广西畜牧兽医 ２０１４年Ｖｏ１．３０（６） ２８３ Ｏｘａｍｆｌａｔｉｎ处理对水牛一猪异种体细胞核移植胚胎早期发育的影响 崔静辉 ，刘予娴 ，全守能 ，卢晟盛 （１．广西大学动物科学技术学院，广西南宁５３０００５；２．广西大学生命科学技术学院，广西南宁５３０００５） 中图分类号：￥８１４．６ 文献标识码：Ｂ 文章编号：１００２—５２３５（２０１４）０６—０２８３—０４ 摘要：为了探讨组蛋白去乙酰化酶抑制剂（Ｏｘａｍｆｌａｔｉｎ） 处理对水牛一猪异种体细胞核移植（ｉＳＣＮＴ）胚胎早期 发育的影响，分别观察了培养在不同浓度Ｏｘａｍｆｌａｔｉｎ （０．００ Ｍ，０．０５ Ｍ，０．５０ ＩｘＭ，５．００１￣Ｍ）和不同处理 时间（０ｈ，１２ｈ，１８ｈ，２４ｈ）对水牛一猪ｉＳＣＮＴ胚胎早期发 育的影响。结果显示，在ＰＺＭ一３中添加不同浓度的 Ｏｘａｍｆｌａｔｉｎ处理１２ｈ后，ｉＳＣＮＴ胚胎分裂率在各个处理 组和对照组之间差异不显著（Ｐ＞０．０５），囊胚率在各个 处理组和对照组之间也无显著差异（Ｐ＞０．０５）；随后用 Ｏｘａｍｆｌａｔｉｎ处理不同时间后，ｉＳＣＮＴ胚胎分裂率和囊胚 率分别在各个处理组和对照组之间差异不显著（Ｐ＞ ０．０５）。结果表明，在本试验条件下Ｏｘａｍｆｌａｔｉｎ不能显 著提高水牛一猪ｉＳＣＮＴ胚胎发育的潜能。 关键词：Ｏｘａｍｆｌａｔｉｎ；异种体细胞核移植；胚胎发育 我国农村迅速发展的农业机械化使得水牛由 农业的主要动力降为辅助动力，导致数量日益下 降 Ｊ。由于水牛的生长周期比较长，所能采集的 卵母细胞资源有限，通过自然方式繁育水牛的速度 较慢，而选用异种体细胞核移植技术可以规避这一 问题。组蛋白是存在于真核生物染色质中的一组 进化上非常保守的碱性蛋白质，包括Ｈ１、Ｈ２Ａ、 Ｈ２Ｂ、Ｈ３、Ｈ４五种类型。组蛋白去乙酰化酶 （ＨＤＡＣｓ）是一类蛋白酶，在细胞染色质水平通过 诱导组蛋白去乙酰化来调控包括染色质重组、转录 活化或抑制细胞周期、细胞分化及细胞凋亡等一系 列生物学效应的酶，它与细胞活化后的基因转录表 达调控有关。组蛋白的修饰方式有乙酰化、甲基 化、糖基化、磷酸化。当前研究发现乙酰化修饰大 多数发生在组蛋白Ｈ３一赖氨酸的９、１４、１８、２３和 Ｈ４一赖氨酸的５、８、１２、１６等位点，组蛋白乙酰化 的修饰是可逆的，且是一个相对的动态过程，主要 收稿日期：２０１４—０４—２４ 基金项目：国家自然科学基金资助项目（３１２６０５５３）。 作者简介：崔静辉（１９８５一），女，硕士研究生，主要从事动物胚胎研 究工作。 通讯作者。Ｅ—ｍａｉｌ：ｓｈｅｎｇｓｈｅｎｇｌｕ＠ｑｑ．ｅｏｍ。 是在乙酰化酶和去乙酰化酶的共同交替作用下完 成 Ｊ。组蛋白的乙酰化，对染色体的结构修饰和 基因表达调控发挥着重要的作用＿３ｊ。有研究报道 称，在一般情况下，组蛋白的乙酰化有利于ＤＮＡ与 组蛋白八聚体的解离，使核小体结构松弛，激活转 录相关基因的转录 。相反，有相关报道称，一旦 组蛋白去乙酰化发生，组蛋白就会和ＤＮＡ紧密结 合阻止ＤＮＡ与组蛋白八聚体的解离，从而抑制基 因的转录 Ｊ。目前，体细胞核移植（ＳＣＮＴ）效率仍 比较低，主要原因是因为体细胞注入去核卵母细胞 中重编程不完全，从而导致胚胎发育过程中对胚胎 发育有重要作用的基因未能表达或表达异常。为 提高或改善重编程效率，近年来一些组蛋白去乙酰 化酶抑制剂（ＨＤＡＣＩｓ）被应用到ＳＣＮＴ当中。