艋扬镰 ２０１６，４２（６）：１００—１０４ Ｐｌａｎｔ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ 辣椒黄脉病毒ＲＴ－ＬＡＭＰ快速检测方法的建立 汤亚飞 ， 何自福 ， 余小漫 ， 蓝国兵 （１．广东省农业科学院植物保护研究所，广州摘要５１０６４０；２．广东省植物保护新技术重点实验室，广州５１０６４０） 辣椒黄脉病毒（Ｐｅｐｐｅｒｖｅｉｎ ｙｅｌｌｏｗｓ ｖｉｒｕｓ，ＰｅＶＹＶ）是影响世界辣椒生产的重要病毒，也是广东省辣椒上主 要病原病毒之一。本研究根据ＰｅＶＹＶ基因组Ｐ３蛋白基因序列设计了２对引物，建立了该病毒的反转录一环介导 等温扩增（ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｌｏｏｐ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ＲＴ Ｉ ＡＭＰ）检测方法。该方法７０ ｒａｉｎ便可 完成对ＰｅＶＹＶ的检测，无需特殊的设备，灵敏度比普通ＲＴ ＰＣＲ高１Ｏ倍，对田问疑似病样的检出结果与ＲＴ－ＰＣＲ 的结果一致。本研究建立的ＰｅＶＹＶ ＲＴ－ＬＡＭＰ检测方法具有快速、灵敏和操作简便等优点，适合于对ＰｅＶＹＶ病 样快速、准确检测与鉴定。 关键词辣椒黄脉病毒； ＲＴ－ＬＡＭＰ； 快速检测 文献标识码：Ａ ＤＯ！：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．０５２９—１５４２．２０１６．０６．０１７ 中图分类号：Ｓ ４３６．４１８ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ＲＴ－ＬＡＭＰ ｆｏｒ ｒａｐｉｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｅｐｐｅｒ ｖｅｉｎ ｙｅｌｌｏｗｓ ｖｉｒｕｓ Ｔａｎｇ Ｙａｆｅｉ ，Ｈｅ Ｚｉｆｕ ，Ｓｈｅ Ｘｉａｏｍａｎ ，Ｌａｎ Ｇｕｏｂｉｎｇ （１．Ｐｌａｎｔ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，ＧｕａｎｇｄｏｎｇＡｃａｄｅｍｙ ｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ ５１０６４０，Ｃｈｉｎａ； ２．ＧｕａｎｇｄｏｎｇＰｒｏｖｉｎｃｉａｌ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ ｇｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｆｏｒ Ｐｌａｎｔ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ．Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ ５１０６４０．Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｐｅｐｐｅｒ ｖｅｉｎ ｙｅｌｌｏｗｓ ｖｉｒｕｓ（ＰｅＶＹＶ）ｉＳ ａｎ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｖｉｒｕｓ ｏｆ ｐｅｐｐｅｒ ｗｏｒｌｄｗｉｄｅ．Ｉｔ ｉＳ ａｌｓｏ ｏｎｅ ｏｆ ｔｈｅ ｍａｉｎ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ｖｉｒｕｓｅｓ ｉｎｆｅｃｔｉｎｇ ｐｅｐｐｅｒ ｉｎ Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ．Ｂｙ ｕｓｉｎｇ ｐｒｉｍｅｒ ｅｘｐｌｏｒｅｒ ｓｏｆｔｗａｒｅ，ｔｗｏ ｐａｉｒｓ ｏｆ ｐｒｉｍｅｒｓ ｗｅｒｅ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ａｃｃｏｒｄｉｎｇ ｔｏ ｔｈｅ Ｐ３ ｇｅｎｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ＰｅＶＹＶ．