实验中取标准溶液在７５６ｋ１Ｃ分光光度计上从１９０～４５０ｎｍ进行扫描，得到紫杉醇的最大吸收波长为２２７ｎｍ（如图２－１所示）。所以，在进行ＨＰＬＣ分析时，采用２２７ｎｍ作为测定波长。图２－ｌ紫杉酵的吸光光度曲线２．４．２流动相的选择在原提取液中，所含有的各组分可分为两大部分：一部分是极性较强且保留时间比较短的非紫杉醇烷类化合物：另一部分是极性相对较弱且紫杉醇的结构比较相近的紫杉烷三环二萜类化合物，这两部分因其结构和理化性质相差较大，比较容易分离。但紫杉烷类化合物却难以分离，因此色谱条件的选择是至关重要的。实验中以不同体积浓度的甲醇水溶液和加入Ｏ．５％体积酸的甲醇．水溶液作流动相，进行对比试验，发现采用甲醇．水（６５：３５）为流动相，流速为Ｏ．５ｍＬ／ｍｉｎ时（受分析柱和泵的限制），红豆杉中各组分的分离较好，紫杉醇的峰形较好，分离度可满足色谱分析的要求，如图２．２，２－３所示。２１硕士学位论文第二章曼地亚红豆杉枝叶中紫杉醇含量的测定图２－２以甲醇：水（６５：３５）为流动相，乙醇提取液样品８ＰＬＣ色谱图图２－３以甲醇：水（６５：３５）为流动相，紫杉醇标样ＨＰＬＣ色谱图图２－４以甲醇：水（６０：４０）为流动相，紫杉醇标样ＨＰＬＣ色谱图如果流动相中甲醇浓度低较，会导致出峰时间太长，如图２－４所示紫杉醇标准品出峰时间为８１．２９６ｒａｉｎ，对后续实验以及检测带来很大的麻烦。另外以乙醇提取液进样分析，同样出峰时间很晚，而且各峰并没有充分分离开来，如图２－４，２—５。图２－５甲醇：水（６０：４０）为流动相，紫杉醇标样ＨＰＬＣ色谱图硕士学位论文第二章曼地亚红豆杉枝叶中紫杉醇含量的测定在流动相中加入少量的酸可以减少拖尾现象，但在本实验中可以发现加入了Ｏ．５％的醋酸后，从各谱图可以看出，加入少量的酸不仅没有消除拖尾现象，而且均出现了负吸收峰（如图２－６所示）。图２－６以甲醇：水：酸（７０：３０：ｏ．５）为流动相，紫杉醇标样ＨＰＬＣ色谱图以上实验所用分析柱是ＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘｐｒｏｄｉｇｙＯＤＳ３柱，后面的实验采用了另一根国产分析柱ＩｎｔｅｒｔｅｘＣ。。，５“，所以我们以原来的分析柱所做实验选择的流动相做了～些实验，发现这些条件同样适合于ＩｎｔｅｒｔｅｘＣ。５ｔｔ，且流速可增至０．７ｍＬ／ｍｉｎ，其出峰时间为２４ｍｉｎ左右，与原来的分析柱相比，其出峰时间快，而且分离效果好，拖尾现象不明显．以甲醇．水（６５：３５）为流动相，紫杉醇标样（８１．６ｔｔｇ／ｍＬ）进行ＨＰＬＣ分析得色谱图后进行系统评价，其塔板数为３９２８：以甲醇－水（６５：３５）为流动相，乙醇提取液经初步除杂处理后进行ＨＰＬＣ分析得色谱图后进行系统评价，分离度为１．６５，符合分析条件。２．４．３紫衫醇的定量分析２．４．３．１标准曲线的绘制将２．３．１配制的一系列对照品溶液，定量进样６皿，按２．４．１及２．４．２确定的色谱条件既检测波长２２７ｎｍ、流动相甲醇一水（６５：３５）、流速０．７ｍＬ／ｍｉｎ、Ｉｎｔｅｒｔｅｘｃ１８（２５０Ｘ４．６０ｍｍ，５ｔｔｍ）色谱柱进行分析，测得紫杉醇浓度（“咖１）Ｘ与峰面积（州·ｓ）Ｙ的回归方程为：Ｙ．＝２３２５．８＋４８５３．４Ｘ（Ｒ＝０．９９９３，联《）表明紫杉醇在１０．２－－１０２ｔｔｇ／ｍｌ范围内具有良好的线形关系。标准曲线如图２—７：硕士学位论文第二章曼地亚红豆杉枝叶中紫杉醇含量的测定双重‘－■Ｍ）图２－？标准曲线图２．４．３．２系统适应性试验取浓度为８１．６ｐｇ／ｍＬ标准品溶液进样，以紫杉醇计算理论塔板数为３９２８：样品中，紫杉醇与最近峰的分离度为１．６５。２．４．３．３精密度实验同一天内每隔１ｈ及隔日子同一时间测定浓度为１０．２ｐｇ／ｍｌ，４０．８ｐｇ／ｍｌ，８１。６ｐｇ／ｍｌ的对照品溶液共５次，用标准曲线计算含量。结果：日内相对标准差（ＲｓＤ）＇为：１．７５％、１．２２％、１．３４％；日间相对标准差（ａｓｐ），为：１．８１％、１．１６％、１．４７％。２．４．３．４加标回收率实验精密称取５．００００ｇ曼地亚红豆杉干枝叶粉末６份，分别定量加入紫杉醇对照品，按２．３．１中（２）操作制成样品溶液，测定峰面积，计算加样回收率，结果平均加样回收率为９４．６０％，ＲＳＤ为１．２８％（ｎ－－６）。表２－３加标回收率数据表２．４．３．５供试品溶液的测定供试品溶液经Ｏ．４５１ｘｍ微孔过滤器过滤，按２．２．１项下的色谱条件精密进样６ｐｌ其结果见色谱硕士学位论文图２－８，２－９。第二章曼地亚红豆杉枝叶中紫杉醇含量的测定图２－８紫杉醇标样图２－９样品紫杉醇出峰时间为２４．３３８ｒａｉｎ，对同一批样测定五次，其平均含量为０．０１２６％，船Ｄ为１．４６％２．５本章小结１）通过实验确定了紫杉醇检测色谱条件：测定波长为２２７ｎｍ，流动相为甲醇一水（６５：３５）溶液，流速为０．７ｍＬ／ｍｉｎ；该条件下紫杉醇标准品和紫杉醇样品都能很好的分离，其中样品紫杉醇与最近峰的分离度为１．６５，满足实验中的含量测定要求。进行日内精确度、重复性、稳定性、加样回收率等方面试验表明肿ＬＣ分析手段是一个精确度高、重现性好、稳定可靠的检测方法。２）紫杉醇标准品工作曲线为：ｙ＝２３２５．８＋４８５３．４ｘＲ＝Ｏ．９９９３（ｎ＝６）在上式中，ｙ一紫杉醇的积分峰面积；啪杉醇浓度（单位为肛ｇ／ｍＬ）。硕士学位论文第三章曼地亚红豆杉中紫杉醇的提取和初步除杂第三章曼地亚红豆杉枝叶中紫杉醇的提取和初步除杂药用植物活性成分的提取过程的实质是溶质从植物体内部细胞向溶剂中转移的传质过程，其过程包括以下步骤：溶剂从溶剂主体传递到植物体表面：溶剂扩散渗入植物体内部和内部微孔隙内；溶质溶解进入溶剂；通过植物体的微孔隙通道中的溶液扩散至植物体表面并进一步进入溶剂主体。根据紫杉醇在各种溶剂中的溶解性质，常用乙醇、甲醇、氯仿、丙酮、乙酸乙酯等为提取溶剂。本章考察比较了以上几种溶剂提取紫杉醇的提取效果，综合考虑各种因素选取了一种溶剂作为以后实验中的提取溶剂。就提取手段而言，除了常规浸提外，目前较先进的提取方法有超声提取，微波提取，超临界流体萃取等。本章在使用常规浸提的同时，也考察比较了超声提取和索氏提取的优劣。相比从红豆杉中皮中提取紫杉醇，从曼地亚红豆杉枝叶中提取紫杉醇有更多的杂质如色素、蜡质等被提取出来，如直接进样进行ＨＰＬＣ分析不仅根本无法进行定量分析，而且对色谱柱影响很大，会降低其使用寿命。另外，从紫杉醇的工业制备来看有两个关键：非紫杉烷类杂质与紫杉烷化合物分离的前处理除杂技术和紫杉醇与其他紫杉烷类化合物的色谱分离技术。只有在前处理除去大量性质与紫杉醇相差较大的杂质后，才能降低后续色谱技术的负荷并改善色谱传质阻力，发挥或增强色谱技术商选择性的能力。于是要对粗提液进行一系列的初步除杂处理，在进行了大量文献调查和一些比较实验后选定了一套操作简便、回收率高的初步除杂工艺，即首先进行正己烷萃取除去非极性杂质和极性低的物质，然后再进行碱洗以除去大量的高极性的杂质。３．１曼地亚红豆杉枝叶中紫杉醇的提取３．１．１实验仪器与材料表３－１主要实验药品和原材料简表药品名称甲醇药品规格生产厂家分析纯分析纯分析纯分析纯分析纯天津市大茂化学试剂厂天津市大茂化学试剂厂湖南师大化学试剂厂天津市恒兴化学试剂制造有限公司天津市密欧化学试剂开发中心无水乙醇冰醋酸三氯甲烷环己烷硕士学位论文第三章曼地亚红豆杉中紫杉醇的提取和初步除杂表３－２主要实验仪器简表３．１．２原料的预处理及样品的分析３．１．２．１原料的预处理原料粒度大小对提取速度和产物得率曼均有影响。原料粒度小，萃取时目标产物分子在原料内传质距离小，扩散表面积增加，传质阻力减少，提取速度加快。但粒度过小，原料颗粒发生聚集，从而增大传质阻力，而且提取液中杂质增多，分离困难，不利于后续处理。本章中曼地亚红豆杉干枝叶经粉碎，过２０目筛备用。３．１．２．２提取液的处理在使用无水乙醇做提取溶剂时，按２．３．１操作；其他溶剂做提取溶剂时，提取液于４５＊（２以下真空浓缩至干，以］ＳｍＬ乙醇溶解，再加２ｍＬ，水，按２．３．１操作得供试品溶液。硕士学位论文第三章曼地亚红豆杉中紫杉醇的提取和初步除杂３．１．２．３供试品溶液的分析供试品溶液经０．４５ｐｒｏ微孔过滤器过滤，定量进样６皿，按操作，根据标准曲线计算其浓度，进而计算其得率。得率＝供试品溶液中紫杉醇质量／红豆杉干枝叶经粉末质量Ｘ１０００，６３．１．３提取溶剂的选择紫杉醇易溶于乙醇、甲醇、丙酮、氯仿等有机溶剂，而不溶于水、石油醚，正己烷等溶剂。在本研究中考察Ａ无水乙醇、Ｂ甲醇、ｃ氯仿、Ｄ乙酸乙酯，Ｅ丙酮及Ｆ乙酸乙酯一丙酮（１：１）等６种有机溶剂的提取效果，采取二级超声提取，每次提取４０ｒａｉｎ。