它们 是一类抑制ＨＤＡＣｓ活性的化合物，是一种相对保 守的酶，能够维持组蛋白的高度乙酰化。目前可以 分为四种：异羟肟酸类、环肽类、短链脂肪酸类和苯 甲酰胺类，ＴＳＡ，ＶＰＡ，Ｓｃｒｉｐｔａｉｄ等是研究使用最普 遍的。Ｏｘａｍｆｌａｔｉｎ是一种新的低毒的ＨＤＡＣＩｓ，和 ＴＳＡ相比，能够抗癌细胞的增殖和抑制去乙酰 化＿５ Ｊ。最近，有报道称Ｏｘａｍｆｌａｔｉｎ能提高小鼠的克 隆效率 。。 。因此，笔者用ＯｘａＩｎｆｌａｔｉｎ对水牛一猪 异种体细胞核移植（ｉＳＣＮＴ）重构胚进行处理，分别 处理不同时间（０ｈ、１２ｈ、１８ｈ、２４ｈ）和不同浓度 （０．００ＩｘＭ、０．０５ Ｍ、０．５０１ｘＭ、５．００ＩｘＭ），培养７天 观察ｉＳＣＮＴ胚胎早期发育情况。结果发现，Ｏｘａｍ— ｆｌａｔｉｎ能在一定程度上提高水牛一猪异种体细胞核 移植胚胎的体外发育能力。为异种体细胞核移植 胚胎的体外发育提供参考依据。 １材料与方法 １．１水牛供体细胞的准备 用水牛胎儿耳部成纤维细胞作为体细胞核移 植的供体细胞。为了准备原代的水牛胎儿成纤维 细胞，取两月龄水牛胎儿的耳部组织，用７５％酒精 洗２遍，再用ＰＢＳ清洗，用手术剪将耳部组织块剪 ２８４ 广西畜牧兽医 ２０１４年Ｖｏ１．３０（６） （Ｏ．５ｍｍ）在融合／激活液（０．３Ｍ甘露醇，０．５ｒａＭ 成约１ｍｍ 的小块，转入６０ｍｍ的ＮＵＮＣ培养皿 中，并将组织块均匀地分在整个皿底，然后添加少 量生长培养基（ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ），培养在３７℃、 ５％ＣＯ 、饱和湿度的环境条件下。培养１２ｈ～２４ｈ， 待组织块贴壁以后，添加约１ｍＬ生长培养基，覆盖 所有组织块。隔天更换一次生长培养基，直到细胞 汇合。然后进行传代培养，但是不超过ｌＯ代。细 胞用添加１０％ＦＢＳ和１０％二甲基亚砜（ＤＭＳＯ）的 ＤＭＥＭ进行冻存并保存在液氮中，直到使用时再 进行解冻。对核移植所用的供体细胞进行接触抑 制处理使其处于同一细胞周期（ＧＯ／Ｇ１期），抑制 时间为２天。 １．２猪卵母细胞的收集和体外成熟培养 从当地屠宰场收集猪卵巢，保存在含双抗的生 理盐水中（３７ｏＣ），３ｈ内运回实验室。用１０ｍＬ一 次性注射器（１２号针头）通过穿刺法从卵泡（直径 ２ｍｍ～６ｍｍ）里抽取卵丘一卵母细胞复合体 （ＣＯＣｓ）。将ＣＯＣｓ置于预热的洗卵液 （ＴＡＬＰ． Ｈｅｐｅｓ）中洗两遍。只挑选卵胞质均匀且至少有三 层卵丘细胞的ＣＯＣｓ进行体外成熟。将ＣＯＣｓ转入 成熟液（ＴＣＭ－１９９＋１０％猪卵泡液＋０．５ ｇ／ｍＬＦＳＨ ＋０．５Ｉ￣ｇ／ｍＬ ＬＨ）中洗２遍，以２５—３５个ＣＯＣｓ一 组转入２００￣Ｌ／滴的成熟液滴中，培养２０ｈ～２２ｈ 后，将ＣＯＣｓ转入不含激素的同样成熟液中继续培 养２４ｈ，培养条件为３９℃、５％ＣＯ２、饱和湿度。 １．３ 异种体细胞核移植和重构胚的激活以及胚胎 培养 异种体细胞核移植用水牛胎儿成纤维细胞作 为核供体。供体细胞培养在６０ｍｍ的ＮＵＮＣ培养 皿中，用添加１０％ＦＢＳ的ＤＭＥＭ培养直到汇合。 用ＰＢＳ清洗供体细胞，然后用０．２５％的胰蛋白酶． ＥＤＴＡ消化３ｍｉｎ后添加１０％ＦＢＳ的ＤＭＥＭ终止消 化。将细胞用１ ０００ ｒｐｍ离心５ｍｉｎ并重悬在含 １０％ＦＢＳ和７．５ ｔｘｇ／ｍＬ细胞松弛素Ｂ的ＴＬ—ＨＥＰＥＳ 中。成熟４４ｈ～４６ｈＣＯＣｓ用０．