未折叠蛋白反应 (1)

Peter Walter and David Ron

细胞分泌或展示在起表面的大多蛋白质进入它们折叠组装的场所内质网，只有合适的组装蛋白质才能从内质网进入细胞表面。细胞会根据需要来调节内质网内部蛋白质组装能力，从而确保蛋白质折叠的精确性。分泌蛋白或膜蛋白在它们被分派到内膜系统其他细胞器、分泌到细胞表面、或释放到胞外之前都在内质网腔内折叠、成熟。内质网通过激活包内信号转导来反应腔内未折叠蛋白的压力，这统称为未折叠蛋白反应（UPR）。而且，至少三种明显不同的UPR通路来调节各种不同基因的表达使内质网保持稳态或当内质网应激得不到消除时诱导细胞凋亡。最近研究进展给UPR的复杂机制及其在各种疾病中扮演的角色带来了一线光明。

分

泌蛋白或膜蛋白在它们被分派到内膜系统其他细胞器、分泌到细胞表面、或释放到胞外之前都在内质网腔内折叠、成熟。UPR，一种保守系统发生信号路径，是内质网的检测器，检测折叠能力的不足并，

感知错误折叠的胁迫，从而根据内质网状态来交流信息来调控振和基因表达。UPR的激活是通过对内质网膜表达的调节，用新合成的蛋白质折叠基质填充来满足需要。这种长期大范围转录调控伴随着进入内质网的蛋白质流量瞬间减少。这样UPR建立并维持的稳态的无数其他循环的一个范例。

复杂的细胞器安排发生元件的分子水平上得到阐明时，细胞生物学 进展才能完美体现。UPR就是其中一个例子，他详细表述的分子机制说明了一个真核细胞调控器内质网的能力。令人感到意外的是，由于这些机制的激增，关于UPR是如何与细胞生理杂乱的各方面协调并维持稳态的，这方面的发现的大门被打开了。 事实上，真核细胞所有用来与环境惊醒信息交流的蛋白都在内质网组装。它们传出传入的信息决定了器官的健康，比如传递细胞分裂、成熟、分化或死亡的信号。一个阈值来保证各部分组装的精确性，离开了这些质量控制集体就会陷入混乱局面。ER的基本功能就是运用对蛋白质的质量控制，使得只有经过正确折叠的蛋白质才能装入内质网囊泡被运网细胞表面。错误折叠蛋白滞留在ER内部，被排到细胞液后被蛋白酶体降解，这个过程成为内质网相关蛋白降解（ERAD）。ERAD在不能引起UPR的细胞中是必须的，这也体现了多台不能回到他原来的状态的重要性。

UPR的延长意味着ER应激没有得到缓和，稳态没有得到恢复，这关联细胞的生死。同时也说明，保证凋亡可能涉及防止机体退化，劣种细胞缺乏保证精确的信号组分。生死抉择基于内质网应激能否得到及时缓和，这也很好的解释了UPR在各种人类疾病中重要角色。如果细胞稳态失衡，杀死细胞对整体有利，UPR会是促使细胞凋亡的执行者，或是防治坏死细胞伤害机体的卫兵。蛋白质错误折叠造成的疾病种类有：视网膜炎，（一种视网膜发育过程中突变的视紫红质折叠导致的视网膜恶化的遗传病，另外一个例子是二型糖尿病，胰岛B细胞因为胰岛素产量过度要求而妥协。第二大类型涉及病毒感染，利用UPR来增加内质网组装能力来满足病毒的复制。相似的，有一种类型的癌症，尤其是分泌细胞的癌变，如多发性骨髓瘤利用UPR的细胞保护功能来满足自身增殖的需要。基于UPR活性结果分歧是否存在一个操作来治疗性的干预UPR还不清楚。所以发展UPR的信号传导分子机制的精确理解，并且研制有选择的调节通路步骤显得尤为重要。

