脂肪干细胞在皮肤组织创面修复中的研究进展

刘宁华;杨欣荣;顾建英

【期刊名称】《中国临床医学》 【年(卷),期】2012(019)005 【总页数】4页(P568-571) 【作 者】刘宁华;杨欣荣;顾建英

【作者单位】复旦大学附属中山医院整形外科,上海,200032;复旦大学附属中山医院肝外科,上海,200032;复旦大学附属中山医院整形外科,上海,200032 【正文语种】中 文 【中图分类】R751

严重机械压榨伤、大面积烧伤后常出现大面积的皮肤组织创面，由于皮肤软组织大量缺损，深部组织过多暴露，伤口污染严重，导致创面难以愈合。皮瓣或皮片移植术作为临床上较为常用的治疗手段，虽然其成功率高、费用较低，但由于存在供皮区组织缺损、瘢痕形成以及疼痛等缺点，从而限制了其临床应用。真皮替代物缺乏血管结构，血管化过程慢，并且缺乏抗感染能力，导致移植成活率较低。目前，干细胞的应用为皮肤组织创面修复提供了新的方法，表皮干细胞、骨髓间充质干细胞、脂肪干细胞（adipose－derived stem cells，ADSCs）等多种干细胞被选择作为修复皮肤组织创面的种子细胞［1］。其中表皮干细胞数目有限，且需损伤皮肤；骨髓间充质干细胞来源于骨髓，取材困难，术后不良反应较多［2］；脂肪干细胞

作为自我更新和多分化潜能的干细胞，具有取材方便、来源充足等优点，它可以结合生物相容性支架和细胞因子，植入皮肤组织缺损处，诱导脂肪干细胞向皮肤表皮细胞分化，修复皮肤组织创面［3］。该技术可以及时覆盖创面、减少创面收缩和瘢痕增生，克服了供皮区出现的组织缺损和疤痕形成等问题，为皮肤组织创面修复提供了简单、安全、有效的途径。 1 ADSCs的分离、培养以及鉴定

ADSCs是从脂肪组织中分离培养的成纤维样细胞群，在皮下白色脂肪组织中占细胞总量的10%～20%。ADSCs可来源于人类、犬、猪、兔、大鼠、小鼠等，其培养方法大同小异。将脂肪组织冲洗数遍后剪成1 mm3碎片，加入2倍于脂肪体积的0.1%Ⅰ型胶原酶，在37℃恒温箱中以200 r／min的速度搅拌40～60 min，1200 r／min离心5 min，获得高密度的细胞沉淀物，弃去上清液和漂浮的脂肪组织，加磷酸缓冲液（PBS）将细胞重悬后再次离心，加入10%胎牛血清的DMEM重悬，将细胞收集培养。24 h后首次换液，以后每2 d换液［3］。研究［4］显示ADSCs培养对营养成分要求不高，在低血清或无血清的条件下也能正常生长，保持较高的增殖能力，但在体积分数0.5%人血清培养情况下倍增时间为1.86 d，而在无血清情况下倍增时间为5.79 d。人的ADSCs由于获得方式不同而有所差异，脂肪抽吸术获得的干细胞含量是标准切除术的1.8倍，并且在成脂肪能力方面，前者是后者的1.6倍［5］。研究［6］显示ADSCs大部分来源于中胚层，在不同的药物及化学诱导剂条件下可以分化成成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、神经细胞等细胞。有关ADSCs特异性表面标志至今仍无统一认识，虽然免疫组化染色和流式细胞仪检测等免疫表型的结果表明，CD9、CD29、CD44、CD49、CD54、CD90、CD105和CD166等呈阳性，而CD50、CD56以及HLA－DR等呈阴性。但有关ADSCs特异性表面标志至今仍无统一认识，这种差异可能与细胞分离、培养和纯化方法存在差异有关。

