Transwell实验原理与操作步骤

Transwell实验，也被称为细胞侵袭实验，是一种研究细胞迁移和侵袭能力的实验方法。其基本原理是将小室放入培养板中，小室内称为上室，培养板内称为下室，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔。上室内添加上层培养液，下室内添加下层培养液，并将研究的细胞种在上室内。由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞生长、运动等。在进行不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜的实验时，可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。

在肿瘤细胞侵袭实验中，需在聚碳酸酯膜上侧铺一层基质胶，用以模仿细胞外基质。肿瘤细胞必须分泌基质金属蛋白酶（MMPs）将基质消化了才能进入下室（这与体内情况较为相似）。最后通过计算进入下室的细胞量即可反应细胞的侵袭能力。有侵袭能力的细胞才可用于Transwell侵袭实验。建议实验前先用明胶酶谱法检测MMPs的表达，特别是MMP-2的表达。

Transwell实验的具体操作步骤如下：

1. 实验前的准备工作：需要提前一天将Matrigel胶（一种人工合成的细胞外基质）从冰箱中取出，放置在冰盒上融化。同时，将24孔板、枪头、离心管等实验器材也放置在冰盒中预冷。

2. 基质胶铺板：将融化好的Matrigel胶与无血清培养基按照1:8的比例混合，然后用预冷的枪头将混合液均匀铺设在Transwell小室的上室底部，注意要避免产生气泡。铺好后将小室放入37℃的培养箱中孵育30分钟，使Matrigel胶凝固。

3. 细胞处理：将需要研究的细胞进行传代或复苏，并用无血清培养基洗涤两次，然后用胰酶消化并计数。

4. 接种细胞：将计数好的细胞用无血清培养基重悬，然后取适量细胞悬液加入到Transwell小室的上室中，注意要保证每个小室的细胞数量一致。

5. 添加培养液：在上室和下室中分别添加适量的含血清培养基，上室的培养基中可以含有研究药物或其他处理因素。

6. 培养细胞：将Transwell小室放入37℃的培养箱中培养24-48小时，具体时间可以根据研究目的和细胞类型进行调整。

7. 固定和染色：培养结束后，将Transwell小室取出，用PBS洗涤两次，然后用4%的多聚甲醛固定细胞15分钟。固定结束后用PBS洗涤两次，然后用0.1%的结晶紫染色15-30分钟。

8. 计数细胞：染色结束后用PBS洗涤两次，然后用棉签轻轻擦去上室内的细胞，然后在显微镜下观察并计数穿过Matrigel胶进入下室的细胞数量。可以使用ImageJ等软件进行细胞计数。

9. 数据分析：将计数结果输入到Excel或其他数据分析软件中，进行统计分析并绘制图表。

需要注意的是，Transwell实验的操作步骤可能会因为不同的研究目的和细胞类型而略有不同，具体操作步骤可以参考相关文献或实验指南。