三种UPR信号传导器

UPR主要的三种通路已被证明。所有通路格子新号传到通路平行进行。各通路根据一组内质网膜跨膜信号转道蛋白来命名：IRE1(抑制物阻抗性酯酶)、PERK(双键RNA依赖的蛋白激酶样内质网激酶)、ATF6(活性转录因子6)内质网膜上三种起信号转传导作用的跨膜蛋白。IRE1通路存在低等生物中最为保守的通路。伴随进化多细胞生物中才有了PERK和ATF6通路。不同的细胞类型中UPR有不同的体现。而且多重多样的基因编码ATF6家族蛋白，不如动物细胞中两类IRE1同源，暗示细胞类型的分化仍旧不得解。无论那种通路的激活都会导致b-ZIP 转录因子的产生，单独作用或相互合作来激活靶基因。

ATF6是最初被合成的内质网膜跨膜蛋白，是能够大量内质网域的转录因子。未折叠蛋白一旦累积，ATF6就被装入运输囊泡，被运往高尔基体。在高尔基体ATF6被两个蛋白酶S1P和S2P水解，自由的N末端进入细胞核并激活UPR靶基因。ATF6靶基因重要内质网腔内蛋白和内质网折叠有关。例如，Bip(热休克蛋白家族的一员)。蛋白质二硫键异构酶和葡萄糖调节蛋白94（GRP94;Hso90家族的一员）。固醇调节元件结合蛋白是哺乳动物控制固醇生物合成的转录因子ATF6用和SREP相同的酶。然而，SREP在内质网内部调控机制很好理解，ATF6如何应答ER应激的机制就鲜为人知了。它的ER腔内没有显示与其他蛋白的同源性。ATF6和BIP

有关联，BIP在ER应激中的作用有助于UPR的激活。ATF6在内质网腔内包含分子二硫键的连接,ER内环境氧化还原感受器的作用。

UPR的第二个信号通路是由内质网跨膜蛋白PERK介导的。内质网应激时，PERK形成同源二聚体并且自身磷酸化，普通翻译起始因子的a亚基eIF2a,间接抑制eIF2a，并抑制mRNA的翻译。从而，eIF2被限制，一些包含开放5‘端的开放阅读框mRNA却被翻译。其中就有编码ATF4的。两个重要靶基因 ATF4驱动的是CHOP和是一个控制编码诱导凋亡基因的转录因子。UPR的PERK通路试试强有力的保护性信号通路又能诱导细胞凋亡。此二元物极可能在eIF2 a磷酸化水平时表达，对其进行磷酸化处理的结果就是例证。GADD34编码一个PERK诱导元件磷酸化蛋白PPIC抵抗PERK通过去磷酸化选择性的抑制GADD34-PP1C复杂化，通过小分子对GADD34的删除来保护细胞应对ERS通过延长低水平磷酸化。如果GADD34受到危害基本被删除，这一致命结果有磷酸化造成，可见稳定的重要性。 UPR 的第三条通路因存在于酵母中而得名，是研究的最为清楚的一个通路。IRE1是生物功能跨膜蛋白，具有核酸酶活性，它用独特机制拼接mRNA,传递UPR 信号。随着之后内质网膜上的寡聚化造成构想的改变，IRE1在两个特殊位点切除一段基因来编码相应的UPR转录因子，称为XBP1(X-BOX结合蛋白1)。剩余的外显子被连接在一起（存在于酵母中的RNA连接酶，一种或多种未见于哺乳动物细胞中的酶）转为一个拼接好的mRNA,可用于有活性的转录因子（XBP1s有标记物提示它是拼接后的RNA产物)酵母中，IRE1协助UPR基因的表达，然而在动物细胞中，诱导UPR转录因子间有冗余。尽管如此，XBP1S在知道脂类生物合成酶方面的扮演着重要角色。