结果如下表表３－３不同提取溶剂提取紫杉醇的得率及纯度数据表从以上数据可以看到乙醇及甲醇的提取率最高，氯仿提取率最低；从所得提取物的纯度方面考察，乙酸乙酯的提取物纯度最高，但提取率较低。考虑到原料成本的因素，提取率较高的乙醇和甲醇应是首选，但甲醇提取物的紫杉醇纯度最低且甲醇有毒，因此在提取溶剂的选择上综合考虑了提取效率、经济可行性、回收循环利用可行性以及对环境的影响等因素，最终选择了化工、制药行业最常用的酒精作为提取溶剂。有文献报道乙酸乙酯：丙酮（１：１）提取效果最好，但从上表数据中可以看到实际并非如此，虽然提取物的纯度较高，但得率较低，同时用该溶剂提取还是日本的一个专利，这可能会涉及到知识产权问题，而且实际生产中回收循环利用比较困难。硕士学位论文第三章曼地亚红豆杉中紫杉醇的提取和初步除杂３．１．４无水乙醇浸提条件的优化３．１．４．１提取温度的选择精确称取曼地亚红豆杉干枝叶粉末５９三份，分别加入１００ｍＬ无水乙醇，于同一温度下浸提２ｈ，每１５分钟摇振１分钟，三级提取，各级提取液合并按２．３．１（２）处理安得供试品溶液，经ＨＰＬＣ分析计算其得率并取其平均值，实验结果如下：轰３－４一■＿ｔ｜Ｂ术鞋一ｍ温度：℃图３－１漫提温度对紫杉醇得率的影响由图可见，紫杉醇在３０．５０＂Ｃ提取盹随着温度升高，得率增加，显然随着温度升高，溶剂分子运动加快，有利于紫杉醇分子进入溶剂。当温度超过５０＂Ｃ后，由于紫杉醇的热不稳定性，在较高温度下易异构化或降解为小分子，故其得率反而下降。因此紫杉醇的提取温度不宜超过５０℃，以５０℃为最佳。３．１．４．２提取时间的选择控精确称取曼地亚红豆杉干枝叶粉末５９三份，分别加入１００ｍＬ无水乙醇，制温度为５０１２，每１５分钟摇振１分钟，三级提取。各级提取液合并按２．３．１（２）处理得供试品溶液，经ＨＰＬＣ分析计算其得率并取其平均值，实验结果如下：表３－５浸提时间对紫杉醇得率影响数据表硕士学位论文第三章曼地亚红豆杉中紫杉醇的提取和初步除杂咖∞一鹫Ⅲ∞洲伸Ⅲ∞＾，‘ｖ哥ｔ删∞嘣∞一柏一∞一一，Ｊ漫提时ｒａｇ：ｈ图３—２浸提时间对紫杉醇得率的影响从图３—２可看出浸提时间对紫杉醇的得率有较大影响，当提取时间在Ｏ．５－２．Ｏｈ间，紫杉醇得率逐渐增加，２ｈ后其得率有所下降，说明在５０℃紫杉醇仍有一定的热不稳定性。但经两小时的浸提，紫杉醇的提取已完成。３．１．４．３料液比的选择精确称取曼地亚红豆杉干枝叶粉末５９三份，分别加入一定体积的无水乙醇，控制温度为５０℃，每１５分钟摇振１分钟，浸提２ｈ，三级提取。各级提取液合并按２．３．１（２）处理得供试品溶液，经ＨＰＬＣ分析计算其得率并取其平均值，实验结果如下：表３－６料液比对紫杉醇得率的影响数据表硕士学位论文第三章曼地亚红豆杉中紫杉醇的提取和初步除杂墨乏。。Ｉ’，Ｉ：１０ｌ１５１·邛ｌ·Ｄ科掖比图３－３料液比对紫杉醇得率的影响由图３－３可见，随着提取溶剂用量的增加，紫杉醇得率亦提高，但增幅随溶剂用量的增加而减缓，当物料比超过１：２０后其得率保持不变，为节省溶剂及回收溶剂的能耗，选择物料比为１：２０为宜。３．１．４．４乙醇浓度的选择当使用较低浓度的乙醇作提取溶剂时，按照本研究提出的初步除杂工艺，将给提取液的初步除杂处理带来相当麻烦。若先进行碱洗除杂，提取液必先真空浓缩至无醇，此时大量的紫杉烷类物质包括紫杉醇以及一些水不溶性物质生成沉淀，再用于和氯仿相进行碱洗萃取，发生严重的乳化现象，紫杉醇损失严重。另一方面若先进行正己烷萃取除杂，真空浓缩后水体积不宜过多，否则加入乙醇后和己烷分相萃取时仍有严重的乳化现象。或者增大乙醇和己烷的用量以消除乳化现象，但必然会带来大量试剂的损耗。若把水分浓缩至适量，则必然要延长浓缩时间或提高浓缩温度，这也会造成紫杉醇的损失。基于以上原因，故用无水乙醇为宜。３．１．４．５提取级数的确定由于单次提取对紫杉醇的提取不够完全，有必要对曼地亚红豆杉干枝叶进行多级提取。精确称取曼地亚红豆杉干枝叶粉末５四份，分别编号为１、２、３、４，各份样品提取级数则分别为１、２、３、４级，分别加入１００ｍＬ无水乙醇，于５０＂Ｃ下浸提，每级浸提时间为２ｈ，每１５分钟摇振１分钟。分别合并各份样品的各级提取液并经处理得供试品溶液，经ＨＰＬＣ分析计算其得率。实验结果如下：表３－７各提取级数得率数据表样品编号提取级数１１２２３３４４硕士学位论文第三章曼地亚红豆杉中紫杉醇的提取和初步除杂得率０．００９５％０．０１２１％０．０１２６％０．０１２７％由表中数据可得出第一级提取率达７４．８０９６，第二级提取率达２０．４８０５，第三级达３．９３％，三级总提取率为９９．２１％，可认为曼地亚红豆杉干枝叶经三次提取已提取完全。３．１．４．６正交实验设计优化提取工艺根据单因素实验结果，采用正交实验进一步考察提取温度，料液比及提取时间三个因素对紫杉醇提取得率的影响。采用Ｌ９（３４）正交表安排实验方案，单级提取。其结果如下：表３－￥正交实验因素水平表表３—１０正交实验数据统计表ＡＫＩ空列０．０２７２Ｂ０．０２３８０．０２７８０．０２９９Ｃ０．０２６７０．０２７００．０２７８０．０２５４０．０２８１Ｋ２岛ｋｌ０．０２７１０．０２７２０．０２８０８．５×１０｛９．Ｉ×１旷７．９×ｌ旷８．９×１旷硕士学位论文第三章曼地亚红豆杉中紫杉醇的提取和初步除杂９．３×１０‘ｋ２ｋＲＳ９．４×１０‘９．３×１０＂０．００１７９．Ｏｘｌ０＂９．１Ｘ１０－５０．０００１９．ＯＸｌ０＂１０．０×１０＂９．３×１０－５０．００６１６４．０×１０４０．００１１２１．６×１０＂１５．６×１０＂０．２２Ｘ１０４从正交实验数据统计表中数据可见，根据方差ｓ值来判断，有Ｓｎ＞Ｓｃ＞ＳＡ，既在给定的水平条件下，提取时间是显著因素，料液比为次要因素，再次之为提取温度。而实验误差Ｓｅ值为０．２２×１０４，很小，可见各个因素都不是屏弃因素，从Ｋ值来分析，单次提取最佳提取工艺应为Ａ２８３Ｃ３。该结果与单因素实验相吻合，考虑到单次提取时间不宜太长，以及结合单因素实验中料液比与得率变化的趋势，最终确定其提取条件为：提取温度５０＂Ｃ，料液比为ｌ：２０，提取２ｈ，三级提取。３．１．５紫杉醇的超声提取目前，超声技术在提取中草药活性成分方面得到广泛应用。超声波是一种弹性机械振动波，是听觉阈以外的振动，它产生强烈振动，高速度，强烈的空化效应，搅拌作用，因此能破坏植物药材的细胞，使溶剂能渗透到药材细胞中，从而加速药材中的有效成分溶解于溶剂中，以提高有效成分的提出率。同时超声提取不会改变有效成分的结构，并且缩短提取时间，提高提出率，从而为中草药成分的提取提供了一种快速、高产的新方法。３．１．５．１超声提取的理论基础中草药有效成分提取过程实质上是溶质从固相中向溶剂中扩散的传质过程，大体可分为３步：溶剂向药材内部渗透和扩散；药材内部溶质溶解；溶质向药材表面扩散和向主体溶液扩散。当对提取液充分搅拌时，通常认为溶质的内扩散是浸提过程中的控制步骤。在超声辅助提取过程中，超声场声能量与物质问产生超声空化作用，伴随超声空化产生的机械效应引起的液流的宏观湍动、固体粒子的高速碰撞和固体内微孔介质的微扰动，都使得涡流扩散加强，大大加快内扩散速度．因而与常规提取相比，其涡流扩散系数不可忽视。与常规提取类似，由Ｆｉｃｋ扩散第一定律可知警＝一ＳＤ（－舞）（３－ｏ式中－～５－为溶质扩散速度，面为溶质浓度梯度，ｓ为固液界面面积，Ｄ为溶，，～“Ｌ，硕士学位论文第三章曼地皿红豆杉中紫杉醇的提取和初步除杂质总扩散系数。在浸提过程中，根据Ｌｅｗｉｓ及Ｗｈｉｔｗａｎ传质过程中的边界层理论，在固液界面层中，溶质的浓度梯度筹在不断减少，其变化趋势可用如下数学函数表示ｄ出Ｃ＝ａｔｂ（３－２）式中ａ和ｂ是参数，ａ＞０，－－ｌ（ｂ＜０．超声辅助提取时，扩散系数包括分子扩散系数和涡流扩散系数两部分，即：Ｄ＝ＤＭ＋ＤＥ（３·３）式中Ｄ－Ｉ为分子扩散系数，是浓度与温度的函数，类似于非溶蚀性药物体系的扩散动力学的结果］，扩散系数与溶质浓度和温度的关系可表示为：Ｄ吖＝Ｋｅ一％Ｃ一（３－４）式中Ｋ是包括指前因子Ａ在内的一些影响因素系数，Ｅ是扩散活化能，仅与扩散体系有关，ｎ是参数。ＤＥ为涡流扩散系数，与溶液的湍动程度有关，类似于超声场对毛细管内物质扩散系数的影响，与温度和超声功率的关系可表示为：Ｄ函（ｋｌＴ＋ｋ２Ｐ）ＤＭ（３－５）式中Ｐ为超声功率，ｋｌ、ｋ２及ｋ３为温度、功率及二者相互作用对扩散系数影响系数．将式（１）～式（５）联立方程组，并确定边界条件；当ｔ＝０时。