2 ADSCs参与组织创面修复的机制

Gimble等［7］分析 ADSCs细胞周期发现，G0～G1期比例为82.1%，S期比例为15.2%，G2～M期比例为2.8%，大部分ADSCs出于静止阶段，只有少数细胞处于活跃的增长期，这表明当机体出现炎症、创伤等应激因素时，ADSCs才被激活，发挥修复重建的作用。组织受到创伤后，局部血管收缩、血液和细胞渗出以及血管活性因子激活等诱发凝血过程，血凝块提供了供细胞黏附和迁移的基质。创面的早期修复大致可以分为3个阶段：炎症细胞的浸润、肉芽组织的形成和组织创面的修复重建。

2.1 炎症细胞浸润期 在创面愈合炎症期的早期，机体免疫系统被激活引起中性粒细胞和单核细胞浸润，并在组织中转化为巨噬细胞。这些炎症细胞不仅能够吞噬入侵微生物，而且还能释放一系列的细胞因子和生长因子，促进创面的修复，使创面由炎症期过渡至增殖期。Rehman等［8］利用发现，人ADSCs在增殖分化的过程中，会分泌大量的细胞因子和生长因子，从而促进创面的早期修复。Kim等［9］将ADSCs与皮肤成纤维细胞共培养，发现ADSCs能通过旁分泌功能影响成纤维细胞的增殖、胶原合成以及迁移能力。这些细胞因子的释放，有利于为机体建立更好的损伤修复微环境，从而促进创面的早期修复［10］。

血小板衍生生长因子（platelet derived growth factor，PDGF）能刺激成纤维细胞、神经胶质细胞、血管内皮细胞和平滑肌细胞的分裂增殖。有研究［11］显示，抽脂术后的脂肪组织经离心得到的中层纯化脂肪组织中存在有大量的PDGF－BB、血管内皮细胞生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）和碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）等生长因子。VEGF能增加血管通透性，促进血管内皮细胞增殖，促进血管形成。Lu等［12］将转染VEGF的ADSCs皮下注射入裸鼠，发现VEGF能显著提高自体脂肪移植后新生血管的数量和移植脂肪的存活率。bFGF能够促进成纤维细胞生长，它在维持

神经组织生长发育过程、促进创伤愈合与组织修复中起着十分重要的作用。肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor，HGF）是一种能刺激原代培养的肝细胞生长和DNA合成的肝源性因子，具有类似散射因子的功能，可促进细胞扩散和迁移。在糖尿病小鼠的模型中，HGF能扩大肉芽组织的面积和刺激新生血管生成，它在难治性溃疡的愈合过程中起重要作用［13］。Zhu等［14］应用慢病毒载体转染的方法将人HGF在ADSCs中过表达，然后将ADSCs由尾静脉注射入急性心肌梗死的裸鼠体内，发现HGF通过促进血管生成、抗纤维化、抗炎等功能促进小鼠左心室功能的重建。胎盘生长因子（placental growth factor，PLGF）可诱导内皮细胞增殖、迁移，抗内皮细胞凋亡，并能增加血管的通透性。PLGF基因敲除的小鼠出现以新生血管减少为特征的愈合延迟，表示PLGF与伤口愈合过程中新生血管的生成有关［15］。角化细胞生长因子（keratinocyte growth factor，KGF）是由皮肤成纤维细胞合成分泌的促进毛发生长的因子。Peng等［16］发现，KGF的缺失会导致糖尿病小鼠的创面愈合延迟，并推测糖尿病小鼠的上皮细胞和间充质的相互作用与KGF有关。转化生长 因 子－β1（Transforming growth factor beta，TGF－β1）可以影响多种细胞的生长、分化、细胞凋亡及免疫调节等功能。TGF－β1通过吸附嗜中性粒细胞、巨噬细胞和成纤维细胞至创面处，促进细胞外基质如胶原蛋白、纤黏连蛋白的表达，并抑制细胞外基质（extracellular matrix，ECM）的降解，有利于创面的修复重建。