对IRE1激活的分子机制的深入研究

结构和生物物理实验提供了IRE1激活的地详细视图。RNA核酸酶激活过程：从无活性单体组装成紧密连接的二聚体进一步折叠成高度有序的低聚体。在激活过程中IRE1自身磷酸化，IRE1单体间 头对头相互作用，这样中符合有助于激活反相磷酸化，但是二聚体RNA核酸酶位点不组装状态。IRE1单体反响磷酸化为寡聚体可能仍在继续。IRE1激活新欢的磷酸化作用及其他蛋白激酶，增进核酸酶与其激酶位点的结合。然而，IRE1的磷酸化状态可能会以其他方式改变活性。IRE1低聚物结构部分磷酸盐形式稳定盐桥连接单体，表明磷酸化在IRE1激活中很重

要。PERK及其他激酶通常传递信号不通过磷酸化反应，IRE1的激酶活性可能被完全绕过去。酵母中，没有IRE1蛋白激酶活性的突变体，在未折叠蛋白反应累积时，保持寡聚体状态仍能够拼接RNA并介导mRNA拼接，虽然程度有些减弱。令人惊讶的是,这些突变体在关闭的延迟剪接反应后应对ER应激。未能正确地灭活IRE1不当延长UPR信号,降低细胞UPR引起的条件下生存。因此,自身磷酸化是一个关键的特性UPR自我平衡的反馈循环。早些添加磷酸盐有助于稳定IRE1寡聚物形式和为进一步激活配体开放结合位点。磷酸盐晚些 加入的可能使低聚物受到破坏,也许只是简单在低聚物之间建立电荷斥力或是因为其他因素提供结合位点帮助低聚物的解体。这种机制可能促进，向磷酸化的IRE1之间的嵌入到激活的低聚物和过度磷酸化而解体，这两者的之间的一个动态平衡。

有越来越多的证据表明使IRE1激活的阈值综合可以通过各种方式调解。例如,结合到IRE1的激酶位点上的小分子可以被不同的催化剂抑制或激活。这些化合物的绑定被认为保守的蛋白激酶:在两个构想状态之间的转换“aC-helix”和“aC-helix。“在第一个构象,IRE1倾向于二聚体化并被激活第二种构想中倾向于抑制激活的。因此IRE1的激酶域作为一个包含有配体的构象模块,可以调节激活阈值。这为IRE1提供了一种由核苷酸调节的方法(或者其他涉及核苷酸结合域的代谢分子)。通过寡聚化和激活反应的调节在酵母IRE1在低聚物界面上有第二配体结合位点,到目前为止,只见于体外。

IRE1与底物的相互作用

目前的研究把注意力放在由IRE1靶向XBP1Mrna的作用机制。在芽殖酵母中，HAC1mRNA(酵母中的XBP1同源物)在其必须的且能足够集中激活的IRE1的3′非翻译区包含一个目标信号。相反，在哺乳动物细胞中，XBP1u相比之下,哺乳动物的XBP1u,是由未经剪切的 XBP1mRNA翻译过来的蛋白质，在c端包含有疏水多肽段， 可以作为将XBP1u-转化多核糖体带到膜表面的信号序列。植物细胞中的bZIP60是 XBP1的同源物，也是尤为间接的mRNA翻译而来，且 靶向内质网膜成为其内嵌蛋白膜。这两种情况下,拼接改变的是开放阅读框疏水的目标序列没有被翻译,致使产生可溶性的转录因子。因此,bZIP60和ATF6之间存在有趣的相似之处都是mRNA拼接或蛋白质水解使得内质网驻留蛋白感应到并引发UPR反应产生的转录因子。酵母IRE1的细胞质激酶/核糖核酸酶域表现出很大活性，动力学角度说明