Ｃ－－－０：在ｔ时刻，Ｃ＝Ｎ／Ｖ，其中Ｎ与ｖ分别为溶质物质的量和浸提液体积，可解得：ｈＣ＝Ｘ＋ｈ７（３－６）式中ｚ＝击十‰铲地脚蚺－】），２而从以上几式可见，超声提取时，超声功率，温度，料液比及超声时间均对目标物质的提出率有影响。因仪器条件限制，下面仅就温度，料液比及超声时间这三个因素做出探讨，以得到最佳超声提取工艺参数。硕士学位论文第三章曼地亚红豆杉中紫杉醇的提取和初步除杂３．１．５．２超声提取的温度选择精确称取曼地亚红豆杉干枝叶粉末５９三份，分别加入１００ｍＬ无水乙醇，于同一温度下超声４０ｍ／ｎ，三级提取。各级提取液合并经处理得供试品溶液，经ＨＰＬＣ分析计算其得率并取其平均值，实验结果如下：表３一儿超声温度对紫杉醇得率的影响数据表譬墓””””娃。弋”。图３－４超声温度对紫杉醇得率的影响从表中数据可看出，经三次超声提取，在４０＂Ｃ时紫杉醇得率最大，但从全部数据来分析，超声温度对紫杉醇得率影响不大，各个温度下得率非常接近。考虑到超声过程中超声场产生的聚能效应不能忽约，会导致提取液温度升高，因此在实际生产中，在室温下操作即可。３．１．５．３超声提取时间的选择精确称取曼地亚红豆杉干枝叶粉末５９三份，分别加入１００ｍＬ无水乙醇，为简化操作，于室温下超声提取，一级提取。提取液合并经处理得供试品溶液，经ＨＰＬＣ分析计算其得率并取其平均值，实验结果如下：表３—１２超声时间对紫杉醇得率的影响数据表硕士学位论文第三章曼地亚红豆杉中紫杉醇的提取和初步除杂譬墓“。赶声时何：ｎ眦图３－５超声时间对紫杉醇得率的影响由图中可见，随着超声时间的增加，紫杉醇的得率也增加，这一结果与３－６式相吻合。在超声４０ｍｉｎ后，随着超声时间的延长，紫杉醇得率的增幅逐渐减缓，这说明超声时间达到一定程度，提取液浓度与植物细胞壁内浓度趋于平衡，再增加超声时间无明显效果，故选超声４０ｍｉｎ为宜。同时与常规浸提相比，该图中未出现最大值，这说明在较低温度下进行超声提取可获得在较高温度下进行浸提的提取效果，而又无高温造成紫杉醇损失的弊端。３．１．５．４超声提取料液比的选择精确称取曼地亚红豆杉干枝叶粉末５９三份，分别加入定量无水乙醇，为简化操作，于室温下超声提取，超声４０ｎｆｉｎ，一级提取。提取液合并经处理得供试品溶液，经ＨＰＬＣ分析计算其得率并取其平均值，实验结果如下：表３－－１３料液比对紫杉醇得率的影响数据表置。，ｍＯＯ兰一辩液比图３－６料液比对紫杉醇得率的影响３６硕士学位论文第三章曼地亚红豆杉中紫杉醇的提取和初步除杂由图３－６可见，随着提取溶剂用量的增加，紫杉醇得率亦提高，但增幅随溶剂用量的增加而减缓，当物料比超过１：２０后其得率保持不变，为节省溶剂及回收溶剂的能耗，选择物料比为１：２０为宜。３．１．５．５超声提取级数的确定经以上数据比较，发现当物料比为１：２０，于室温下超声４０ｒａｉｎ．一级提取率为８４．３８％。与常规浸提相比，其一级提取率高出９．５８％，但仍然提取不够完全，需进行多级提取。精确称取曼地亚红豆杉干枝叶粉末四份，分别编号为ｌ、２、３、４，各份样品提取级数则分别为ｌ、２、３、４级，分别加入ｌＯＯｍＬ无水乙醇，于室温下超声提取，每级提取４０ｍｉｎ。分别合并各份样品的各级提取液并经处理得供试品溶液，经｝Ⅱ，ＬＣ分析计算其得率。实验结果如下：表３－１４各级超声提取得率数据表由表中数据可得出第一级提取率达８４．３８％，第二级提取率达１４．０６％，第三级１．５６％，前两级总提取率为９８．４４％，可认为经两级超声提取，曼地亚红豆杉干枝叶中紫杉醇已提取完全。在从曼地亚红豆杉千枝叶提取紫杉醇中，超声提取比常规浸提明显优越。在提取完全的情况下，采用超声提取，时问节省４小时２０分钟，且只需两次提取既提取完全，大大节省了提取溶剂的消耗。同时，由于超声提取操作温度低，提取时问短，不会造成紫杉醇的降解或异构化。３．１．６紫杉醇的索氏提取在植物活性成分提取领域中，索氏提取法以溶剂用量少，提取成分完全及操作简便特点而得到广泛应用惭）。３．１．６．１索氏提取过程中的传质分析植物细胞中的可溶性成分一旦溶解于溶剂中，既通过分子扩散从细胞内部向固体外表面运动，并通过固液界面进入溶剂主体，此时，传质过程不再是单纯的３７硕士学位论文第三章曼地亚红豆杉中紫杉醇的提取和初步除杂分子扩散，而是相与相之间的对流扩散，物质的传递将是紊流和分子扩散为总和的对流传递。由于紊流中没有流线，而是依靠大量的旋涡以毫无次序的方式快速运动，故其传质速率远远大于分子扩散。因此，即使是低速的对流流动，在流动方向上，其传质速率也大于分子扩散。由此可见，提取溶剂的流动方式是影响固液界面传质速率的主要因素。按流动方式分类，可分为爬流、层流、湍流三种情况。在索氏提取过程中，由于溶剂的冷凝液不断从管壁和顶部流入固体填充床内，使得提取液面缓慢上升，造成了固液两相的相对运动。提取溶剂流过原料颗粒为爬流运动，正是这种爬流运动增加了３．３式中的扩散系数，提高了传质速度。同时，由于新鲜溶剂的不断补充，植物细胞内外浓度差增大，也提高了溶质的扩散动力，亦将推进整个提取过程。３．１．６．２实验部分准确称取曼地亚红豆杉干枝叶粉末２０９，以３００ｍｌ无水乙醇进行索氏提取。调整电加热套加热速度，保持虹吸回流速度为３次／小时。以下是索氏提取时间和紫杉醇得率的数据：表３－１５不同索氏提取时间所得得率数据表由表中数据可见，索氏提取的紫杉醇得率远不及溶剂浸提和超声提取。而且随着提取时间的加长，紫杉醇得率反而下降。经分析，这可能与索氏提取温度较高有关。虽然索氏提取完全，但在高温下，紫杉醇降解或异构化，导致紫杉醇得率不及溶剂浸提和超声提取。由此可见，曼地亚红豆杉干枝叶中紫杉醇的提取不宜采用索氏提取。３．２紫杉醇热稳定性的研究在对曼地亚红豆杉干枝叶中紫杉醇进行提取时，无论采用溶剂浸提还是超声提取，都发现这样一个规律：既提取温度超过５０＂１２，其得率反而下降。采用索氏提取时这点表现得更甚。由此可见，紫杉醇在较高温度下具有一定的不稳定性。目前没有文献报道紫杉醇在较高温度下降解成那些小分子及如何异构化，也无相关热力学数据。因此有必要对紫杉醇的热稳定性进行研究。硕士学位论文第三章曼地亚红豆杉中紫杉醇的提取和初步除杂从紫杉醇的分子结构式（如图３—７）分析，易发生分解的部位是２、４、１０、１３位的四个酰氧基团，而作为紫杉醇分子骨架的三环结构也是一个很好的离去基团。在醇溶液中，考虑到位阻作用，４、１０位的乙酰氧基更易发生醇解反应。图３—７：紫杉醇分子结构式４，５位的环氧丙烷结构也很有可能开环。１，３，４，８位作为桥头碳原子，其上基团不可能发生异构化；而２，１０，１３位上因基团较大，不容易发生异构化；最可能发生异构化的则是７位羟基。综上所述，紫杉醇可能发生的反应相当复杂。下面将给出紫杉醇的乙醇标准溶液在各温度下其浓度变化数据。３．２．１温度对紫杉醇稳定性的影响配制紫杉醇乙醇标准溶液（７０．１ｔ，ｇ／ｍＬ），置于水浴中保温，每一小时用ＨＬＰＣ分析其浓度变化，其结果如下表：表３—１６不同温度下紫杉醇标样浓度随时间变化数据表３０℃０１２３４５６７７０．１７０．１６９．６６９．３６９．２６９．Ｏ６８．９６８．８浓度：ｐｇ／ｍＬ７０℃７０．１６５．４６０．８５６．６４０℃７０．１６９．８６９．４６９．１６８．８６８．６６８．５６８．４５０℃７０．１６８．２６７．４６６．５６５．４６４．８６０℃７０．１６７．６６４．３６１．６５９．８５８．１５７．４５６．８８０℃７０．１６２．６５５．４４９．３４４．２４０．４３８．６５３．７５１．９６４．３６３．９５０．６４９．５３６．３硕士学位论文第三章曼地亚红豆杉中紫杉醇的提取和初步除杂８９１０６８．６６８．４６８．４６８．２６８．２６７．８６３．４６３．１６２．８５６．５５６．１５５．８４７．６４６．４４５．８３４．６３２．８３１．３｛望一＋３０℃＋４０℃—＊。５０℃——一６０℃——一７０℃越蠖＋８０℃∞阳∞们∞加１２３４５６７８９１０１１时间：ｈ图３－８：不同温度下紫杉醇标样浓度随时间变化图从图３—７中可看出，紫杉醇在３０、４０＂Ｃ时相对比较稳定；５０＂Ｃ后，其浓度变化已经很明显。在８０＂Ｃ时，紫杉醇乙醇标准溶液经１０小时保温后，其浓度仅为原来的４４．６５５。可见，紫杉醇的提取不宜采用较高温度，否则会产生较大损失。另外，紫杉醇乙醇标准溶液与紫杉醇提取液的复杂体系相比具有较大差别。实验中紫杉醇提取液为ＰＨ为６．２的弱酸性溶液，其中的旷离子对紫杉醇的降解起到催化作用，将大大加快紫杉醇的损耗。现有文献对紫杉醇的提取一般都采用常温下浸提或超声提取，在不搅拌的情况下，常温浸提时间都很长，需２．３天时间方可提取完全。可见文献中的浸提温度与本实验中结果相一致。