Ｔｈｅ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｌｏｏｐ—ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏ— ｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＲＴ—ＬＡＭＰ）ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ＰｅＶＹＶ ｗａｓ ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ．Ｔｈｅ ＰｅＶＹＶ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｆｉｎｉｓｈｅｄ ｗｉｔｈｉｎ ７０ ｍｉｎ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ｔｈｉｓ ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ ｎｅｅｄｓ ｎｏ ｓｐｅｃｉａｌ ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ．Ｉｔｓ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｗａｓ １０ ｔｉｍｅｓ ｈｉｇｈｅｒ ｔｈａｎ ｔｈａｔ ｏｆ ｏｒｄｉｎａｒｙ ＲＴ—ＰＣＲ．Ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｒｅｓｕｌｔ ｏｆ ｓｕｓｐｅｃｔｅｄ ｓａｍｐｌｅｓ ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ ｆｒｏｍ ｆｉｅｌｄｓ ｂｙ ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄ ｗａｓ ｃｏｎｓｉｓｔｅｎｔ ｗｉｔｈ ｔｈａｔ ｂｙ ＲＴ．ＰＣＲ．Ｔｈｅ ａｄｖａｎｔａｇｅｓ ｏｆ ＲＴ．ＬＡＭＰ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ＰｅＶＹＶ ｗｅｒｅ ｒａｐｉｄ，ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ａｎｄ ｓｉｍｐｌｅ．Ｈｅｎｃｅ。ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄ ｉＳ ｓｕｉｔａｂｌｅ ｆｏｒ ｒａｐｉｄ ａｎｄ ａｃｃｕｒａｔｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＰｅＶＹＶ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ Ｐｅｐｐｅｒ ｖｅｉｎ ｙｅｌｌｏｗｓ ｖｉｒｕｓ： ＲＴ—ＬＡＭＰ： ｒａｐｉｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ 辣椒黄脉病毒（Ｐｅｐｐｅｒ ｖｅｉｎ ｙｅｌｌｏｗｓ ｖｉｒｕｓ，Ｐｃ－ ＰｅＶＹＶ的检测主要采用反转录聚合酶链式反应 （ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ－ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ， ＶＹＶ）属黄症病毒科（Ｌ 。 ｒ 以Ｐ）马铃薯卷叶病 毒属（Ｐｏｌｅｒｏｖｉｒｕｓ）成员，由蚜虫以持久方式传播，也 可以嫁接传播［ 。该病毒在日本［卜 、西班牙跚、突 尼斯、土耳其＿４］、印度、印度尼西亚、菲律宾、泰国［ 、 苏丹［ 和美国［ ］等国家均有分布。我国的台湾［引、 ＲＴ－ＰＣＲ）ｌ＿６ ］。相对于血清学检测方法，该方法较 快速（６ ｈ左右）、灵敏和特异，但需要高精度的ＰＣＲ 仪及较复杂的方法来检测扩增产物，使其在日常诊 断中受到限制。日本学者Ｎｏｔｏｍｉ等开发了一种新 型的核酸扩增方法——环介导等温扩增（１ｏｏｐ ｍｅｄｉ— ａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ＬＡＭＰ）技术ｌ１ 。该 湖南｜＿８］和山东＿９ 等省也先后报道了该病毒。辣椒感 染黄脉病毒后主要表现为叶脉黄化、叶片卷曲、节问 缩短等，其产量和品质受到严重影响。 