两个或更多IRE1分子只有组装才能表现完全的酶活性。荧光标记IRE1融合蛋白的寡聚化在光学显微镜下是可见的，当UPR被激活动态的内质网膜上的离散点集聚直到允许荧光团之间荧光能量传递的接近程度。一个基于活性的寡聚体的IRE1蛋白质作用面的晶体结构模型，当IRE1二聚体堆叠在一个低聚物时形成，并稳固核糖核酸酶活性部位,提供一个直观的说明了聚合反应和酶的激活可能是耦合的。因为它的互作特性,IRE1核糖核酸酶激活性会突然达到临界阈值浓度， IRE1的胞质模块,有一种类似开关属性。在细胞内,许多IRE1模块产生的信号，这样的二进制输出会累积成能体现输出信号的强度的反应这对稳态的维持是非常有用的。只要将内质网多个位置上的信号进行集成，这种综合信号就会发生，可以随时有效的清点激活的IRE1集群的个数。

UPR激活过程中未折叠蛋白感受和选择模块

为了感受内质网腔内未折叠蛋白，UPR信号蛋白一定和内质网腔感应域相互作用。然而所有蛋白都以未折叠状态进入内质网。所以，IRE1、PERK和ATF6被激活的阈值一定要协调。早期研究表明，IRE1和PERK都以单体的非激活形式与BIP结合，未折叠蛋白竞争性与BIP结合，BIP 更倾向于与腔域分离，使IRE1和PERK自发低聚化。然而随后对酵母的研究显示，不能结合Bip的突变体去可以有效激活UPR，意味着IRE1可以不依赖Bip而独立发挥调控作用。另有模型表明，IRE1以激活配体的形式见解和未折叠蛋白结合。包含为了平衡而留有凹槽的酵母IRE1腔域支持直接结合的模型。IRE1结合未折叠蛋白扩大缩氨酸引发IRE1腔域的低聚化，最近的这一证据更好地支持了间接作用的观点。哺乳动物的IRE1腔 域以一种闭合结合凹槽，其晶体结构说明凹槽的开闭引发结构的改变，从而引起IRE1的激活。不是提供UPR激活开关，IRE1腔域与Bip的相互作用可能扮演着作为单体间的缓冲这一微妙的角色。因此，稳定在一个适当水平使IRE1单体集中直到能够被未折叠蛋白配体的结合，尽管未折叠蛋白识别通常被认为是UPR的激活的，第一个模块越来越多证据说明腔域并不能控制IRE1的激活。奇怪的是，在脂类的合成过程中将腔域删除或用亮氨酸拉链替换后，IRE1仍可被诱导，内质网膜环境一旦紊乱，人造二聚体可为IRE1的二聚体化提供基板。相似的，如果内质网腔中只有少数几个氨基酸的内质网尾部锚定蛋白，ATF6（而不是IRE1）选择性的被激活。

区别于未折叠蛋白引起的UPR,由激活元件引起的转录很稳定，这也强化了个别UPR分支更好的激活改变反应这一概念。另一个例子是，在B细胞分化为浆细胞的过程中。IRE1信号传递可能并不依赖与ER腔对未折叠蛋白的感应。由于浆细胞要分泌大量免疫物质，ER的作用被放大，因此这个发展的趋向对XBP1s的表达使很必须的。意外的是，UPR感应早与可测量的免疫蛋白的表达，表明这种情况下，IRE1的激活可能被一种开关驱动而不是分泌通路的ER超负荷。的确，突变B细胞不产生免疫蛋白除非诱导IRE1来应对分化信号，这个例子中，UOR作为一个模型，细胞有刀开关可能并不是起源于内质网腔，相反，传统的激活模块，ER内状态反应。