３．３提取液的初步除杂曼地亚红豆杉枝叶的提取液中含有大量杂质，它们在液相色谱固定相上的竞争吸附甚至不可逆吸附会导致固定相用量增加，目标产物的分离度降低，分离效率低下；同时大量杂质的存在会严重污染色谱柱，降低色谱柱的使用寿命。因此在对样品进行色谱分析前，有必要对提取液进行除杂。由于在曼地亚红豆杉枝叶特别是叶片中含许多色素和蜡质，无疑将大大增加紫杉醇提取分离难度。这要求在提取物中加入低极性溶剂如正己烷以除去此类物硕士学位论文第三章曼地亚红豆杉中紫杉醇的提取和初步除杂质。研究发现１６７ｌ该法可除去红豆杉枝叶中多达７２％的可溶于正己烷的杂质。至于极性大且溶于水的杂质可采用氯仿一水液液萃取法嗍除去，可使得随后的色谱分析更易于操作。３．３．１实验仪器与材料表３－１７主要实验药品和原材料简表表３一１８主要实验仪器简表仪器名称ＨＰＬｃ仪ＨＰＬｃ紫外检测器ＨＰＬｃ记录仪仪器型号ＢＴ８１００ＢＴ８２００Ｃ－Ｒ３Ａ生产厂家Ｂｉｏｔｒｏｎｉｃ公司Ｂｉｏｔｒｏｎｉｃ公司Ｓｈｉｍａｄｚｕ公司Ｂｉｏｔｒｏｎｉｃ公司Ｄｙｎａｍｉｃ混合器Ｃ１８，甄双通道色谱工作站Ｉｎｔｅｒｔｅｘ２５０ｘｚ丘咖Ｎ２０００天津市琛航科技仪器有限公司浙江大学智达信息工程有限公司瑞士０ｍＭＳ公司上海申科机械研究所郑州长城科工贸有限公司上海申生科技有限公司上海沪超超声波仪器有限公司北京市医疗设备厂湘仪科学仪器设备有限公司Ｅｘｐｌｏｒｅｒ全自动电子天平旋转蒸发仪循环水式多用真空泵恒温水浴锅不锈钢电热恒温水浴锅磁力加热搅拌器３．３．２实验方法Ｒ－２０１ｓ哪一Ｂ。Ｗ２０１超声波清洗器ＣＱ＿６ＧＳＹ一Ⅱ７８－１精密称取５ｇ曼地亚红豆杉干枝叶粉末，加入１００ｍＩ无水乙醇，超声处理４０ｍｉｎ，静置过滤，滤渣再以ｌＯＯｍｌ无水乙醇超声４０ｍｉｎ，静置过滤，合并滤液浓缩４１—里堕兰堕型塑王———————～苎三兰量丝垩垒星堑主茎堑壁堕堡壁塑塑生堕垄至适量，转至小烧杯中于４０℃真空干燥，称重。然后用流动相溶解定容至２５．００ｎ１Ｌ，经４５ｐｒｏ微孔过滤器过滤得样品Ｉ，进行ＨＰＬＣ分析。ｇ曼地亚红豆杉干枝叶粉末，超声提取步骤同上，合并滤液浓缩至１８ｍｌ，加入２ｍＬ水，然后用正己烷萃取３次（２５ｍＬＸ１次，１２．５ｍＬ×２次），乙醇相以乙醇定容至２５ｍＬ，得样品ＩＩ。样品ＩＩ经Ｏ．４５＂ｍ微孔过滤器过滤，进行ＨＰＬＣ分析。样品ＩＩ再真空浓缩至适量，转至小烧杯中于４０℃真空干燥，称重。样品Ⅱ真空浓缩至无醇，以５０ｍＬ三氯甲烷溶解，加入５０ｌｎＬｌｍｏｌ／ＬＫ２ｃ０３溶液（含５％ＮａＣＩ）振摇２０ｒａｉｎ：分相后有机相用０．５倍体积Ｋ２ｃ０３溶液洗涤两次，精密称取５氯仿相经真空浓缩至干，再以乙醇充分溶解并定容至２５．００ｍＬ，经０．４５岫微孔过滤器过滤得样品Ⅲ，进行ＨＰＬＣ分析。样品Ⅱ再真空浓缩至适量，转至小烧杯中３．３．３结果与讨论比较样品Ｉ、Ⅱ的色谱图，两图无明显差异，似乎正己烷萃取一步除杂效果不明显。但经重量法分析，样品ＩＩ的干燥物比样品Ｉ失重３４．２４％，可见正己烷萃取～步可除去３４．２４％的杂质。同时这也说明这部分杂质在检测波长２２７叫处无吸咚，．当然也很可能出峰时间极晚。从样品ｍ的色谱图来看，杂质峰大幅度减少，减弱，该步除杂效果显著。经重量法分析，样品Ⅲ的干燥物比样品Ｉ失重８６．３６％，也既经ｌ（２ｃ０３溶液碱洗后除去杂质５２·１２％·在样品Ⅲ中紫杉醇纯度达０．６８％，与乙醇粗提物中紫杉醇纯度Ｏ．０９３４％相比较，其纯度提高了６．２８倍。图３－９：最佳提取条件下乙醇提取液色谱图（样品Ｉ）硕士学位论文第二章曼地亚红豆杉中紫杉醇的提取和初步除杂图３一ｌＯ：最佳提取务件下乙醇粗提液经正己烷萃取后所得样品色谱图（样品Ⅱ）图３－１１：最佳条件下乙醇粗提液经正己烷萃取，碱洗后所得样品色谱图（样ｇ，ＨＩ）３．５本章小结（１）对各种浸提溶剂的提取效果经过比较之后，选取乙醇作为提取溶剂。使用乙醇进行提取，其得率高，且成本经济，易回收循环使用。（２）通过单因素实验及正交实验对乙醇提取紫杉醇工艺的研究，得到乙醇提取紫杉醇的最佳条件：提取温度，提取时间，料液比为，提取级数（３）对紫杉醇的超声提取及索氏提取进行了探索。采用超声提取较普通浸掘效率高，在室温下进行超声提取只需４０ｒａｉｎ，提取两次既可提取完全。而索氏提取因提取温度高，在紫杉醇的提取中不宜采用。（４）紫杉醇在高温下不稳定，容易降解或异构化，实验发现，温度超过５０＂Ｃ，紫杉醇标准溶液浓度既有明显变化，在３０Ｖ时虽然变化很小，但也不宜在此温度下长久保存。（５）紫杉醇的粗提液中含大量杂质，经正己烷萃取可除去３４．２４％的杂质，再经Ｋ２Ｃ０３溶液碱洗氯仿萃取后除去杂质５２．１２％。此时紫杉醇纯度达０．６８％，与乙醇粗提物中紫杉醇纯度０．０９３４％相比较，其纯度提高了６．２８倍。可见通过两步液液萃取，达到了除杂初步提纯的目的。硕士学位论文第四章曼地亚红豆杉中枝叶紫杉醇的柱层析第四章曼地亚红豆杉枝叶中紫杉醇的柱层析在植物天然产物的分离纯化中，柱层析起着在植物天然产物的分离纯化中起着举足轻重的作用。它的应用最为广泛，其分离对象几乎覆盖了所有类型的化合物。反相层析通常是指以具有非极性表面的介质为固定相，以比固定相极性大的溶剂系统为流动相的层析。反相层析是相对于正相层析而言的。在后一种情况下，使用极性固定相和非或弱极性的流动相。正相层析的保留机理认为是溶质分子在流动相和固定相之间竞争吸附的作用。反相层析的作用机理目前尚不完全清楚。有人认为是分配作用１６９ｊ，也有人认为是吸附作用【７０１。一般将正反相层析均归类于吸附层析。经过初步除杂后所得到的样品尽管已除掉大部分杂质，紫杉醇的含量仍然很低，经计算此时紫杉醇含量只有０．６８％，必须进行迸一步的分离。柱层析是分离紫杉醇和紫杉烷类物质的常用方法之一，具有简单、高效的特点，常用的有硅胶，氧化铝、大孔树脂等作为填料。在本实验中，对反相层析及正相层析分离纯化紫杉醇都进行了一定研究。实验中选用了硅胶作正相层析柱填料，ＡＢ．８大孔树脂作反相层析柱填料进行紫杉醇的分离纯化。４．１实验仪器与材料表４－１主要实验药品和原材料简袁表４－２主要实验仪器筒表硕士学位论文第四章曼地亚红豆杉中枝叶紫杉醇的柱层析４．２硅胶柱层析层析用硅胶为多孔物质，可以用通式ｓｉ０２·ｘＨ２０表示。硅胶是一种应用最广泛的极性吸附剂，其特点是化学惰性、吸附量大、易制备成型、多孔、孔径和表面积大。硅胶的吸附性能取决于硅胶中硅羟基的数目及含水量。若硅胶的吸水量超过１２％，吸附力极弱，不能用于层析分离１７“。硅胶于１５０～１６０℃加热数小时可除去其吸附水分达到活化目的。活化可提高吸附剂的选择性，但同时也增加了峰的拖尾现象和催化活性，并降低回收率和线形容量。当完全活化，侧有可能造成不可逆吸附。由于硅胶具有弱的非特异性吸附，能同时吸附极性和非极性的分子；所以硅胶具有吸附层析和分配层析的双重性。４．２．１实验方法层析用硅胶于１５００Ｃ活化２ｈ，转移至干燥器中冷却后，以氯仿湿法装柱，柱顶端加一层玻璃纤维，防止其界面遭到破坏。然后以氯仿充分淋洗；称取３．３．２中碱洗后的干燥样品，以质量体积比１：５的氯仿溶解，上样，以３倍柱床体积的氯仿洗脱不吸附及吸附弱的杂质，一直洗脱至洗脱液无色或颜色较浅时，换３倍柱床体积的３％的甲醇氯仿溶液洗脱，每１０ｍＬ收集一次洗脱液，用Ｉ－ＩＰＬＣ分析，确定含紫杉醇的洗脱液。并计算其含量。４．２．２结果与讨论４．２．２．１上样量的选择上样量的大小显著影响硅胶柱层析的分离效果，上样量过小，分离效果好，但浪硕士学位论文第四章曼地亚红豆杉中枝叶紫杉醇的柱层析费试剂，上样量过大，导致层析柱严重超载，分离效果差。因此，选择适合的上样量是有必要的。装柱规格通一为０２５×４００姗，流速定为１．Ｏｍｌ／ｍｉｎ，结果如下表：表４－３上样量对分离效果的影响数据表从表中数据可见，上样量在０．５０～０．７５是恰当的，上样量再增加会导致纯度及回收率都显著下降。４．２．２．２层析柱径高比的选择层析柱的高度高，则其塔板数多，分离效果好，但不能过高，一方面造成洗脱剂的大量损耗，另一方面会导致操作时间太长。上样量定为０．５０９，流速定为１．Ｏｍｌ／ｍｉｎ，结果如下表：表４－４层析柱高对分离效果的影响数据表从表中数据可见，随着层析柱高的增加，紫杉醇的纯度和回收率都有所提高。４．２．２．３洗脱流速的选择对于一个给定的层析分离，当选定层析柱后，理论塔板高度Ｈ取决于流动相的流速“，从ＶａｎＤｅｃｍｔｅｒ方程：Ｈ：４＋旦＋印∥（４－１）可见，对于固定的层析柱及分离温度，可以测定Ｈ～ｌＩ曲线，找到最佳洗脱速度，硕士学位论文第四章曼地亚红豆杉中枝叶紫杉醇的柱层析使Ｈ最小或在可接受范围内。