建立快速、灵敏和特异的检测鉴定方法是植物 病毒病诊断、防治和预测预报的前提与基础。目前， 技术采用４条特异引物识别靶序列上６个特异区 域，利用ＤＮＡ链置换聚合酶（Ｂｓｔ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒ— ａｓｅ）在恒温条件下对靶基因扩增。ＲＴ ＬＡＭＰ方法 收稿日期：２０１５—１２－１６ 修订日期：２０１６—０２—０４ 基金项目：公益性行业（农业）科研专项（２０１３０３０２８）；广东省科技计划项目（２０１３Ｂ０２０３０９００３；２０１４１３０７０７０６０１７） ＊通信作者 Ｅ－ｍａｉｌ：ｈｅｚｆ＠ｇｄｐｐｒｉ．ｃｏｒｎ ４２卷第６期 汤亚飞等：辣椒黄脉病毒ＲＴ－ＬＡＭＰ快速检测方法的建立 ・１０１・ 是在ＬＡＭＰ方法的基础上添加了反转录酶 （ＡＭＶ），使反转录和扩增在同一温度下进行。相对 ＲＴ－ＰＣＲ来说，该技术更加简便、快速（７０ ｍｉｎ左 右）、特异。该技术已被应用于番茄＿１卜地］、柑 橘［１３％４］、香蕉 引、水稻［１６－１７］、小麦Ｅ 、马铃薯［１９－２１］、 草莓 船］、兰花Ｅ粥 等多种作物的病毒病检测。本文以 ＰｅＶＹＶ的Ｐ３蛋白基因序列为靶标基因，设计了４ 条特异性引物，建立了该病毒的ＲＴ—ＬＡＭＰ快速检 测方法。 １材料与方法 １．１材料 感染Ｐ 的辣椒病样：采自广东茂名市辣椒产 区，经ＲＴ＿王）（、Ｒ检测验证，置于一８０￣Ｃ保存；健康辣椒 材料：本实验室在防虫温室中培育的健康辣椒叶片；待 检材料：采自广东省各辣椒产区疑似辣椒病叶。 Ｌｏｏｐａｍｐ ＲＮＡ扩增反应试剂盒、Ｌｏｏｐａｍｐ ＦＤ 荧光检测试剂购自日本Ｅｉｋｅｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ公司；ＲＮＡ 提取试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司；一 步法Ｒｒｒ＿ＰＣＲ试剂盒购自宝生物工程（大连）有限 公司；ＬＡ－３２０Ｃ实时浊度仪由日本Ｅｉｋｅｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ 公司提供。 １．２方法 １．２．１引物设计 依据ＧｅｎＢａｎｋ中已登录的ＰｅＶＹＶ基因组 （ＧｅｎＢａｎｋ序列登录号：ＡＢ５９４８２８．１、ＫＰ３２６５７３．１） 的Ｐ３蛋白基因序列，应用ＬＡＭＰ引物设计软件 Ｐｒｉｍｅｒ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ Ｖ．４（ｈｔｔｐ：／／ｐｒｉｍｅｒｅｘｐｌｏｒｅｒ．ｊｐ／ｅｌ— ａｍｐ４．０．Ｏ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍ１）设计外侧引物对Ｆ３和Ｂ３以 及内侧引物对ＦＩＰ和ＢＩＰ，将引物在ＮＣＢＩ数据库 中Ｐｒｉｍｅｒ—ＢＬＡＳＴ模块下进行比对验证，最终选出 用于ＲＴ—ＬＡＭＰ的引物组合（表１）。应用ＰＣＲ引 物设计网站（ｈｔｔｐ：／／ｐｒｉｍｅｒ３．ｕｔ．ｅｅ／），设计目的片 段为５６２ ｂｐ的特异引物对Ｐ—Ｆ／Ｐ—Ｒ（表１）用于Ｐｅ— ＶＹＶ的ＲＴ－ＰＣＲ检测。所有引物由上海生工生物 工程技术服务有限公司合成。 １．２．２ 总ＲＮＡ的提取 取辣椒病叶１００ ｍｇ，应用ＲＮＡ提取试剂盒 抽提其总ＲＮＡ，根据试剂盒说明书的步骤进行操 作，最终ＲＮＡ沉淀溶解于４０ Ｌ ＤＥＰＣ处理的 ｄｄＨ２Ｏ中。 １．２．３ ＲＴ＿ＬＡＭＰ反应体系及最佳反应温度 按照Ｌｏｏｐａｒｎｐ ＲＮＡ扩增试剂盒的说明配制ＲＴ－ ＬＡＭＰ反应体系，即：２×反应缓冲液１２．５止，酶溶液 １．０ ，４０ ｐｍｏｌ／ 引物 １．０ ，４０ ｐｍｏｌ／ 引物 ＢＩＰ １．０ ，１０ ｐｍｏｌ／ 引物Ｆ３ ０．５ ，１０ ｐｍｏｌ／ 引 物ｔ３３ ０．５ ，荧光目视检测试剂１．０ ，ＲＮＡ模板 １．０ Ｌ，去离子水６．５ Ｌ，反应总体系为２５ Ｌ。反 应温度分别设为５９℃、６１。Ｃ、６３℃和６５℃，反应时 间为６０ ｍｉｎ，之后加热至８０℃５ ｍｉｎ使酶失活。扩 增反应在实时浊度仪上进行，根据６０ ｍｉｎ内出现扩 增曲线的最短时间确定最佳反应温度。反应结束 后，根据反应液颜色进行判断，若显绿色，则为阳性 反应；若显橙色，则判断为阴性反应。进一步通过电 泳加以验证，取２ Ｌ扩增产物，在质量分数为１．５ 的琼脂糖凝胶上１００￣１２５ Ｖ恒压电泳３０ ｍｉｎ，然后 在紫外检测仪下观察。 