非传统的UPR调节

由IRE1介导的对 XBP1mRNAis拼接非常特殊。在出芽酵母中同源物HAC1 mRNA的是唯一可识别IRE1的底物,在动物细胞中除了XBP1mRNA在没有其他mRNA可以依赖IRE1进行拼接。极为特别的mRNA与IRE1接触方式与可以把RNA切割成多样形式的并行模式截然不同。叫做RIDD(调节依赖IRE1的衰减)的通路，在动物细胞中派往ER的mRNA降解，可能起到限制内质网蛋白流量的作用，延长的UPR感应后未折叠蛋白进入内质网腔。人们通常认为，mRNA首先在XBP1mRNA中保护较好的拼接位点上被核苷酸酶切割，而不是展示一个可识别的共有序列，因此极可能退化。自由的末端的产生为细胞质分泌物的被外切核酸酶的降解。通过去偶联小分子 XBP1mRNA来自于RIDD的拼接，提出了一个可能那就是，IRE1如何在混杂和明确的模块切割间转换。有一种可能性是，本质上IRE1有两种不同的状态，而被束缚它的激酶域和配体掌控。另外一种假设是，IRE1的混合模块更简单的反映了RNA酶激活的等级，即潜在的ER应激的强度及持续时间的反应，估计是有高度有序组装的二聚体介导的，多重的结合位点来满足提高活性的要求。 RIDD和转化抑制应对由PERK诱导eIF2a磷酸化而发生的RIDD和翻译抑制在减少进入ER的蛋白流量方面有相似的结果。这两者都是受到精确调控的，因为过度的激活对细胞的生存是不利的。减少蛋白质进入内质网的负荷必须与维持足够的蛋白折叠需要和其他在内质网组装必要蛋白质保持平衡。的确, 如果我们考虑到这两个元件都准备发挥局部防止:RIDD目标被集群的IRE1激活,而磷酸化可能目标是被PERK激活的eIF2a分子。RIDD与 eIF2a磷酸化之间的相似之处可能更多。

我们推测,在正常细胞生长条件,ER内折叠的能力和需求的细微的波动可能被限制在确定的范围内而不是影响整个细胞器, PERK和RIDD的局部激活可能在允许空间内的稳态调节。这与受三条通路影响综合细胞内各种信号而激活转录程序的全局控制形成对照。总的来说，基因表达的改变造成他们的行动反过来又影响细胞。

持续的ER应激的后果

做出是否凋亡的抉择时，对内质网UPR细胞整体范围内信号的整合尤为重要。是否存在单一或多个机制在ERS时诱导细胞凋亡还不清楚。较为引起关注的说法是，三个UPR通路提供相反的信号，而ERS为得到缓和时，较为及时的感应改变保护性的存活还是凋亡之间的平衡。例如，当ERS延续时IRE1信号变得很微弱，同样的，PERK通过诱导GADD34的表达来弱化自身的作用。这样两个通路都包含自带的定时器极可能有助于生存和凋亡的选择。因为UPR的组成部分：IRE1 、XBP1、PERK和ATF6他们自身又受到UPR转录调控，调控机制的复杂性和解密其机制的挑战性更加增强。而且，细胞凋亡是慢性ERS的唯一可能结果。对大量分泌胶原蛋白的软骨细胞的研究，显示从分泌细胞去分化可能对应对适应ERS很重要。这说明慢性ERS 致病特征可能不只在细胞凋亡水平更有可能在改变细胞功能时表现出来。

结论

在ER中的蛋白质折叠过程中，UPR扮演者保护细胞抵抗伤害的角色。各种机制共同起作用，细胞要小心的平衡各方面的作用，使细胞免受蛋白毒性同时提供足够的蛋白合成来维持健康。尽管在该领域已经取得了巨大进展，很多基本原理还不得而解，UPR在人类疾病中的潜在影响使得以治疗性干预为目标的UPR信号的阐明大有希望。

图.信号网络中心元件的简单线路图。ERS激活应激感受器ATF6，IRE1和PERK，呈现了UPR三个分支。对每个感受器的激活都会产生相应的转录因子（ATF6N,XBP1，和ATF4）来增强ER内蛋白折叠的能力。IRE1(通过RIDD)和PERK(通过eIF2的磷酸化)都会降低进入内质网的蛋白流量。两者作用的结果都是应对ERS的反馈循环。如果细胞不能回复稳态而是延长ERS（被计时器记录）细胞就会凋亡。