Ｈ可通过下式计算：日＝——兰—。（４－２）ｔ６（％）２其中Ｌ为柱长，ｔＲ为目标产物在柱上的相对保留时间，ｔｗ为目标产物的峰宽。装柱规格通一为中２５×４００ｍ，上样量为０．５０９，在不同流速下进行实验，按４－２式计算Ｈ，并绘制Ｈ～ｐ曲线，结果如下：表４－５塔板高度Ｈ计算数据表柏～”一曩一ｚ俺辑拍”佃佃口流速ｖ（ｍ１／ｍｈｌ）图４－１Ｈ—ｐ曲线图＿从图表中数据可见，流速控制为ｌ～１．５ｍＬ／ｍｉｎ是可行的，塔板数都在２５０以上。经过初步除杂，碱洗后的氯仿相经适当浓缩上硅胶柱，下图是经硅胶柱层析初步提纯后的色谱图：图４－２硅胶县析后样品的Ｉ－ＩＰＬＣ色谱图硕士学位论文第四章曼地亚红豆杉中枝叶紫杉醇的柱层析从此图可看出，紫杉醇经硅胶柱富集除杂，纯度获得提高。色谱图上分析的表观含量达１３．５７ｅ，但考虑到某些杂质在２２７ｎｍ处不吸收，故通过重量法分析，计算出此时紫杉醇纯度为５．８２％，回收率为９８．７８％。纯度较之碱洗后提高了８．５６倍。将经一次层析后所的紫杉醇样品经二次硅胶柱层析后，其纯度未获得提高，究其原因很可能是由于氯仿中通常添加一定的乙醇作稳定剂，致使通过微调洗脱剂中甲醇含量而未达到改变洗脱剂强度的目的。４．３ＡＢ－８大孔树脂柱层析大孔树脂是在离子交换树脂的基础上发展起来的。１９３５年英国的Ａｄａｍｓ和Ｈｏｌｍｅｓ发表了由甲醛，苯酚与芳香胺制备的缩聚高分子材料及其离子交换性能的工作报告，从此开创了离子交换树脂领域。２０世纪５０年代末合成了大孔离子交换树脂，是离子交换树脂发展的一个里程碑。上世纪６０年代末合成了大孔吸附交换树脂，并于７０年代末用于中草药有效成分的分离，但我国直到８０年代后才开始有工业规模的生产和应用。大孔吸附树脂目前多用于工业废水处理、食品添加剂的分离精制、中草药有效成分、维生素和抗菌素等的分离提纯和化学制品的脱色、血液的净化等方面。大孔吸附树脂（ｍａｃｒｏｐｏｒｏｕｓａｂｓｏｒｐｔｉｏｎｒｅｓｉｎ）属于功能高分子材料，是近３０余年来发展起来的一类有机高聚物吸附剂，是吸附树脂的一种，由聚合单体和交联剂、致孔剂、分散剂等添加剂经聚合反应制备而成。聚合物形成后，致孔剂被除去，在树脂中留下了大大小小、形状各异、互相贯通的孔穴。因此大孔吸附树脂在干燥状态下其内部具有较高的孔隙率，且孔径较大，在１００～１０００ｎｍ之间，故称为大孔树脂。大孔树脂的表面积较大、交换速度较快、机械强度高、抗污染能力强、热稳定好，在水溶液和非水溶液中都能使用。大孔树脂具有很好的吸附性能，它理化性质稳定，不溶于酸、碱及有机溶剂，对有机物选择性较好，不受无机盐类及强离子低分子化合物存在的影响，可以通过物理吸附从水溶液中有选择地吸附有机物质。大孔树脂是吸附性和筛选性原理相结合的分离材料，基于此原理，有机化合物根据吸附力的不同及分子量的大小，在大孔吸附树脂上经一定的溶剂洗脱而分开【７２１．一般非极性树脂适于从极性溶液中吸附非极性物质，主要依靠分子中亲脂键、偶极离子及氢键的作用。中等极性４８硕士学位论文第四章曼地亚红豆杉中枝叶紫杉醇的柱层析的树脂对于极性物质和非极性物质都具有吸附作用。而高极性树脂则适于从非极性溶液中吸附极性物质。４．３．１实验方法实验中使用的南开大学化工厂生产的ＡＢ－８树脂为非极性树脂，平均孔径１３０－１４０Ａ，其单体为苯乙烯，交联剂为二乙烯苯，致孔剂为烃类，分散剂为明胶。其中残留有苯乙烯、芳烃（烷基苯、茚、萘、乙苯）等。４．３．１．１树脂的预处理新树脂在使用前必须进行预处理，以除去树脂中所含有的少量低聚物、有机物及有害离子。具体处理步骤为：（１）清洗层析柱，保持柱内无水：（２）先于柱内加入相当于树脂体积ｏ．４．ｏ．５倍的乙醇，然后将新树脂投入柱内，使其液面高于树脂层面０．３ｃｍ，浸泡２４１１：（３）用乙醇以２ＢＶ／ｈ的流速洗涤树脂，洗至流出液加水不呈白色浑浊为至，然后以水以同样流速洗净乙醇：（４）用２ＢＶ的５％ＨＣＩ以４ＢＶ／ｈ的流速洗涤树脂，并浸泡２－４ｈ，然后用水洗至流出液呈中性：（５）用２ＢＶ的３％ＮａＯＨ以４ＢＶ／ｈ的流速洗涤树脂，并浸泡２－４ｈ，然后用水洗至流出液里中性：（６）用乙醇充分洗涤溶胀，用开始洗脱的流动相洗出乙醇，平衡层析柱。４．３．１．２样品的制备准确称取曼地亚红豆杉干枝叶粉末２０９，按３．１．５中得到的最佳提取条件进行超声提取，提取液于４５＂Ｃ以下真空浓缩至２０ｍＬ左右，加入２０ｍＬ水，充分震荡摇匀，既得ＡＢ－８树脂层析柱上样样品。４．３．１．３柱层析过程ＡＢ喝树脂层析柱装柱规格为０２５×４００ｎＭｎ，将样品溶液加于柱顶，以１．０ｍｌ／ｍｉｎ的流速进行吸附，吸附完成后，先以３ＢＶ３０％乙醇溶液进行洗脱，后续以３ＢＶ５０％乙醇溶液，再以３ＢＶ７０％Ｚ，醇溶液进行洗脱，洗脱速度控制为１．５ｍＬ／ｍｉｎ。洗脱同硕士学位论文第四章曼地亚红豆杉中枝叶紫杉醇的柱层析时，每２５ｍＬ收集一次洗脱液并进行编号，ＨＰＬＣ进行分析。洗脱完成后，以乙酸乙酯进行淋洗，回收树脂以备循环使用。将含紫杉醇的洗脱液合并于４５。Ｃ以下真空浓缩至无醇，浓缩液加入同体积氯仿充分摇振进行萃取，萃取三次，合并氯仿相，于４０１２真空浓缩至干，以２０ｍＬ乙醇溶解，加入１３ｍＬ水，再次上柱进行二次柱层析。先以３ＢＶ６０％乙醇溶液进行洗脱，再以３ＢＶ７０％乙醇溶液洗脱。洗脱速度控制为１．５ｍＬ／ｍｉｎ，每２５ｍＬ收集一次洗脱液并进行编号，ＨＰＬＣ进行分析。含紫杉醇的洗脱液处理同上，其氯仿浓缩液于４０℃真空干燥，备用。４．３．１．４树脂的再生使用过的ＡＢ一８树脂层析柱需再生以备循环使用，其处理过程如下：（１）用３ＢＶ的５％ＨＣＩ以２ＢＶ／ｈ的流速洗涤树脂，并浸泡２－４ｈ，然后用水洗至流出液呈中性：（２）用３ＢＶ的３％ＮａＯＨ以２ＢＶ／ｈ的流速洗涤树脂，并浸泡２－４ｈ，然后用水洗至流出液呈中性：（３）用乙醇充分洗涤溶胀，用开始洗脱的流动相洗出乙醇，平衡层析柱。４．３．２结果和讨论紫杉醇粗提液经一次ＡＢ－８树脂层析柱层析，在７０９６乙醇溶液洗脱液６、７号检测分析到含有紫杉醇，洗脱液呈澄清橙黄色，经分析此时紫杉醇纯度达３．２５％，回收率为９９．３６％。与乙醇粗提物中紫杉醇纯度０．０９３４％相比较，其纯度提高了３３．８０倍，可见ＡＢ一８树脂层析柱提纯分离效果显著。ＡＢ－８树脂层析柱可一次性除掉极性较大的或水溶性物质如鞣质，及非极性和一些弱极性物质如叶绿素，焦油，蜡质等，与３．３节中通过两次液液萃取除杂相比较，除提纯分离效果具有明显优势外，还极大的简化了操作。粗提液经层析后，层析柱的清洗一度成为难题，因为柱上吸附的一些叶绿素及黑色状物质即使使用大量乙醇或者改变４．３．１．４中清洗步骤的顺序也很难洗脱下来，后经多次实验发现，采用１ＢＶ的乙酸乙酯既可清洗完全。一次层析后的含紫杉醇样品经二次层析，紫杉醇集中于５、６、７号７０％乙醇溶液洗脱液中，洗脱液呈无色澄清溶液。经分析此时紫杉醇纯度达到１８．４３％，回收率为９６．４６％，较之一次层析，其纯度提高了４．６７倍。一次层析和二次层析色谱图如下：５０硕士学位论文第四章曼地亚红豆杉中枝叶紫杉醇的柱层析图４－３一次层析后样品的色谱图图４－４二次层析后样品的色谱图图４－３，图４－４中于２４ｒａｉｎ出峰的为紫杉醇峰。４．４本章小结（１）采用硅胶层析柱提纯分离经两次液液萃取后的紫杉醇样品，其层析工艺为；湿法装柱，装柱规格为中２５Ｘ４００ｎｌｎ，上样量以０．５－０．７５９为宜，洗脱流速控制为卜１．５ｒａｉｎ／ｒａｉｎ之间，先以氯仿进行充分淋洗，后换以３％的甲醇氯仿溶液洗脱。（１）紫杉醇经硅胶层析柱富集除杂，以色谱图分析的表观含量达１３．５７％，但考虑到某些杂质在２２７ｎｍ处不吸收，故通过重量法分析，计算出此时紫杉醇纯度为５．８２％，回收率为９８．７８９６。实验结果表明，硅胶柱层析法具有分离效率较高、回收率高、操作简便等特点。但经二次层析，紫杉醇纯度未获得提高。（２）采用ＡＢ－８树脂层析柱经一次层析紫杉醇租提液，其层析工艺为：湿法装柱，装柱规格为２５Ｘ４００ｒａｍ，洗脱流速控制为１．５ｍｉｎ／ｍｉｎ，先以３ＢＶ３０％乙醇溶液进行洗脱，后续以３ＢＶ５０％乙醇溶液，再以３ＢＶ７０％乙醇溶液进行洗脱，收集７０％乙醇的洗脱液。经一次层析，紫杉醇纯度达３．２５％，回收率为９９．３６％。ＡＢ一８树脂层析柱二次层析工艺为：装柱规格为０２５ｘ４００ｍｍ，洗脱流速控制为１．５ｍＬ／ｍｉｎ，先以３ＢＶ６０％乙醇溶液进行洗脱，再以３ＢＶ７０％乙醇溶液进行洗脱，收集７０９６乙醇的洗脱液。二次层析后，紫杉醇纯度达到１８．４３％，回收率为９８．４６％。