表１ ＲＴ－ＬＡＭＰ和ＲＴ－ＰＣＲ检测ＰｅＶＹＶ的引物 Ｔａｂｌｅ １ Ｐｒｉｍｅｒｓ ｕｓｅｄ ｆｏｒ ＰｅＶＹＶ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｂｙ ＲＴ＿ＬＡＭＰ ａｎｄ ＲＴ－ＰＣＲ １．２．４ Ｒ ｌ。＿上Ｊ Ｒ Ｒｒｒ＿ＰＣＲ反应参照一步法Ｉ ＰＣＲ试剂盒说明 操作，即：ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ １ Ｓｔｅｐ Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｘ ２．０ Ｌ，２×１ Ｓｔｅｐ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｄｙｅ Ｐｌｕｓ）２５．０／，Ｌ，１０／ｌｍｏｌ／Ｌ引物Ｐ－Ｆ ２．０ Ｌ，１０／ｌｍｏｌ／Ｌ引物Ｐ－Ｒ ２．０ ｔ＊Ｌ，ＲＮＡ模板 １．０ Ｌ，去离子水１８ Ｌ，总体系为５０ Ｌ。反应条件 为：５Ｏ。Ｃ反转录３０ ｒａｉｎ；９４℃预变性４ ｍｉｎ，９４。Ｃ变性 ３０ ｍｉｎ、５２。Ｃ退火３０ Ｓ、７２。Ｃ延伸１ ｍｉｎ，３５个循环， ７２＾Ｃ最终延伸１０ ｍｉｎ，取８ Ｌ扩增产物在质量分数 为１．５ 的琼脂糖凝胶上１００～１２５ Ｖ恒压电泳 ３Ｏ ｍｉｎ，在紫外检测仪下观察并记录结果。 １．２．５灵敏度试验 将所提取的辣椒病叶片组织的总ＲＮＡ按１０ ～１Ｏ 进行浓度梯度稀释，以不同浓度的ＲＮＡ作 模板，分别进行ＲＴ—ＬＡＭＰ和普通ＲＴ－ＰＣＲ检测， 比较两者的检测灵敏度。 １．２．６ ＰｅＶＹＶ田间疑似病样Ｒｒｒ＿ＬＡＭＰ检测 从广东省各辣椒产区采集疑似感染ＰｅＶＹＶ的 辣椒病样６份，提取总ＲＮＡ，分别用１．２．３的ＲＴ－ 主豇 绲女； Ｉ ＡＭＩ 力 法愉洲．并用ＲＴ ＰＣＲ 法 以验 ｉＩ。 ２结果与分析 ２．１ Ｒ Ｉ’－ＬＡＭＰ最佳反应温度 以感染Ｉ ＶＹＶ辣椒病叶组织的总Ｐ，ＮＡ为模 板。进 Ｉ Ｔ Ｉ ＡＭＩ Ｊ｝乏应，吱时浊 仪输ｉ＿ｌｌ的／扩增 … （ １） 明： ５９、６１、６３ ６５（的反应温 卜．ＲＴ Ｉ ＡＭＩ 反庸分别住约，１２、 、２【）干¨２７ Ｉ］ｌｉｎ 图２ Ｒ １＂－１ ＡＭ１’各温度处理的反应液颜色变化 Ｆｉｇ．２ Ｃｏｈｗ ｃｈａｎｇｅ ｏｆ Ｒ ｌ ＩＪＡＭＩ’ｐｒ，ｇｌｕｃｔｓ ａｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｓ ＩＩ、』扩ｊ－ｆＪ，ｆｉｌｌ线Ｊｌ：＆ｆ？ｆ Ｙｌ一。反Ｊ、 结束 。肉 观察到各 处删 心液均 绿色．ｆｎ 伞 埘．１｛（｛Ｉ 包（冈 ２）。 场榆测时 可能 的’ 求．确定６５ 濉Ｊ业 、 ２．２灵敏度检测结果 将感染Ｉ ＶＹＶ的辣微痫叶』 【 总ＲＮＡ进 行１０倍系列稀释作为模板．分别进ｉ ＲＴ—Ｉ ＡＭＩ 反 和ＲＴ—Ｉ 【、Ｒ反心。Ｊ、 用Ｒ Ｉ、。Ｉ ＡＭＩ 方法， 卡Ｉｌ板 稀释倍数为ｌ（） 时，反应液 Ｉ１』］ 绿色（ 反 应），电泳时扩增的『ｊ的条带清晰； ｊ模板稀释俯数 为１０ 时．反心液也呈现绿色，电泳叫‘仍ｕｒ 扩增 的条０ ：ｆＩｌ模板稀释倍数为ｌ０“时。反 液 ｔ 脱橙 色．｝Ｕ泳九Ｉ ｉ的条，ｔ…ｌＪ：（阴性反心）（ ３～ｔ）。心用 ＲＴ Ｉ ＣＲ ‘法． 摸板稀释倍数为ｌ０ 『ｆ、『．ＩＵ泳时 （１ ｌ０ ：（） ３０ ４１） ５０ ６（ 时旧／［１ｌｍ ｌ ｉｍｅ 扩增的Ｈ的条 ： 经非常弱；当模板稀样ｆ 数为 １０ Ｈ ，Ｒ Ｉ Ｉ ＣＲ ／ｆ 能手』 增出Ｉ４的条１ｔ ￣ｆ－（【皇１ ５）。 凶此，检测Ｉ ｃＶＹＶ．ＲＴ Ｉ ＡＭ［ 法比ＲＴ Ｉ’（、Ｉ之方 图ｌ Ｒ Ｉ ＬＡＭＰ各反应温度下的扩增曲线 Ｆｉｇ．１ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｃｕｒｖｅ ｏｆ Ｒ 卜ＩＪＡＭＩ’ａｓｓａｙ ａｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｓ 法 敏度赢１０俯 图３ Ｒ ｌ＇－Ｉ ＡＭＩ 灵敏度试验结果 Ｆｉｇ．３ Ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｉＬｓＳａｙ ｏｆ Ｒ ｌ １ ＡＭＩ’ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ２．