2.2 肉芽组织形成期 在创面愈合的增殖期，由巨噬细胞、血管内皮细胞和成纤维细胞组成的肉芽组织开始填补创面，随着肉芽组织逐渐上皮化而完成创面的早期修复。Kim等［9］将ADSCs与表皮成纤维细胞共培养，发现ADSCs能促进成纤维细胞的增殖与迁移，并且与ADSCs的细胞量呈正相关。此外，ADSCs还能抑制UVB导致的成纤维细胞的凋亡［17］。创面愈合过程中，由成纤维细胞合成和分泌的ECM主要为纤维素和纤维黏连蛋白，ECM与细胞外表面受体相互作用，

纤维连接蛋白、胶原等成分为接触导向提供支架，控制细胞的黏附和细胞迁移的方向，促进细胞黏附、迁移和增殖。

2.3 创面修复重建期 上皮化后，细胞增殖及新生血管化停止，瘢痕组织开始形成，创面修复进入重塑期，瘢痕基质的形成与瘢痕降解最终趋于平衡。疤痕的存在使得创面的机械性能降低，同时造成了氧和营养物质交流的障碍，严重时可能引起受损组织的畸形以及功能障碍。干细胞在此阶段有着重要的作用，由于干细胞存在多向分化潜能，在机体损伤时可分化成为成内皮细胞、纤维细胞以及表皮细胞，有效地避免疤痕的形成。但是ADSCs向表皮细胞的诱导分化未有标准方案，现在运用较多的为条件培养基加全反式维甲酸、表皮生长因子或者碱性成纤维细胞生长因子。Brzoska等［18］发现，全反式维甲酸可以诱导脂肪源性干细胞向上皮细胞分化，蛋白质印迹实验发现诱导组的角化蛋白18的蛋白表达显著升高。 3 影响ADSCs增殖分化的信号通路

ADSCs增殖分化的潜能可能与供体的情况有关，比如种属来源、组织部位、年龄、性别、传代次数等。低倍镜下ADSCs呈成纤维细胞样生长，胞浆和核仁丰富，呈平行或漩涡样排列。在胎牛血清的存在条件下传代培养的ADSCs 2～3d增殖1倍。多次传代（10～20代）后，细胞增殖速度并不显著减慢，在传代6次后细胞群体中出现衰老细胞，第15代细胞群体中衰老细胞约占15%。迄今借助蛋白质印迹和逆转录聚合酶链反应等技术检测特定蛋白质或者基因在细胞或组织中的表达情况发现，调节激酶（ERK）、PI3K－AKT 以及骨形成发生蛋白－4（BMP4）等涉及的信号通路传导系统可能与ADSCs的增殖有关，Wnt－βcatenin、PI3K－Akt、Notch、P38－MAPK、ERK－MAPK等信号传导通路可能与ADSCs的定向分化相关。

在哺乳动物机体中，转导通路丝裂原激活蛋白激酶（MAPK）家族中主要存在三条不同的信号传导通路：ERK、c－Jun氨基末端激酶（JNK）和 P38。其中ERK－

MAPK通路主要转导导致细胞分化和增殖的生长因子信号，诱导细胞增殖。ERK激活的最常见的信号通路是Raf－MEK－ERK，这3种激酶定位于细胞膜上，通过Ras与其上游被激活的酪氨酸激酶受体相连。激活的ERK可使多种底物发生磷酸化，发挥对下游元件的调节作用。Jin等［19］发现淫羊藿甙能诱导老鼠的ADSCs向心肌细胞分化，并且这种分化功能可以被ERK的抑制剂特异性阻断，并提出ERK通路可能与ADSCs向心肌细胞分化有关。Yu等［20］应用旋转生物反应器为ADSCs的生长提供空间微重力效应，发现ADSCs向软骨细胞分化的过程中有P38－MAPK通路的激活。