（３）比较硅胶层析柱和ＡＢ－８树脂层析柱，ＡＢ一８树脂层析柱对紫杉醇粗提液的分离效率较硅胶层析柱高，且硅胶层析柱的二次层析，紫杉醇纯度得不到提高。但ＡＢ－８树脂层析所得紫杉醇样品中含水，对样品的干燥不利，还需通过氯仿萃取，以便于在较低温度下进行干燥处理。另外，硅胶层析柱所用的洗脱剂为氯仿，氯仿易挥发且有一定毒性，对长时间采用氯仿进行操作的工作人员身体有一定危害。从经济方面考虑，乙醇也要比氯仿便宜。总之，两种层析法各有利弊。硕士学位论文第五章一些补充及展望第五章一些补充及展望５．１补充（１）在紫杉醇的提取过程中，特别是在索氏提取中，发现紫杉醇在较高温度下不易稳定存在，通过对其标准品的乙醇溶液在不同温度下其浓度随时间变化的测定，以及进行的精密度实验测定日间相对标准差数据表明，紫杉醇标准溶液于４１２保存比较稳定，没有出现较明显的异构化及其他化学变化。（２）紫杉醇粗提液通过液液萃取初步除杂过程中，如先进行碱洗氯仿萃取一步，在相界面之间容易产生一层红棕色絮状物，该物质经单独分离出来进行分析，发现有少量紫杉醇存在，故先宜进行正己烷萃取。实验中经正己烷萃取可除去３４．２４％的杂质，再经Ｋ２Ｃ０３溶液碱洗氯仿萃取后除去杂质５２．１２％。此时紫杉醇纯度达Ｏ．６８％，与乙醇粗提物中紫杉醇纯度Ｏ．０９３４％，ｔｆｌ比较，其纯度提高了６．２８倍。（３）由于曼地亚红豆杉干枝叶粉末中紫杉醇含量过低，而粗提液中杂质多，紫杉醇浓度极低，故无法精准分析曼地亚红豆杉干枝叶粉末中紫杉醇原始含量。文中在柱层析一章中计算回收率时均以紫杉醇粗提液通过液液萃取初步除杂后所得紫杉醇含量为准。（４）就提取而言，超声提取效果明显优于普通浸提，不仅提取时间大幅度减少，只需两次超声提取既可提取完全，且在室温下进行提取，这对紫杉醇的提取尤为适宜。超声提取技术在紫杉醇的提取中，其应用前景值得看好。采用索氏提取紫杉醇则不恰当。（５）使用乙醇在本文中给出的浸提条件并搅拌的情况下，与文献中常温下浸提三次，一次一天相比，采用加热并搅拌的提取方法其得率更高。实验得到常温浸提得率为０．０１２２％，而加热搅拌的得率为Ｏ．０１２６％，可见常温浸提即使提取三天，提取也并不完全。（６）在紫杉醇的柱层析纯化中，目前应用较多的是正相层析，主要是考虑到层析产物中无水，产品后续处理容易。本文中采用硅胶柱层析，上样样品为液液萃取初步除杂后所得。实验中直接以未经处理的紫杉醇粗提物上样，其层析效果不佳，大量叶绿素及一些黑色物质与紫杉醇同时洗脱，导致纯度难以有很大提高。经分析此时纯度仅为０．９４％。（７）由于时间仓促及必要的实验仪器试剂缺乏，文中未涉及到紫杉醇与三尖杉宁碱及７一表紫杉醇的分离。在色谱图４—２、４－３、４－４中可看到这三种物质的硕士学位论文第五章一些补充及展望存在。根据文献，图中２ｌ、２４、２９分钟左右出峰应依次为三尖杉宁碱、紫杉醇及７－表紫杉醇。５．２展望就紫杉醇来源来看，紫杉醇的全合成纯粹是一种对科学及艺术的追求，其合成步骤繁琐产率极低，很难实现产业化；而紫杉醇的半合成其中间体巴卡亭Ⅲ仍需从红豆杉属植物体中提取；通过细胞组织培养获取紫杉醇还在实验之中，因此从红豆杉属植物体中提取紫杉醇仍将是紫杉醇的主要来源。曼地亚红豆杉由于其枝叶中含紫杉醇，且生长快速，故它成为提取紫杉醇的首选。目前，国内大面积引入曼地亚红豆杉，再过２至３年，这些曼地亚红豆杉都已成材可用。因此，研发从曼地亚红豆杉枝叶中提取并提纯紫杉醇整套工艺十分迫切。因种种原因，本文中这一工作仅作到中途半端，把粗提物中紫杉醇含量ｏ．０９３４％提高到１８．４３％，远未达到药用标准，因此还有很多工作需要去做。随着超临界流体萃取技术及制备色谱技术的发展，这将给紫杉醇的提取及提纯带来更为广阔的空间。硕士学位论文参考文献参考文献［１］化学化工出版社组织编写．精细化工产品大全［Ｍ－Ｉ，北京：化学化工出版社，２００５［２］肖剑．药理作用靶点法分离纯化紫杉醇（学位论文）［Ｄ］．天津：天津大学，１９９９［３］ＷａｎｉＭＣ，ＴａｙｌｏｒＨＬ，ＷａｌｌＭＥ，ｅｔａ１．Ｐｌａｎｔａｎｔｉｔｕｍｏｒａｇｅｎｔｓ．ＶＩ．Ｔｈｅｉｓｏｌａｔｉｏｎａｎｄｓｔｒｃｔｕｒｅｏｆｔａｘ０１．ａｎｏｖｅｌａｎｔｉｌｅｕｋｅｍｉｃａｎｄａｎｔｉｔｕｍｏｒａｇｅｎｔｆｒｏｍ７ａｘｕｓｂｒｅｖｉｆｏｌｉａ［Ｊ］Ａｍ．ＣｈｅｎＳｏｃ．．１９７１．９３：２３２５［４］ＳｃｈｉｆｆＰＢ，ＦａｎｔＪ，ＨｏｒｗｉｔｚＳＢ．Ｐｒｏｍｏｔｉｏｎｏｆｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅａｓｓｅｍｂｌｙ勘，，１ｔｒｏｂｙｔａｘｏｌ［Ｊ］．Ｎａｔｕｒｅ．１９７９．２７７：６６５［５］马骁驰，吴立军，贾景明．紫杉醇类化合物研究概况与展望［Ｊ］．沈阳药科大学学报，２００２，１９（２）：１４７～１５６［６３ＷｏｏＨＬ，ＳｗｅｎｅｒｔｏｎＫＤ，ＨｏｓｋｉｎｓＰＪ．Ｔａｘｏｌｉｓａｃｔｉｖｅｉｎｐｌａｔｉｎｕｍｒｅｓｉｓｔａｎｔｅｎｄｏｍｅｔｒｉａｌ２９０ａｄｅｎｏｃａｒｅｉｎａｍａ［Ｊ］．ＡｎｎＪＣｌｉｎＯａｃ０１．１９９６．１９（３）：［７］ＪｏｎｅｓＷＢ，ＳｃｈｎｅｉｄｅｒＪ，ＳｈａｐｉｒｏＦ，ｅｔａ１．ＴｒｅａｔｍｅｎｔｏｆｃｈｏｒｌｏｃａｒｃｉｎｏｍａｗｉｔｈＴａｘｏｌ：ＡｒｅｐｏｒｔｏｆｔｗｏｒｅｓｉｓｔａｎｔｇｅｓｔａｔｉｏｎａｌＧｙｎｅｃｏｌｃａｓｅｓ［Ｊ］．Ｏｎｃ０１．１９９６．６１（１）：１２６Ｌ，Ｈｅｔｓａｌ［８］ＰｕｌｄｄｕｉｎｅｎＪｏ，ＥｌｏｍａａＪ，Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ—ｉｎｄｕｃｅｄａｐｏｐｔｏｔｏｃｃｈａｎｔｅｓｆｏｌｌｏｗｅｄｂｙｔｉｅ—ｌａｐｓｅｖｉｄｅｏｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙｉｎｃｅｌｌｌｉｎｉｓｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄｆｒｏｍｈｅａｄａｎｄｎｅｃｋｃａｎｃｅｒ［Ｊ］．ＪＣａｎＣｌｉｎＯｎｃ０１．１９９６．１２２（４）：２１４［９］方唯硕．紫杉醇的化学研究［Ｊ］．中国药物杂志，１９９４，２９（５）：２５９“２６１［１０］ＫｅｉｓｅｙＲ，ＶａｎｃｅＮ．Ｔａｘｏｌａｎｄｃｅｐｈａｌｏｍａｎｎｉｎｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｉｎｅｈｔｆｏｌｉａｇｅａｎｄｂａｒｋｏｆｓｈａｄｅａｎｄｓｕｎ－ｅｘｐｏｓｅｄ［Ｊ］．ＪＮａｔＰｒｏｄ．１９９２．５５（７）：９１２～９１７［１１］王占和．曼地亚东豆杉及其市场前景［Ｊ］．特种经济动植物，２００５，３：３２［１２］祝顺琴，胡凯，谈锋．曼地亚红豆杉枝叶制备紫杉醇浸膏的优化工艺及中试条件的选择［Ｊ］．西南师范大学学报，２００５，３０（２）：３２１～３２４［１３］ＣｒａｇｇＣＭ．，ＳａｕｌＡＳ，ＭａｔｔｈｅｗＳ，ｅｔａ１．Ｔｈｅｔａｘｏｌｓｕｐｐｌｙｅｒｉｓｉｓ：ＮｅｗｔｈｅＬａｒｇｅ—ｓｃａｌｅＮａｔｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆｎｏｖｅｌｎａｔｕｒａｌＮＣＩｐｏｌｉｃｅｓｆｏｒｈａｎｄｉｎｇｐｒｏｄｕｃｔａｎｔｉｃａｎｃｅｒａｎｄ１６６８ａｎｔｉ—ＨＩＶ［Ｊ］．ＪＰｒｏｄ．１９９３．５０（１０）：１６５７～［１４］ＣａｓｔｏｒＴＰ，ＴｈｅｏｄｏｒｅＡＴ．ＤｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｔａｘｏｌｉｎＴａｘｕｓｍｅｄｉａｎｅｅｄｌｅｓ硕士学位论文参考文献ｉｎｔｈｅｐｒｅｓｅｎｃｅｏｆｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ［Ｊ］．ＩＬｉｑＣｈｒｏｍａｔｏｇｒ．１９９３．１６（３）：７２３～７３１［１５］Ｅｄｇｉｎｇｔｏｎ９３３ＳＭ．Ｔａｘｏｌｏｕｔｏｆｔｈｅｗｏｏｄｓ［Ｊ］．Ｂｉｏ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．１９９１．９：［１６］ＣｏｃｉａｎｃｉｃｈＥｒｍａｎｎｏ．Ａｐｒｏｃｅｓｓｆｏｒｔｈｅｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｏｆｔａｘｏｌａｎｄｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓｔｈｅｒｅｏｆｔｈｅｇｅｎｕｓｔａｘｕｓ［Ｐ］．