２％透明质酸酶（Ｈｙ． ａｌｕｒｏｎｉｄａｓｅ）处理３ｍｉｎ后用移液枪反复吹打使颗粒 细胞脱落。核移植操作在含１０％ＦＢＳ和７．５ ｍＬ细胞松弛素Ｂ（ＣＢ）的ＴＬ－ＨＥＰＥＳ中进行，用去 核针吸取第一极体和附近的部分胞质。再用去核 针吸取单个大小适中、边缘平滑的供体细胞注射到 去核卵母细胞的卵周隙中。并轻轻挤压以挤出注 核时带入的少量液体，并且能够使水牛供体细胞和 猪受体胞质紧密接触以利于融合。 重构胚用一个有两条不锈钢电极的融合槽 ＣａＣ１２・２Ｈ２Ｏ，０．１ｍＭ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ，０．５ ｍＭ Ｈｅｐｅｓ）中进行融合／激活。使用一台电融合仪 （ＢＴＸ ２００１）在２００Ｖ／ｍｍ、３０ ｓ、１次直流脉冲条件 下进行异种重构胚的融合／激活。融合后进行化学 激活，将重构胚转入ＰＺＭ－３（含０．３％ＢＳＡ）中平衡 ３０ｍｉｎ后，将融合的ｉＳＣＮＴ重构胚挑出，并继续平 衡至ｌｈ，进行化学激活［用５１ｘＭ离子霉素（Ｉｏｎｏｍｙ． ｃｉｎ）处理３ｍｉｎ一５ｍｉｎ，再转入到２．５ｒａＭ６．ＤＭＡＰ处 理３ｈ～５ｈ］。 激活后的重构胚转入胚胎培养液ＰＺＭ一３＋ ７．５ ｇ／ｍＬ ＣＢ中培养３ｈ～４ｈ后，再移到不含ＣＢ 的ＰＺＭ．３中培养，于第２天统计ｉＳＣＮＴ胚胎的分 裂率，第７天观察统计ｉＳＣＮＴ重构胚的囊胚率。培 养条件为３９℃、５％ＣＯ，、饱和湿度。 １．４数据统计分析 用卡方检验（Ｘ２）分析实验数据的显著性差 异。Ｐ＜０．０５表示差异性显著。 ２结果与分析 ２．１不同浓度的Ｏｘａｍｆｌａｔｉｎ处理对水牛一猪ｉＳＣ— ＮＴ重构胚早期发育的影响 将融合／激活后的重构胚转入到ＰＺＭ一３＋ ７．５ ｇ／ｍＬＣＢ中培养３ｈ一４ｈ后，再转入到分别添 加（０ Ｍ，０．０５ Ｍ，０．５ Ｍ，５ Ｍ）Ｏｘａｍｆｌａｔｉｎ的 ＰＺＭ一３中处理１２ｈ，然后用不含Ｏｘａｍｆｌａｔｉｎ的ＰＺＭ一 ３再培养至第７天。于第２天统计分裂情况，第７ 天统计囊胚形成情况。 表１不同浓度的Ｏｘａｍｆｌａｔｉｎ处理 对ｉＳＣＮＴ胚胎早期发育的影响 结果见表１，在ＰＺＭ．３中添加不同浓度的０ｘ— ａｍｆｌａｔｉｎ处理１２ｈ后，ｉＳＣＮＴ胚胎的分裂率， ０．０５ Ｍ组的分裂率轻微的低于对照组的 （７４．７５％ＶＳ．７６．５３％），而０．５ Ｍ和５ｔｘＭ组的分 裂率都高于对照组的（８１．６３％，８１．００％ ＶＳ．７６．５３％），但是差异不显著（Ｐ＞０．０５）。说明在 本试验条件下用Ｏｘａｍｆｌａｔｉｎ处理ｉＳＣＮＴ重构胚，对 其分裂率提高没有显著的作用。而囊胚率方面，与 对照组相比，添加了Ｏｘａｍｆｌａｔｉｎ处理的重构胚，囊 广西畜牧兽医 胚率都有了一定的提高，其中５ｐ．Ｍ Ｏｘａｍｆｌａｔｉｎ处理 组的囊胚率最高，但是各组间没有显著差异。说明 在本试验条件下Ｏｘａｍｆｌａｔｉｎ对水牛一猪异种体细 胞核移植重构胚的发育能力有一定的提高，但是作 用不明显。我们将本试验中囊胚率最高的组０ｘ— ａｍｆｌａｔｉｎ（５ＩｘＭ）浓度用于后续的试验。 ２．２ 不同时间的Ｏｘａｍｆｌａｔｉｎ处理对ｉＳＣＮＴ重构胚 早期发育的影响 表２ Ｏｘａｍｆｌａｔｉｎ处理不同时间 对ｉＳＣＮＴ胚胎早期发育的影响 结果见表２，在ＰＺＭ．３中添加５ Ｍ Ｏｘａｍｆｌａｔｉｎ 时，Ｏｘａｍｆｌａｔｉｎ的处理时间分别为１２ ｈ，１８ ｈ，２４ ｈ时，１２ｈ组（６９．７９％）的分裂率稍低于对照组 （７０．