３疑似病样的ＲＴ－Ｉ ＡＭＰ检测结果 埘水ｒ１广尔甫不 辣椒产』 的６份疑似感染 Ｉ （ Ｖ、，Ｖ痫十 ．录用ＲＴ ＬＡＭＩ’力 法进 榆测．结果 ３讨论 小研究建 的ＰｅＶＹＶ Ｒｑ ＬＡＭＩ 愉洲 ‘法快 ，Ｊ （ （；）． 似病样１ 、２号、３弓’、 【 ‘为 性．１ ６ 为『｛ＪＪ． 进 步心用ＲＴ Ｉ （、Ｒ ＪＪＩ】以验证， 速、简便、 敏干ｕ特 。应用该方法¨ 需要６ ｈ ７（）ｎｌｈｌ内 个扩增 完成对Ｉ ｅＶＹＶ的枪测，而常规的Ｉ（Ｉ、Ｉ ＣＲ检测则 ．大幅度缩短了榆洲叫‘ 。 愉洲结 （【戈１ ７）｝＝ｊ ＲＴ—Ｉ ＡＭＩ 结 一致， 者的 符 为ｌ（）（） 。这表『月所建 的ＰｅＶＹＶ ＲＴ—ｊ Ｉ．ＡＭＩ 榆洲力‘法能够实现１１ｌ『口Ｊ痫样的怏速、准确检 测 ｊ诊断。 过程可在恒温水浴锅或烘箱巾进行，反 结 ｒ１『以 通过肉眼直接观察扩增反应产物的颜色变化进行 划定．检测方法简便，克服ｒ Ｒｒｒ—ｌ ＣＲ检测 法任 ｌｊ，Ｊ：ｈ；Ｌ ＪＩｔ …门ＪｆＩｊ ｊ 足。任 敏 力‘ ．Ｉ ｒ— 仃ｌ｜Ｊ 能 致似阳性．因此操作过 ｒＩＩ一定受保ｉＩ 试 验 境、器 以及试剂等免受ＲＮＡ或扩增产物的 ｛‘染，榆测的各个环节要严格分Ｉ戈进 ．Ｉｌ１ｔｌ、Ｊ‘操作 过程 减少丌盖操作次数等。小研究Ｊ听址 的 Ｉ，ｅＶＹＶ ＲＴ～Ｉ ＡＭＩ 检 ０方法将Ｊ听 ｒ ｎ，Ｊ Ｊ曼』 成 ７支 Ｉ ＡＭＩ 的愉测 敏 比ＲＴ Ｉ Ｌ、Ｒ商１ ０ ｆ 。 Ｊ外。 ｆｌｌ Ｊ Ｒ Ｉ、Ｉ 八ＭＩ Ｊ 奉ｌＪ Ｊｔ Ｊ ｎ，Ｊ，ｊｌ物 ｆ０要 ｌ”ｌＩ靶Ｊ 『ｊ ６个特 Ｐｔ－：ｌｘ 域． 舰的Ｒ Ｉ 、Ｉ 力‘法川物 ＩＪｌ Ｉｊ Ｊｌ 列 ２个特 ｒＩ Ｉ 域．因此ＲＴ Ｉ ＡＭＩ’ｊ ｋ－ＹＩ ． 的特 ，一 ㈤ ㈨ ∞ 图４ Ｒ ｌ＇－Ｉ ＡＭＩ，灵敏度试验电泳结果 ｌ ｉ ４ Ｉ￣１ｅｃｌｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｒｅｓｕｌｔ ｏｆ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ａｓｓａｙ ｏｌ Ｒ Ｆ－！ ＡＭｌ’ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ 图５ Ｒ ｌ＇－Ｐ（１ｌ灵敏度试验电泳结果 ｌ ．５ ｌ￡ｌｃｃｌｒＩ’ｐｈｆ・ｒｅｓｉｓ ｒｅｓｕｌｔ ｏｆ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ａｓｓａｙ ｏｌ‘ Ｒ ｌ＇－Ｉ ＣＲ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｉ２ ３ ４ ５ “ ７ ８ ｆ（、疑似辣椒嫡仟：７：ｌａＨ＋Ｉ－对照：Ｈ：阴性对照 Ｉ—ｆ、：，ｑ＜ｕｓｐｃｃｔｃｄ ｄｉｓｅａｓｅｄ ｐｅｐｐｅ ｒ ｓａｎｌｐｌｏ：７ Ｉ】ｏｓｉｔｉ￣ｅ ＣＯＩｌ１．Ｉ‘ｏ１： ．Ｎｃｇａｌｌ、Ｃ ｃ【１Ｉ１¨ｏｌ 图６ 田间辣椒病样的Ｒ Ｆ－Ｉ ＡＭＰ检测结果 ＦｉＲ．６ １）ｅｔｅｃｌｉｏｎ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ｐｅｐｐｅｒ ｓａｍｐｌｅｓ ｌ＇ｒｏｍ ｆｉｅｌｄｓ ｂｙ Ｒ ｌ’。ｌ ＡＭＰ …Ｊ Ｉ Ｉ，ＡＭＩ 技术灵敏度岛、 物扩增ｊ 人。微ｌ ｉ，Ｊ｛０染（ｆｎ１－ 中的 性气溶＂交微札）邯 荧光Ｈ视愉测试剂一次性加入刊反心僻 【１韭行反 Ｉｊ心． ｌｌ１７ｉＪ ｆ｜ｆ开盖．待反应 接脱察反心液 的颜包束 ０断结＿果．大幅度降低 Ｉ … ：，卜的Ｉｌ】‘ 能一 … Ｍ：２ ０００ ｂｐ ｍａｒｋｅｒ；１、６：疑似辣椒痫样：７：ｍ 对照：Ｈ：阴性对照 Ｍ：２ ０００ ｂｐ ｔｌｌａｒｋｅｒ ａ １—６：Ｓｕｓｐｅｃｔｅｄ ｐｅｐｐｅｒ ｓａｔ＇ｎｐｌｅ；７：Ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｏｌｌｔｒｔ ８：Ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ 图７ 田间辣椒病样的Ｒ Ｉ－＇ＰＣＲ检测 Ｆｉｇ。７ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ｐｅｐｐｅｒ ｓｌｍｌｐｌｅｓ ｆｒｏｍ ｆｉｅｌｄｓ ｂｙ Ｒ Ｉ＇－１ Ｒ ＰｃＶＹＶ是辣椒上重要 薄之 ¨１㈣ Ｙ（）ＩⅦｌ 等在Ｈ本首次报道发 Ｉ （、Ｖ、．Ｖ以术 。近 儿 ． Ｉ、非洲、欧洲、美洲的多个 家陆续报道发 陔病毒。２０１３年我围台湾 ７欠报道发观陔痫 ～， 随 山尔和湖南等省份也榆测到陔病 拄 。本 队×ｌ』广东甫辣椒病毒病发生悄况进 ．ｒ州 ，发现疑 似辣椒黄脉病毒病，应用小ＲＮＡ测序技术及Ｒｑ＂ １ ＡＭｔ 方法埘其病毒种类进ｉ 峪 ｊ榆洲，发现Ｉ ｅ ＶＹＶ 广东省＿丰要辣椒产 均４ｆ／Ｊ）－４１ｉ。疑似痫样的 检测阳 率为３８．３ ，且常与 微脉斑驳痫 （Ｐｅｐ一 Ｐ ｒ ７ “，ｍｏｔｔｌｅ＂ｕｉｒｕｓ，ＰＶＭＶ）、辣椒ＩＩＭ水 驳病毒 （（７Ｕｌｌｉ ￣ｅｈｔａｌ ｍｏｌｌｉｅ ， 九ｆ ，（、ｌ１ｉＶＭＶ）、ｆ电瓜花川 病毒 （（ ｌｔ＃１１［）ＵＩ ｆｒＪ ｚ ｕ 九 （、ＭＶ）等痫海复合陂染或混 合发生．说明Ｉ ｅＶＹＶ是引起广尔辣椒病薄痫的土 病原病毒之一。需要进一步 ｆ｝ｌｊ＝ 分４ｉｉ、发 舰律及 辣椒品种的抗性水平．为预防 控制该 芯痫的发 提供科学依据。 参考文献 Ｙ（Ｍ ｔｈａｉ Ｉ、． ｌｂｙｏｓ￣ｔｌｏ ｒＩ、．Ｋ １ｗ ｉｎｏ ．（‘ ｔ．， ｆ ， （ ，”ＶＩ，，＾庀 ｆ ．Ⅲ １）ＯＶｔ １ ｌｕｔｃｘ）ｖｉｒｕｓ ｆｒｏｍ ｂｏｌｌ ｐ１）ｔ—Ｉ）ｈｍｔｓ ｉｎ Ｉａ１）；Ｕｌ ｌ１］．Ａｔ／１ｌａｌｓ 素氢 镰船 ２Ｏ１６ ｏｆ ｔｈｅ Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｊａｐａｎ，１９９５，６１（３）：１７８—１８４． Ｅ２］Ｍｕｒａｋａｍｉ Ｒ，Ｎａｋａｓｈｉｍａ Ｎ，Ｈｉｎｏｍｏｔｏ Ｎ，ｅｔ ａ１．Ｔｈｅ ｇｅｎｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ Ｐｅｐｐｅｒ ｖｅｉｎ ｙｅｌｌｏｗｓ ｖｉｒｕｓ（ｆａｍｉｌｙ Ｌｕｔｅｏｖｉｒｉｄａｅ， ｇｅｎｕｓ Ｐｏｌｅｒｏｖｉｒｕｓ）ＥＪ］．Ａｒｃｈｉｖｅｓ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２０１１，１５６（５）： ９２１—９２３． ［３］Ｖｉｌｌａｎｕｅｖａ Ｆ，Ｃａｓｔｉｌｌｏ Ｐ，Ｆｏｎｔ Ｍ Ｉ，ｅｔ ａ１．Ｆｉｒｓｔ ｒｅｐｏｒｔ ｏｆ Ｐｅｐ— ｐｅｒ ｖｅｉｎ ｙｅｌｌｏｗｓ ｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｎｇ ｓｗｅｅｔ ｐｅｐｐｅｒ ｉｎ Ｓｐａｉｎ［Ｊ］． Ｐｌａｎｔ Ｄｉｓｅａｓｅ，２０１３，９７（９）：１２６１—１２６２． ［４］ Ｂｕｚｋａｎ Ｎ，Ａｒｐａｃｉ Ｂ Ｂ，Ｓｉｍｏｎ Ｖ，ｅｔ ａ１．Ｈｉｇｈ ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ ｏｆ ｐｏｌｅｒｏｖｉｒｕｓｅｓ ｉｎ ｆｉｅｌｄ－ｇｒｏｗｎ ｐｅｐｐｅｒ ｉｎ Ｔｕｒｋｅｙ ａｎｄ Ｔｕｎｉｓｉａ［Ｊ］． Ａｒｃｈｉｖｅｓ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２０１３，１５８（４）：８８１—８８５． ［５］Ｋｎｉｅｆｉｍ Ｄ，Ｔｓａｉ Ｗ Ｓ，Ｋｅｎｙｏｎ Ｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｆｒｏｍ ｆｉｄｄ ｓａｍｐｌｅｓ ｒｅｖｅａｌｓ ｔｈｅ ｐｒｅｓｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ ｒｅｃｅｎｔｌｙ ｄｅｓｃｒｉｂｅｄ Ｐｅｐｐｅｒ ｖｅｉｎ ｙｅｌｌｏｗｓ ｖｉｒｕｓ（ｇｅｎｕｓ Ｐｏｌｅｒｏｖｉｕｒｓ）ｉｎ ｓｉｘ ａｄｄｉｔｉｏｎａｌ ｃｏｕｎｔｒｉｅｓ ＥＪ］． Ａｒｃｈｉｖｅｓ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２０１３，１５８（６）：１３３７—１３４１． ｒ６］ＡＩｆａｒｏ－Ｆｅｒｎｄｎｄｅｚ Ａ，Ｅ１Ｓｈａｆｉｅ Ｅ Ｅ，Ａｌｌ Ｍ Ａ，ｅｔ ａ１．