Ｅｕｒｏｐｅａｎ：ＥＰ０５５３７８７０．１９８３［１７］ＭａｎｇａｔａｌＬ，ＡｄｅｌｉｎｅＭＴ，ＧｒｅｅｎｅＡＥ，ｅｔａ１．Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｖｉｃｉｎａｌｏｘｇａｍｉｎａｔｉｏｎｒｅａｃｔｉｏｎｗｉｔｈａｓｙｍｍｅｔｒｉｃｉｎｄｕｃｔｉｏｎｔｏｔｈｅｈｅｍｉｓｙｎｔｈｅｓｉｓｏｆｔａｘｏｌａｎｄａｎａｌｏｇｕｅｓ［Ｊ］．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ．１９８９．４５：４１７７ＡＥ，ＧｕｅｎａｒｄＤ，ｅｔａ１．Ａｈｉｇｈｌｙｅｆｆｉｃｉｅｎｔ．ｐｒａｃｔｉｃａｌ１９８８．１１０：５９１７［１８］ＤｅｎｉｓＪＮ，ＧｒｅｅｎｅａｐｐｒｏａｃｈｔｏｎａｔｕｒａｌＲｔａｘｏｌ［Ｊ］．Ａ皿Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．［１９］ＨｏｌｔｏｎＡ，ＳｏｍａｚａＣ，ＫｉｍＨｙｅｏｎｇ－Ｂａｉｋ，ｅｔａ１．Ｆｉｒｓｔｔｏｔａｌｓｙｎｔｈｅｓｉｓｏｆｔａｘ０１．１．ＦｕｎｃｔｉｏｎｌｉｚａｔｉｏｎｏｆｔｈｅＢ１５９７ｒｉｎｇ［Ｊ］．Ａ儿Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９４．１１６：［２０］ＨｏｌｔｏｎＲＡ，ＫｉｍＨｙｅｏｎｇ—Ｂａｉｋ，ＳｏｍａｚａＣ，ｅｔａ１．Ｆｉｒｓｔｔｏｔａｌｓｙｎｔｈｅｓｉｓｏｆｔａｘ０１．２．ＣｏｍｐｌｅｔｉｏｎｏｆｔｈｅＣａｎｄＤ１５９９ｒｉｎｇ［Ｊ］．Ａ皿Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９４．１１６：［２１］ＮｉｃｏｌａｏｕＫＣ，ＹａｎｇＺ，ＬｉｕＪＪ，ｅｔａ１．Ｄｅｎｉｓｔｙ—ｄｒｉｖｅｎｌｉｑｕｉｄ－ｌｉｑｕｉｄｓｙｓｔｅｍｐｈａｓｅｓｅｐａｒａｔｉｏｎｉｎｔｈｅＡｌ籼一Ｙ２０３［Ｊ］．Ｎａｔｕｒｅ．１９９４．３６７：６３０［２２］Ｎｉｃｏｌａｏｕ１．ＫＣ，ＮａｎｔｅｒｍｅｔＰＧ，ＵｅｎｏＨ，ｅｔａｌ，Ｔａｔｏｌｓｙｎｔｈｅｓｉｓｏｆｔａｘ０１．ａｎｄＲｅｔｒｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ．ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ［Ｊ］．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９５．１１７：６２４［２３］ＮｉｃｏｌａｏｕＣｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎＫＣ，ＬｉｕＪＪ，ＹａｎｇＺ，ｅｔａ１．Ｔｏｔａｌｓｙｎｔｈｅｓｉｓｏｆｔａｘ０１．２．ａｔｔｅｍｐｔｓｔｏｏｆＡａｎｄＣｒｉｎｇｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅｓａｎｄｉｎｔｉｔｉａｌｃｏｎｓｔｒｕｃｔｔｈｅＡＢｃｒｉｎｇｓｙｓｔｅｍ．［Ｊ］Ａ札Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｊ，ｅｔａ１．Ｔｏｔａｌ１９９５．１１７：６３４［２４］ＮｉｃｏｌａｏｕＫＣ，ＹａｎｇＺ，ＬｉｕＪｓｙｎｔｈｅｓｉｓｏｆｔａｘ０１．３．Ｐｏｒｎａｔｉｏｎｏｆｔａｘｏｌ’ＳＡＢＣｒｉｎｇ６４５ｓｋｅｌｅｔｏｎ［Ｊ］．Ａ札Ｃｈｅ吐Ｓｏｃ．．１９９５．１１７：［２５］ＮｉｃｏｌａｏｕＫＣ，ＵｅｎｏＨ，ＬｉｕＪＪ，ｅｔａ１．Ｔｏｔａｌｓｙｎｔｈｅｓｉｓｏｆｔａｘ０１．４．Ｔｈｅｆｉｎａｌｓｔａｇｅａｎｄｃｏｍｐｌｅｔｉｏｎｏｆｔｈｅ１１７：６５３ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ［Ｊ］．Ａ肌Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．．１９９５．［２６］ＳｅｉｅｒｉｅＡ，ＳｔｒｏｂｅｌｆｉｌｍｓＧ，ＳｔｉｅｒｌｅＤ．Ｄｏｍａｉｎａｔｏｍｉｃｆｏｒｃｅｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓｉｎｌａｎｇｍｕｉｒ—ｂｌｏｄｇｅｔｔｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄｂｙｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ［Ｊ］．Ｓｃｉｅｎｃｅ．】９９３．２６０：２】４硕士学位论文参考文献［２７］杨雪峰．紫杉醇植被的研究进展［Ｊ］．化学世界，１９９８，９：９３３［２８］高山林，ＴｏｗｅｒｓＧＨＮ．两种红豆杉属植物细胞培养技术的建立和优化［Ｊ］．中国药科大学学报，１９９４，２５（６）：３２１［２９］甘烦远，郑光植，彭丽萍．红豆杉细胞培养的研究［Ｊ］．云南植物研究，１９９６，１８（２）：１３４［３０］Ｆｅｔｔ－ＮｅｔｏａｓａｓｏｕｒｃｅＡＧ，ＤｉＣｏａｍｏＦ，Ｒｅｙｎｏｌｄｓ’ＷＦ，ｅｔａ１．Ｃｅｌｌｃｕｌｔｕｒｅｏｆｔａｘｕｓｏｆｔｈｅａｎｔｉｎｅｐｌａｓｔｉｃｏｆｔｈｅａｎｔｉｎｅｏｐｌａｓｔｉｃｄｒｕｇｔａｘｏｌｒｅｌａｔｅｄ１５７２ａ１．Ｉｍｐｒｏｖｅｄｇｒｏｗｔｈａｎｄｔａｘａｎｅｓ［ＪＪ．Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．１９９２．１０：［３１］Ｐｅｔｔ－ＮｅｔｏＡＧ，ＭｅｌａｎｓｏｎＳＪ，Ｓａｋａｔａ’Ｋｏ，ｅｔｔａｘｏｌｙｉｅｌｄｉｎｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇｃａｌｌｉｏｆｔａｘｕｓｃｕｓｐｉｄａｔｅｂｙｍｅｄｉｕｎｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．１９９３．１１：７３１［３２］ＣｈｒｉｓｔｅｎｃｏｍｐｏｕｎｄｓｉｎＡＡ，ＧｉｂｓｏｎＤＭ，ＢｌａｎｄｔｈｅｃｅｌｌＪ．Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆｔａｘｏｌｏｒｔａｘｏｌ—ｌｉｋｅｃｕｌｔｕｒｅ［Ｐ］．ＵＳＰａｔｅｎｔ：ＵＳ５０１９５０４．１９９１［３３］张志强，苏志国．氧化铝层析从云南红豆生植物中转化提取紫杉醇［Ｊ］．天然产物研究与开发，２０００，１２（３）：ｌ～６［３４］ＧｕｎｄａＩＧ，ＴｈｏｍａｓＴＣ，１ｗａｏＯ（ｅｄｉｔｏｒ），ｅｔａ１．Ｔａｘａｎｅａｎｔｉｃａｎｃｅｒａｇｅｎｔ［Ｍ］．１９８３［３５］’ＸｕＬＸ。ＬｉｕｂｙＨＰＬＣＡＲ．ＤｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｔａｘｏｌｉｎｔｈｅｅｘｔｒａｃｔｏｆＴａｘｕｓｃｈＹｎｅｎＭｓ［３６］Ｒａｏｍｅｔｈｏｄ［Ｊ］．ＡｃｔａＰｈａｒｎＬ．１９９１．２６（７）：５３７～５４０ＫＶ。ＧａｉｎｅｓｖｉｌｌｅＦｌａ．Ｉｓｏｌａｔｉｎｇａｎｄｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｔａｘｏｌａｎｄｉｔｓｎａｔｕｒａｌａｎａｌｏｇｕｅｓ［Ｍ］．ＵＳＰａｔｅｎｔ：５３８０９１６．１９９５［３７］ＰｏｗｅｌｌｆｒｏｍＴａｘｕｓＲＧ，ＭｉｌｌｅｒＲＷ，ＳｍｉｔｈＣＲ，ｅｔａ１．Ｔａｘｏｌｃｏｎｔｅｎｔａｎｄｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｗａｌｌｌｃｈｉｎａｎ臼］．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｃｏｍｕｎｍ．１９７９．１０２～１０５ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｆｒｏｍｓｅｖｅｒａｌＴａ出ｕｓ［３８］ＣａｒｄｅｌｌｉｎａＪＣ．Ｔａｘｏｌｓｐｅｃｉｅｓ［Ｊ］．Ｌｉｑ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．１９９１．６５９：［３９］ＷｉｔｈｒｕｐＮｅｅｄｌｅｓｓ１４～２０Ｊ，ＭｕｓｃｈｉｋｔｏＫＭ，ＬｏｏｋＳＡ，ＳｔａｓｋｏＭＷ，ＧｈｉｏｒｚｉＴｏｆｔａｘｏｌＧＭ．