８３％））和其它两个试验组（分别为７７．８９％和 ７７．５５％），但是各组间差异不显著（Ｐ＞０．０５），说 明本试验条件下的处理时间对ｉＳＣＮＴ重构胚的分 裂率没有显著的影响。在囊胚方面，各处理组 （１２ｈ，１８ｈ，２４ｈ）的囊胚率稍微高于对照组的 （４．１７％，５．２６％，５．１０％ＶＳ．３．１３％），但是各组问 差异也不显著（Ｐ＞０．０５）。说明在本试验条件下， 用Ｏｘａｍｆｌａｔｉｎ处理胚胎不同的时间对囊胚的形成 没有显著的提高。 ３ 讨论 近年来ＴＳＡ、ＶＰＡ、Ｓｃｒｉｐｔａｉｄ等被应用于提高 ＳＣＮＴ的早期胚胎发育。有报道称 ｊ，小鼠受精前 卵母细胞和精子的乙酰化水平处于一个比较低的 水平，而在受精后，整个染色体组都变成了高度的 乙酰化水平，且将卵丘细胞注入到去核的卵母细胞 并融合激活后用１００ ｎＭ ＴＳＡ处理９ ｈ，显著增加了 ＳＣＮＴ的囊胚率（８１％）。此外，Ｓｈｉ等 证明组蛋 白的去乙酰化发生在体细胞注入卵母细胞后的１ ｈ ～３ ｈ，将体外受精的兔胚胎和ＳＣＮＴ胚胎用１００ ｎＭ ＴＳＡ处理后，从原核期一直到桑葚胚期在Ｈ３一 Ｌｙｓｉｎｅ １４位点和Ｈ４一Ｌｙｓｉｎｅ １２位点均发生了去甲 基化到甲基化的转变。然而，未处理的体外受精胚 胎或ＳＣＮＴ胚胎并未发生类似的转变，且最终证明 用ＨＤＡＣｉ处理ＳＣＮＴ胚胎可提高核移植的重编程 效率。Ｗａｎｇ等¨ 的研究还表明组蛋白去乙酰化 ２０１４年Ｖｏ１．３０（６） ２８５ 酶１（ＨＤＡＣ１）对牛卵母细胞的成熟和胚胎发育无 影响，且能够提高组蛋白Ｈ３一Ｌｙｓｉｎｅ １４位点的乙酰 化水平。另外还有Ｈｉｍａｋｉ等 报道用５０ ｎｍｏｌ ＴＳＡ处理来源于Ｃｌａｗｎ小型猪的转基因的ＳＣＮＴ 胚胎，显著地提高了囊胚的发育率，ＴＳＡ处理不会 影响转基因ＳＣＮＴ中导人的外源基因表达。但据 Ｓｕｇｉｍｕｒａ等 报道，ＴＳＡ不能提高猪的ＳＣＮＴ胚胎 的发育率。后来，有报道尝试用另一种ＨＤＡＣｉ． ＶＰＡ来代替ＴＳＡ，证明ＶＰＡ能够提高组蛋白Ｈ３一 Ｌｙｓｉｎｅ ９位点乙酰化水平的表达在Ｅ１４小鼠上¨ ， 在猪上则改变Ｏｃｔ４基因的表达 。此外，Ｋｉｍ 等 研究表明ＶＰＡ能够显著提高猪ＳＣＮＴ胚胎的 囊胚率和囊胚的质量，且ＶＰＡ的效果显著高于 ＴＳＡ。Ｓｃｒｉｐｔａｉｄ目前也被应用于提高ＳＣＮＴ胚胎的 发育¨卜他Ｊ。有报道用ＴＳＡ和Ｏｘａｍｆｌａｔｉｎ都可显著 提高小鼠ＳＣＮＴ的克隆效率，而ＶＰＡ则不能提高 克隆效率。。 。另有报道Ｓｃｒｉｐｔａｉｄ和ＴＳＡ相比能显 著提高小鼠的克隆效率 。综上所述，ＨＤＡＣｉ对 ｉＳＣＮＴ胚胎发育的影响还存在着很多争议，故本研 究选择一种新的ＨＤＡＣｉ来对ｉＳＣＮＴ胚胎进行处理 以探讨其对ｉＳＣＮＴ胚胎发育的影响。 Ｏｘａｍｆｌａｔｉｎ是一种新型ＨＤＡＣｉ，其原理是通过 ＨＤＡＣ的活性而提高组蛋白的乙酰化水平。目前， Ｏｘａｍｆｌａｔｉｎ的应用主要是作为一种抗癌药用于癌症 的治疗 。之后，Ｓｕ等 将牛的ＳＣＮＴ胚胎分别 用０ Ｍ、０．０５ Ｍ、０．５ Ｍ、１ Ｍ、５ Ｍ Ｏｘａｍｆｌａｔｉｎ 处理１２ ｈ，显著提高ＳＣＮＴ胚胎的重编程效率，降 低了胚胎凋亡相关基因Ｂａｘ的表达，提高了抗凋亡 基因Ｂｃｌ—ＸＬ的表达，增加了多能基因ＯＣＴ４和 ＳＯＸ２等相关基因的表达。本研究是在ｉＳＣＮＴ重 构胚融合／激活后，将重构胚培养在ＰＺＭ一３中，并 分别添加不同浓度的（０ｔｘＭ，０．