Ｆｉｒｓｔ ｒｅ— ｐｏｒｔ ｏｆ Ｐｅｐｐｅｒ ｖｅｉｎ ｙｅｌｌｏｗｓ ｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｎｇ ｈｏｔ ｐｅｐｐｅｒ ｉｎ Ｓｕｄａｎ －ＩＪ］．Ｐｌａｎｔ Ｄｉｓｅａｓｅ，２０１４，９８（１０）：１４４６． ［７］Ａｌａｂｉ Ｏ Ｊ，Ｒｗａｈｎｉｈ Ｍ Ａ１，］ｉｆｏｎ Ｊ Ｌ，ｅｔ ａ１．Ｆｉｒｓｔ ｒｅｐｏｒｔ ｏｆ Ｐｅｐｐｅｒ ｖｅｉｎ ｙｅｌｌｏｗｓ ｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｎｇ ｐｅｐｐｅｒ（Ｃａｐｓｉｃｕｍ ｓｐｐ．）ｉｎ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｒＪ］．Ｐｌａｎｔ Ｄｉｓｅａｓｅ，２０１５，９９（１１）：１６５６． ［８］Ｚｈａｎｇ Ｓ Ｂ，Ｚｈａｏ Ｚ Ｂ，Ｚｈａｎｇ Ｄ Ｙ，ｅｔ ａ１．Ｆｉｒｓｔ ｒｅｐｏｒｔ ｏｆ Ｐｅｐ— ｐｅｒ ｖｅｉｎ ｙｅｌｌｏｗｓ ｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｎｇ ｒｅｄ ｐｅｐｐｅｒ ｉｎ ｍａｉｎｌａｎｄ Ｃｈｉｎａ ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ Ｄｉｓｅａｓｅ，２０１５，９９（８）：１１９０． ［９］Ｔａｎ Ｗ Ｐ，Ｄｏｎｇ Ｙ Ｚ，Ｓｕｎ Ｘ Ｈ，ｅｔ ａ１．Ｔｈｅ ｆｉｒｓｔ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｅｐｐｅｒ－ｖｅｉｎｙｅｌｌｏｗｓ ｖｉｕｒｓ ｉｎ ＳｈａｎｄｏｎｇＰｒｏｖｉｎｃｅ，Ｃｈｉｎａ口］．Ｐｌａｎｔ Ｄｉｓｅａｓｅ，２０１５，９９（９）：１２８８． ［１ｏ］Ｎｏｔｏｍｉ Ｔ，Ｏｋａｙａｍａ Ｈ，Ｍａｓｕｂｕｃｈｉ Ｈ，ｅｔ ａ１．Ｌｏｏｐ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ［Ｊ］．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ２０００，２８（１２）：ｅ６３． ［１１］Ｚｈａｏ Ｌｉｍｉｎｇ，Ｌｉ Ｇａｎｇ，Ｇａｏ Ｙｉｎｇ，ｅｔ ａ１．Ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｌｏｏｐ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ Ｔｏ— ｍａｔｏ ｃｈｌｏｒｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ， ２Ｏ１５，２１３：９３—９７． ［１２］Ｆｕｋｕｔａ Ｓ，Ｏｈｉｓｈｉ Ｋ，Ｙｏｓｈｉｄａ Ｋ，ｅｔ ａ１．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｉｍｍｕ— ｎｏｃａｐｔｕｒｅ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｌｏｏｐ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉ— ｆｉｃａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ １＂ｏｍａｔｏ ｓｐｏｔｔｅｄ ｗｉｌｔ ｖｉｒｕｓ ｆｒｏｍ ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，２００４， １２１（１）：４９—５５． ［１３］刘科宏，陈洪明，周彦，等．柑橘黄化脉明病毒ＲＴ ＬＡＭＰ检 测方法的建立－Ｊ］．园艺学报，２０１５，４２（５）：９９７—１００２． －［１４］王永江，周彦，李中安，等．柑橘衰退病毒ＲＴ－Ｉ ＡＭＰ快速检 测方法的建立－Ｊ］．中国农业科学，２０１３，４６（３）：５１７—５２４． 口５］Ｐｅｎｇ Ｊｕｎ，Ｓｈｉ Ｍｉｎｊｉｎｇ，Ｘｉａ Ｚｉｈａｏ，ｅｔ ａ１．Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｕｃｕｍ— ｂｅｒ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｆｒｏｍ ｂａｎａｎａ ｂｙ ｏｎｅ－ｓｔｅｐ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎ ｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｌｏｏｐ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ａｒｃｈｉｖｅｓ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２０１２，１５７（１１）：２２１３—２２１７． ［１６］周彤，杜琳琳，范永坚，等．水稻黑条矮缩病毒ＲＴ－ＬＡＭＰ快速 检测方法的建立ＥＪ］．中国农业科学，２０１２，４５（７）：１２８５—１２９２． ｒ１７］Ｌｅ Ｄ Ｔ，Ｎｅｔｓｕ Ｏ，Ｕｅｈａｒａ－Ｉｃｈｉｋｉ Ｔ，ｅｔ ａ１．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｎｉｎｅ ｒｉｃｅ ｖｉｒｕｓｅｓ ｂｙ ａ ｒｅｖｅｒｓｅ－ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｌｏｏｐ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏ— ｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈ ｏｄｓ，２０１０，１７０：９０—９３． －［１８］Ｚｈａｏ Ｋｕｎ，Ｌｉｕ Ｙａｎ，Ｗａｎｇ Ｘｉｆｅｎｇ．Ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｌｏｏｐ－ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｂａｒ— ｌｅｙ ｙｅｌｌｏｗ ｄｗａｒｆ ｖｉｒｕｓｅｓ ｉｎ Ｃｈｉｎａ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，２０１０，１６９（１）：２１１—２１４． ［１９］刘洪义，辛言言，刘忠梅。等．马铃薯Ａ病毒ＲＴ－ＬＡＭＰ检测 方法的建立［Ｊ］．中国农学通报，２０１５，３１（１１）：１４３—１４７． ［２０］Ｎｉｅ Ｘｉａｎｚｈｏｕ．Ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｌｏｏｐ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｏｔａｔｏ ｖｉｒｕｓ Ｙ＿Ｊ］．Ｐｌａｎｔ Ｄｉｓｅａｓｅ，２００５，８９（６）：６０５—６１０． ［２１］Ｔｓｕｔｓｕｍｉ Ｎ，Ｙａｎａｇｉｓａｗａ Ｈ，Ｆｕｊｉｗａｒａ Ｙ，ｅｔ ａ１．Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｏｔａｔｏ ｓｐｉｎｄｌｅ ｔｕｂｅｒ ｖｉｒｏｉｄ ｂｙ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｌｏｏｐ－ｍｅｄｉ— ａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｊａｐａｎ，２０１０，４６：６１—６７． ［２２７陈柳，尚巧霞，陈笑瑜，等．草莓轻型黄边病毒ＲＴ－ＬＡＭＰ检 测方法的建立ｒＪ］．中国农业科学，２０１５，４８（３）：６１３—６２０． ［２３１ Ｌｅｅ Ｍ Ｓ，Ｙａｎｇ Ｍ Ｊ，Ｈｓｅｕ Ｙ Ｃ，ｅｔ ａ１．Ｏｎｅ－ｓｔｅｐ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎ— ｓｅｒｉｐｔｉｏｎ ｌｏｏｐ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｒａｐｉｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃ３ｎｎｂｉｄｉｕｍ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ口］．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｉ ｅａｉ Ｍｅｔｈｏｄｓ，２０１１，１７３（１）：４３—４８． （责任编辑：杨明丽）