Ｔａｘｕｓｓｐｐ．ｂａｒｋｏｆＴａｘｕｓｃｏｎｔａｉｎａｍｏｕｎｔｓｃｏｍｐａｒａｂｌｅｔｈｅｂｒｅｖｉｆｏｌｉａ：ａｎａｌｙｓｉｓａｎｄ１２５５ｉｓｏｌａｔｉｏｎ．Ｊ．Ｎａｔ．Ｐｒｏｄ．．１９９０．５３（５）：１２９４～［４０］阎家麒，刘虹，王九一等．东北红豆杉原料中紫杉醇的提取及测定［Ｊ］．中国医药工业杂志，１９９４，２５（７）：５３１［４１］阎家麒，范金城，王九一等．紫杉醇提取纯化工艺．中国医药工业杂志，１９９６，２７（１２）：５３ｌ～５３４［４２］刘凌云．离子交换树脂催化解离键合紫杉醇机理及工艺的研究（学位论文）硕士学位论文参考文献［Ｄ］．天津：天津大学化工学院，１９９８［４３］锅田怎助，田崎弘之，江部洋史等．夕年ｙＩＩ－含有ｐ７，ｏ效率孕抽出方法［Ｐ】．日本：特嗣平，６—１５７３２９，１９９４［４４］徐礼桑，刘爱茹．红豆杉中紫杉醇的高效液相色谱法测定［Ｊ］．药学学报，１９９１，２６（７）：５３７［４５］ＨｏｋｅｂｙｔａｎｄｅｍＳＨ，ＷｏｏｄＩｉｌａｓｓＪｌＩ，ＣｏｏｋｓＲＧ，ｅｔａ１．ＲａｐｉｄｓｃｒｅｅｎｉｎｇｆｏｒｔａｘａｎｅｓＣｈｅｎ．１９９２．６４：２３１３ｍａｓｓｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ［Ｊ］．Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ［４６］Ｋａｓｉｔｕ，ＧｅｒｔｒｕｄｅＣ，Ｎｏａｈ，ｅｔａ１．ＰｒｏｃｅｓｓｆｏｒｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆＧＭＰｐａｃｌｉｔａｘｅｌａｎｄｒｅｌａｔｅｄｔａｘａｎｅｓ［Ｐ］．ＵＳＰａｔｅｎｔ：６４６９１８６．２００２［４７］吴倩，高庆平，王正平．紫杉醇的提取和初分离工艺研究［Ｊ］．化学工程师，２００４，１１０（１１）：４０～４２［４８］赵凯，周东坡．抗癌药物紫杉醇的提取与分离纯化技术［Ｊ］．生物技术通讯，２００４，１５（３）；３０９～４１２［４９］吴倩，何克江，杨义，王正平，杨凌．紫杉醇出分离工艺中的除杂方法比较［Ｊ］．天然产物研究与开发，２００５，１７（３）：３２０～３２４［５０］杨军．紫杉醇的分离纯化及其工艺研究（学位论文）［Ｄ］．天津：天津大学化工学院，２０００［５１］陈振德，郑汉臣，张虹，王洪泉，李金昌．一种制备紫杉醇的新方法［Ｐ］．：中国：１１９７７９６，１９９８［５２］｝［ｅａｔｏｎＤ也Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｆｌｕｉｄｏｆｓｕｐｅｒｃｒｉｔｉｃａｌｔｏｆｌｕｉｄｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｏｆｔａｘａｎｅｓａｎｄａｓｓｕｐｅｒｃｒｉｔｉｃａｌａｎｔｉｃａｎｃｅｒｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙｒｅｓｏｌｕｔｅｔｈｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｄｒｕｇｓ［Ｊ］．Ｈｉｇｈｃｈｒｏｍａｔｏｇｅｒ．１９９３．１６（４）：６６６’６７２［５３］ＶａｎｄａｎａＶ，ＴｅｊａａｎａｌｙｓｉｓｏｆｔａｘｏｌＡＳ，ＺａｌｋｏｗＬＨ．ＳｕｐｅｒｃｒｉｔｉｃａｌｅｘｔｒａｃｔｉｏｎａｎｄＨＰＬｃｆｒｏｍＴａｘｕｓｂｒｅｖｉｆｏｌｉａｕｓｉｎｇＯｘｉｄｅａｎｄＮｉｔｒｏｕｓＯｘｉｄｅ＋Ｅｔｈａｎｏｌｍｉｘｔｕｒｅｓ［Ｊ］．１９９６．１１６：１６２～１６９［５４】元英进，那平，胡宗定，王道宾，何炳林．东北红豆杉提取物吸附法脱色的初步探讨［Ｊ］．离子交换与吸附，１９９４，１０（６）：５４３～５４５［５５］张志强，田桂莲，冯小黎等．从红豆杉树皮浸膏中提取紫杉醇出分离工艺研究［Ｊ］．中国生化药物杂志，１９９９，２０（２）：５８～６１［５６］李春斌，佟憬憬，范圣第．东北红豆杉中紫杉醇的提取纯化与ＨＰＬＣ检测［Ｊ］．大连民族学院报，２００５，７（５）：２２～２５［５７］刘松青，高振同，代青，张春华．咿Ｌｃ法测定红豆沙皮粗提物中紫杉醇的含量［Ｊ］．第三军医大学学报，２０００，２２（４）：３９２～３９４［５８］张沿军，李铣，吴立军．东北紫杉茎皮化学成分的研究［Ｊ］．中草药，１９９６，５７硕士学位论文参考文献２７（４）：２００［５９］方唯硕，霍然，方起程．紫杉醇前体化合物ｌＯ—ｌ去乙酰ｂａｃｃａｔｉｎＨＩ和ｂａｅｃａｔｉｎｌ］／在东北红豆杉中的含量［Ｊ］．中草药，１９９６，２７（６ｈ３３９［６０］阎家麒，周海龙，周龙云等．紫杉醇原料纯度的ＨＰＬＣ测定［Ｊ］．中国医药工业杂志，１９９６，２７（１０）：４５５［６１］王宁．云南东豆杉不同部位中紫杉醇及其相关化合物的含量［Ｊ］．中草药，１９９７，２８（３）：１８９［６２］王交芝．西藏红豆杉中紫杉醇及其相关紫杉烷类含量的高效液相色谱分析［Ｊ］．色谱，１９９７，１５（３）：２５４～２５７［６３］ＫｅｔｃｈｕｍＲＥＢ．ＧｉｂｓｏｎＤ虬ＲａｐｉｄｉｓｏｅｒａｔｉｃｒｅｖｅｒｓｅｄｐｈａｓｅＨＰＬＣｏｆｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙｆｏｒｔａｘｏｌｔａｘａｎｅｓｏｎｎｅｗｃｏｌｕｍｓｄｅｖｅｌｏｐｅｄａｎａｌｙｓｉｓ［Ｊ】．Ｌｉｑ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．１９９３．１６（１２）：２５１９［６４］王立斌，董丽红，王冬梅，潘亚茹．甲醇一正己烷部分互溶双液系液一液平衡相图绘方法的研究（１）［Ｊ］．通化师范学院学报，２００３，２４（４）：２ｌ～２３［６５］刘建国，秦张峰，王建国．水一正已烷一甲醇体系的液液平衡研究［Ｊ］．燃料化学学报，２００１，２９（５）：４６８～４７０［６６］北京医学院等主编．中草药成分化学．北京：人民卫生出版社．１９８０：７～１１［６７］Ｗｉｔｈｅｒｕｐｓｐｐ．ＮｅｅｄｌｅｓＫＭ，ＬｏｏｋＳＡ，ＳｔａｒｓｋｏＭＷ，ＧｈｉｏｒｚｉＴＪ，ＭｕｓｃｈｕｉｋＧＭ．ＴａｘｕｓｃｏｎｔａｉｎａｍｏｕｎｔｓｏｆｔａｘｏｌｃｏｍｐａｒａｂｌｅｔｏｔｈｅｂａｒｋｏｆＴａｘｕｓｂｒｅｖｉｆｏｌｉａ：ａｎａｌｙｓｉｓａｎｄｉｓｏｌａｔｉｏｎ，Ｊ．Ｎａｔ．Ｐｒｏｄ，１９９０，５３（５）：１２４９～１２５５［６８］王俊德．色谱，１９８７，５（２）：８６［６９］ＨｏｒｖａｔｈＣ．ＪＣｈｒｏｍａｔｏｇｒ，１２５～１２９，１９７６［７０］ＨｏｒｖａｔｈＣ．Ａｎａｌ．ｔｈｅｍ。４９～１４２，１９７７［７１３林元藻，王风山，王转花．生化制药学，北京：人民卫生出版社，１９９８：２４［７２］严希康．生物分离技术．上海：华东理工大学出版社，１９９６：６９，船硕士学位论文致谢致谢本文是在导师周春山教授的悉心指导下完成的，在论文选题、试验研究和论文撰写与修改的全过程中均倾注了导师的许多心血。导师渊博的学识、严谨的治学态度以及对我的谆谆教诲将对我今后的工作和学习产生深远的影响，使我终生受益。在此，谨向导师致以最诚挚的敬意和最衷心的感谢！并祝导师万事顺意，身体健康。感谢师母张胜华教授对我学习工作上的热情支持与帮助，以及对我生活上无微不至的关心。感谢汤建萍、杜邵龙、周尽花、谢红旗、周小芬、贺国文、华怀杰、张春静等在试验过程中给予我极大的帮助。在试验中得到袁周率、乔容、李维等的关心与帮助，在此表示由衷的谢意。感谢钟世安、蒋新宇老师以及中南大学化学化工新技术研究所的全体老师，感谢他们在工作中给予我的热情帮助。感谢所有给予我关心和帮助的老师、同事、同学和朋友们。５９硕士学位论文攻读硕士学位期间主要研究成果攻读硕士学位期间主要研究成果一．攻读硕士学位期间发表的期刊文章１．第一作者，ＨＰＬＣ测定曼地亚红豆杉枝叶中紫杉醇的含量．应用化工，２００７，３６（１），８４—８６２．第三作者，熊果酸与齐敦果酸高效液相色谱分离条件优化．广州化学，３１（４），２６－３０二．攻读硕士学位期间参与的科研项目１．茶多酚的提取及有机膜、无机膜分离提纯茶叶粗提液的研究，湖南省科技厅湖南省攻关项目，项目计划编号：０１ＧＫＹ２０７２６０曼地亚红豆杉中紫杉醇的提取分离工艺及测定研究

作者：

学位授予单位：

王志刚中南大学

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