０５ Ｍ，０．５ｉｘＭ， ５ＩｘＭ）Ｏｘａｍｆｌａｔｉｎ处理１２ ｈ，分裂率和囊胚率分别 在对照组以及各个处理组之间均无显著的差异。 笔者还对ｉＳＣＮＴ胚胎进行了不同时间的Ｏｘａｍｆｌａｔｉｎ 处理，随着处理时间的延长并未显著提高ｉＳＣＮＴ 的囊胚率。Ｓｕ等 的研究对象是牛的ＳＣＮＴ胚 胎，而我们的研究对象是水牛一猪ｉＳＣＮＴ胚胎，物 种的差异和试验过程中其它影响因素可能对早期 胚胎发育也有不同程度的影响。因此，Ｏｘａｍｆｌａｔｉｎ 对水牛一猪异种体细胞核移植胚胎的早期发育并 未有显著的效果。 ４ 结论 在本研究条件下，在ＰＺＭ一３中添加０．０５ Ｍ、 ２８６ 广西畜牧兽医 ０．５ ＩｘＭ、５ ＩｘＭ的Ｏｘａｍｆｌａｔｉｎ处理１２ ｈ及将处理时 间延长至１８ ｈ或２４ ｈ都未能显著提高水牛一猪 ｉＳＣＮＴ胚胎的早期体外发育。说明组蛋白去乙酰 化酶抑制剂（Ｏｘａｍｆｌａｔｉｎ）不能显著提高水牛一猪 ｉＳＣＮＴ胚胎发育的潜能。 参考文献 『１］童碧泉．水牛改良与奶用养殖技术问答［Ｍ］．北京：金 盾出版社，２０ｔ１．５２—５３． ［２］陆嵘，房静远．表观遗传修饰与肿瘤［Ｊ］．生命科学， ２００６，１８（１）：１０３—１０７． ［３］Ｓｈａｈｂａｚｉａｎ Ｍ Ｄ，Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎ Ｍ．２００７．Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ｏｆ ｓｉｔｅ— ｓｐｅｃｉｉｆｃ ｈｉｓｔｏｎｅ ａｃｅｔｙｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｅａｃｅｔｙｌａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，７６：７５—１００． ［４］Ｇａｂｅｒ Ａ，Ｏｘｌｅｙ Ｄ，Ｋａｒａｓ Ｊ，ｅｔ ａ１．Ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ ｇａｓｔｒｉｃ ｅｍｐｔｙｉｎｇ ｉｎ ｒｅｃｉｐｉｅｎｔｓ ｏｆ ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｐａｎｃｒｅａｓ— ｋｉｄｎｅｙ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｓ［Ｊ］．Ｄｉｇｅｓｔｉｖｅ Ｄｉｓｅａｓｅｓ，１９９１，６（９）： ４３７—４４３． ［５］Ｋｉｍ Ｙ Ｂ，Ｌｅｅ Ｋ Ｈ，Ｓｕｇｉｔａ Ｋ Ｊ，ｅｔ ａ１．Ｏｘａｍｆｌａｔｉｎ ｉｓ ａ ｎｏ— ｖｅｌ ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ｃｏｍｐｏｕｎｄ ｔｈａｔ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｈｉｓｔｏｎｅ ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅ［Ｊ］．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，１９９９，１８：２４６１—２４７０． ［６］Ｏｎｏ Ｔ，Ｌｉ Ｃ，Ｍｉｚｕｔａｎｉ Ｅ，ｅｔ ａ１．Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｃｌａｓｓ ＩＩｂ ｈｉｓｔｏｎｅ ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅ ｓｉｇｎｉｉｆｃａｎｔｌｙ ｉｍｐｒｏｖｅｓ ｃｌｏｎｉｎｇ ｅｆｉｆｃｉｅｎｃｙ ｉｎ ｍｉｃｅ［Ｊ］．Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，２０１０，６（８３）：９２９ —９３７． ［７］ｓｕ Ｊ Ｍ，Ｗａｎｇ Ｙ Ｓ，Ｌｉ Ｙ Ｙ，ｅｔ ａ１．Ｏｘａｍｆｌａｔｉｎ ｓｉｇｎｉｉｆｃａｎｔｌｙ ｉｍｐｒｏｖｅｓ ｎｕｃｌｅａｒ ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ，ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔ ｑｕａｌｉｔｙ，ａｎｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｂｏｖｉｎｅ ＳＣＮＴ ｅｍｂｒｙｏｓ［Ｊ］．Ｐｌｏｓ Ｏｎｅ，２０１１．６（８）：ｅ２３８０５． ［８］Ｙｏｓｈｉｏｋａ Ｋ，Ｓｕｚｕｋｉ Ｃ，Ｔａｎａｋａ Ａ，ｅｔ ａ１．Ｂｉｒｔｈ ｏｆ ｐｉｇｌｅｔｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｐｏｒｃｉｎｅ ｚｙｇｏｔｅｓ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｉｎ ａ ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ ｄｅ— ｉｆｎｅｄ ｍｅｄｉｕｍ［Ｊ］．Ｂｉｏｌ Ｒｅｐｒｏｄ，２００２，６６：１１２—１１９． 『９］Ｒｙｂｏｕｃｈｋｉｎ Ａ Ｄ，Ｋａｔｏ Ｙ Ｋ，Ｔｓｕｎｏｄａ Ｕ Ｋ．Ｒｏｌｅ ｏｆ ｈｉｓｔｏｎｅ ａｃｅｔｙｌａｔｉｏｎ ｉｎ ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ ｏｆ ｓｏｍａｔｉｃ ｎｕｃｌｅｉ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ｎｕｃｌｅａｒ ｔｒａｎｓｆｅｒ［Ｊ］．Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｒｅｐｒｏｄｃｔｉｏｎ，２００６，７４： １０８３—１０８９． ［１０］Ｓｈｉ Ｌ Ｈ，Ｍｉａｏ Ｙ Ｌ，Ｏｕｙａｎｇ Ｙ Ｃ，ｅｔ ａ１．Ｔｒｉｃｈｏｓｔａｔｉｎ Ａ （ＴＳＡ）ｉｍｐｒｏｖｅｓ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｒａｂｂｉｔ—ｒａｂｂｉｔ ｉｎｔｒａｓｐｅ— ｃｉｅｓ ｃｌｏｎｅｄ ｅｍｂｒｙｏｓ，ｂｕｔ ｎｏｔ ｒａｂｂｉｔ—ｈｕｍａｎ ｉｎｔｅｒｓｐｅｃｉｅｓ ｃｌｏｎｅｄ ｅｍｂｒｙｏｓ［Ｊ］．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｄｙｎａｍｉｃｓ，２００８，２３７ ２０１４年Ｖｏ１．３０（６） （３）：６４０—６４８． ［１１］Ｗａｎｇ Ｋ，Ｏｔｕ Ｈ Ｈ，Ｃｈｅｎ Ｙ，ｅｔ ａ１．Ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｔｒａｎ— ｓｃｒｉｐｔｏｍｅ ｉｎ ｒｈｅｓｕｓ・－ｂｏｖｉｎｅ ｉｎｔｅｒｓｐｅｃｉｅｓ ｓｏｍａｔｉｃ ｃｅｌｌ ｎｕｃｌｅ— ａｒ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｅｍｂｒｙｏｓ［Ｊ］．Ｐｌｏｓ Ｏｎｅ，２０１１，６（７）：ｅ２２１９７． ［１２］Ｈｉｍａｋｉ Ｔ，Ｙｏｋｏｍｉｎｅ Ｔ Ａ，Ｓａｔｏ Ｍ，ｅｔ ａ１．Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｔｒｉ— ｃｈｏｓｔａｔｉｎ Ａ ｏｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｔｒａｎｓｇｅｎｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ｓｏｍａｔｉｃ ｃｅｌｌ ｎｕｃｌｅａｒ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｅｍｂｒｙｏｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｔｒａｎｓ— ｇｅｎｉｃ Ｃｌａｗｎ ｍｉｎｉａｔｕｒｅ ｐｉｇ ｃｅｌｌｓ［Ｊ］．Ａｎｉｍａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｊｏｕｒ— ｎａｌ，２０１０，８１：５５８—５６３． ［１３］Ｓｕｇｉｍｕｒａ Ｓ，Ｎａｒｉｔａ Ｋ，Ｙａｍａｓｈｉｒｏ Ｈ，ｅｔ ａ１．Ｉｎｔｅｒｓｐｅｅｉｅｓ ｓｏｍａｔｉｃ ｃｅｌｌ ｎｕｃｌｅｕｓ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｗｉｔｈ ｐｏｒｃｉｎｅ ｏｏｃｙｔｅｓ ａｓ ｒｅｃｉｐｉ— ｅｎｔｓ：Ａ ｎｏｖｅｌ ｂｉｏａｓｓａｙ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ａｓｓｅｓｓｉｎｇ ｔｈｅ ｃｏｍｐｅｔｅｎｃｅ ｏｆ ｃａｎｉｎｅ ｓｏｍａｔｉｃ ｃｅｌｌｓ ｔｏ ｄｅｖｅｌｏｐ ｉｎｔｏ ｅｍｂｒｙｏｓ［Ｊ］．Ｔｈｅｒ— ｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ，２００９，７２（４）：５４９—５５９． ［１４］Ｈｅｚｒｏｎｉ Ｈ，Ｓａｉｌａｊａ Ｂ Ｓ，Ｍｅｓｈｏｒｅｒ Ｅ．Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ—ｒｅｌａｔ・ ｅｄ，ｖａｌｐｒｏｉｃ ａｃｉｄ（ＶＰＡ）一ｉｎｄｕｃｅｄ ｇｅｎｏｍｅ—ｗｉｄｅ ｈｉｓｔｏｎｅ Ｈ３一Ｌｙｓｉｎｅ ９（Ｈ３Ｋ９）ａｃｅｔｙｌａｔｉｏｎ ｐａｔｔｅｒｎｓ ｉｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｙｒ，２０１ １， ２８６：３５９７７—３５９８８． ［１５］Ｍｉｙｏｓｈｉ Ｋ，Ｍｏｒｉ Ｈ，Ｍｉｚｏｂｅ Ｙ，ｅｔ ａ１．