Wnt通路是一条比较保守的信号传导通路，从低等生物果蝇直至高等哺乳动物，其成员都具有高度的同源性。目前认为Wnt通路的成员主要包括：细胞外因子（Wnt）、跨膜受体、胞质蛋白（β－catenin）及核内转录因子（TCF）等一系列蛋白。当细胞外因子与受体结合后，通过一系列胞质蛋白的相互作用使β－catenin蛋白在胞质内累积而进入核与转录因子TCF共同作用，激活靶基因的转录。从黄豆中提取的异黄酮可以抑制脂肪形成和沉积。有研究［21－22］发现，异黄酮中的染料木碱和黄豆苷元可以通过Wnt－βcatenin信号通路抑制ADSCs向脂肪细胞分化。

PI3K是一个复杂的大家族，其中I型PI3K又分为IA和IB2个亚型，他们分别从酪氨酸激酶连接受体和G蛋白连接受体传递信号，其作用是催化磷脂酰肌醇在D3位的磷酸化，将底物3，4－二磷酸磷脂酰肌醇（PIP2）转化为3，4，5－三磷酸磷脂酰肌醇（PIP3）。PIP3与细胞内含有PH结构域的信号蛋白Akt和PDK1结合，促使PDK1磷酸化Akt蛋白的Ser308导致Akt的活化。层黏连蛋白－111（Laminin－111）能促进轴突再生以及神经元干细胞分化，Park等［23］应用特异性抑制剂和RNA干扰技术发现Laminin－111是通过PI3K－AKT信号传导通路促进ADSCs向神经细胞分化。PD508是一种人工合成的多肽凝血酶，在动

物实验中证明能促进新生血管的生成和伤口愈合，Freyberg等［24］发现PD508通过PI3K－AKT信号传导通路有促进ADSCs增殖。 4 ADSCs在修复皮肤组织创面中的应用

当机体遭受严重绞压伤、烧伤时，如何修复大面积的皮肤组织创面成为了临床上亟待解决的难题。皮肤干细胞存在于正常皮肤的表皮基底层和毛囊中，在创伤等应激因素条件下被激活，进而修复组织创面。但是大面积的皮肤缺损造成了皮肤干细胞的缺失，此时机体很难通过自身修复来愈合创面。ADSCs来源于脂肪组织，获取容易且量大，创伤小，体外培养方便且稳定，成为修复皮肤组织创面的新方法。 ADSCs在脂肪移植的修复过程中及在脂肪化和血管化中起着重要的作用，它可调节周围组织中生长激素及细胞因子的释放，使脂肪组织的再生和凋亡达到平衡。ADSCs配合应用多种可注射支架材料，不仅为ADSCs的生长提供了良好的类ECM样结构，还有利于组织血管的形成和ASCs向脂肪组织的转归，提高了脂肪组织的成活率。Yoshimura等［25］对307例采用细胞辅助吸脂手术的患者进行临床研究，结果显示患者对移植后皮肤的自然纹理、柔软度、软组织填充后的塑形等都表示满意。Kim等［10］报道，ADSCs可以分泌各种皮肤生长因子如bFGF，IGF等，来促进成纤维细胞增殖，并具有抗光老化、抗氧化、抗皱、抗紫外辐射等作用。 5 展 望

综上所述，ADSCs取材容易、供应充足、损伤较小，已成为干细胞研究领域的新热点，ADSCs分化为表皮细胞对临床上解决严重创伤，大面积烧伤患者的皮肤来源紧张问题和促进难愈创面的修复等问题提供了很好的解决方法。但是在广泛用于临床之前，仍有许多问题需要解决，如免疫排斥反应、向其他组织诱导分化研究等。另外，针对ADSCs的研究大多是在体外或者动物体内进行，在人体内复杂的各种体液因子调控下的状况尚不清楚。随着分子生物学和细胞生物学的迅速发展，促生

长分化的各种生物因子以及模拟体内微环境的细胞外基质等均将成为研究热点，这将为ADSCs成为现代表皮细胞组织工程学研究的理想种子细胞并将其最终用于以细胞为基础的临床治疗提供前提和保障。 参考文献

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