图.激活的预测模型。图中描述了多个IRE1细胞腔内质网感应压力区域(A)的多个结构和IRE1胞质激酶主要未解决的问题 原体(步骤1)参与细胞膜的平面的构建。 ER腔域可能形成一个封闭的二聚物，位于一个封闭的多肽槽,以及核糖核酸酶域(C),对应由IRE1可能被内质网内腔积累的未折叠蛋白质激活一个假设序列(B)。IRE1图.2.(从A到C) UPR的三个通路。三个信号传导感受器家族（ATF6，因此阻止进一步寡聚化 (40)。针对蛋白质错误折叠(步骤2),腔内区域将重新排列允许展开蛋白质绑定PERK和IRE1）感受ER腔的蛋白质折叠情况并传递信息，致使bZIP 1、 内质网内未折叠和错误折叠蛋白的毒性基础是什么？ (绑定的多肽槽用红色标出),进一步寡聚化(38),导致内质网膜胞质侧接触的激酶/mRNA酶域的相互反转录调节器进入细胞核驱动UPR靶基因的转录。每个通路都利用不同的信2、 我们怎么才能定义和实验性的测量内质网内未折叠蛋白的压力？ER分子伴侣如何应。这样的反应非磷酸化晶体人类的IRE1也被观察到，并且可能对应于自磷酸化复合物复合体(25)。参考文献及注释： 号传导机制：ATF6与非折叠蛋白相互作用的？ 调节蛋白质水解，PERK翻译水平控制，而IRE1通过非在转自我磷酸化后,IRE1形成连续的二聚体(步骤3)(24),堆砌成低聚物(步骤4)(23)。固定的IRE1激常规的mRNA除转录应答增加ER折叠能力外PERK 和IRE1都分别3、 内质网膜上激活的IRE1 拼接。和PERK的超微结构是什么？这些信号平台的其他部分都1. D. Ron, P. Walter, Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8, 519(2007). 酶域(黄线所示)包含一个绑定Mg-二磷酸腺苷复杂物(23或激酶抑制剂(24)用绿色显示。mRNA酶的活性范围内的mRNA来减少蛋白折叠路径。 有什么？ 通过下调翻译和减少ER2. S. Schuck, W. A. Prinz, K. S. Thorn, C. Voss, P. Walter,J. Cell Biol. 187, 525 (2009). 部位位于两个mRNA酶单体之间的间隙(用紫色显示，组氨酸催化剂用红色所示)在IRE1背靠背再组装成4、 IRE1激酶域 除了它本身外有没有其他效应器？ 3. D. T. Rutkowski, R. S. Hegde, J. Cell Biol. 189, 783(2010). 5、 ATF6如何被激活的? 4. S. M. Hurtley, D. G. Bole, H. Hoover-Litty, A. Helenius,C. S. Copeland, J. Cell Biol. 108, 2117 (1989). 二聚物和低聚物（A）中结构所示2HZ6和2BE1;(C)中显示3P23、2RIO和3FBV.(D)激活的，低聚物的IRE1可在荧光显微镜中成为可见的的离散焦点在酵母(酿酒酵母)和哺乳动物细胞(HEK293)。 6、 我们怎么才能使UPR三个通路中的靶基因分布合理化？朝着专门化方向的进化趋5. L. Ellgaard, A. Helenius, Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 4, 181(2003). 势是什么？ 7、 RIDD和PERK介导的反应水平的调控受空间的限制吗？ 8、 什么机制可以详细的区分IRE1介导的RNA 拼接和RIDD? 9、 有没有一个治疗窗口可以通过对UPR的操作来治疗人类疾病？ 10、 IRE1, PERK, and ATF6是如何感知内质网膜的反常的？ 6. M. H. Smith, H. L. Ploegh, J. S. Weissman, Science 334,1086 (2011). 7. K. J. Travers et al., Cell 101, 249 (2000). 8. I. Tabas, D. Ron, Nat. Cell Biol. 13, 184 (2011).

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