Ｖａｌｐｒｏｉｃ ａｃｉｄ ｅｎ— ｈａｎｃｅｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ Ｏｃｔ一３／４ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｍｉｎｉａｔｕｒｅ ｐｉｇ ｓｏｍａｔｉｃ ｃｅｌｌ ｎｕｃｌｅａｒ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｅｍｂｒｙｏｓ［Ｊ］． Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ，２０１０，１２（１）：６７—７４． ［１６］Ｋｉｍ Ｙ Ｊ，Ａｈｎ Ｋ Ｓ，Ｋｉｍ Ｍ，ｅｔ ａ１．Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｐｏｔｅｎ— ｃｙ ｂｅｔｗｅｅｎ ｈｉｓｔｏｎｅ ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｔｉｒｃｈｏｓｔａｔｉｎ Ａ ａｎｄ ｖａｌｐｒｏｉｃ ａｃｉｄ ｏｎ ｅｎｈａｎｃｉｎｇ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｐｏｒｃｉｎｅ ｓｏｍａｔｉｃ ｃｅｌｌ ｎｕｃｌｅａｒ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｅｍｂｒｙｏｓ［Ｊ］．Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｃｅｌｌｕｌａｒ ＆Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ａｎｉｍａｌ，２０１１，４７（４）：２８３— ２８９． ［１７］Ｔｈｕａｎ Ｎ Ｖ，Ｂｕｉ Ｈ Ｔ，Ｋｉｍ Ｊ Ｈ，ｅｔ ａ１．Ｔｈｅ ｈｉｓｔｏｎｅ ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｓｃｒｉｐｔａｉｄ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｎａｓｃｅｎｔ ｍＲＮＡ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｓｃｕｅｓ ｆｕｌｌ—ｔｅｒｍ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｉｎ ｃｈｉｎｅｄ ｉｎ— ｂｒｅｄ ｍｉｃｅ［Ｊ］．Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，２００９，１３８：３０９—３１７． ［１８］Ｚｈａｏ Ｊ Ｇ，Ｒｏｓｓ Ｊ Ｗ，Ｈａｏ Ｙ Ｈ，ｅｔ ａ１．Ｓｉｇｎｉｉｆｃａｎｔ ｉｍ— ｐｒｏｖｅｍｅｎｔ ｉｎ ｃｌｏｎｉｎｇ ｅｆｉｆｃｉｅｎｃｙ ｏｆ ａｎ ｉｎｂｒｅｄ ｍｉｎｉａｔｕｒｅ ｐｉｇ ｂｙ ｈｉｓｔｏｎｅ ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ＇ａｆｔｅｒ ｓｏｍａｔｉｃ ｃｅｌｌ ｎｕｃｌｅａｒ ｔｒａｎｓｆｅｒ［Ｊ］．Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，２００９，８ １： ５２５—５３０．