GST纯化蛋白

（准备工作：灭离心管上面没有刻度，有塞子的管子。很小的三角烧瓶，用锡箔纸封口）

（1）已经转化的菌液，或者重新转化BL21（DE3）pLysS （2）活化：取20μl菌液加入11ml LB（Ampr）（500倍稀释），37°C，250rpm，过夜（16 h）

（3）取10ml菌液加入100ml LB（Ampr）（10倍稀释）（剩余菌液4°C保存） （4）37°C，250 rpm，1 h 10 min-1 h 20 min，OD600 0.6-0.8（OD600小于1.0即可） （5）取1ml菌液作为诱导前对照，冰上放置 （6）加入IPTG，终浓度1 mM （7）30°C，250rpm，诱导适当时间（预实验确定）章foxa2 16℃过夜 sirt1 25℃过夜 （8）取1ml菌液作为诱导后对照，连同诱导前菌液，12000rpm，离心2min，收集菌体，加入100μl 1×SDS上样缓冲液

（9）其余菌液，分为两份，倒入50ml离心管，5000rpm，离心20 min，收集细胞 （10）每管加入8-10ml GST裂解缓冲液重悬菌体，转移小烧杯中（无气泡）注:配GST时最后加PMSF能够减少很多泡沫。加PMSF，蛋白酶抑制剂，溶菌酶。

（11）超声破碎细胞：超声3s，间隔10s，40次左右，超声强度200-300W（冰浴） （12）将超声后菌液转移到50ml离心管中，4°C，13000rpm，离心20-30min （13）将上清转移到1个50ml离心管中，取出50μl，加入10ul 5×SDS上样缓冲液（其余上清-80°C保存）

（14）将沉淀加入16-20ml GST裂解缓冲液（或PBS）重悬，取出50μl，加入50μl 2×SDS上样缓冲液（其余沉淀-80°C保存）

（15）将四个样品煮沸3min，12000rpm，离心5min

（16）8-10%SDS-PAGE检测诱导、超声是否合适，30μl上样，顺序：诱导前菌体、诱导后菌体、超声后上清、超声后沉淀 注：如果蛋白在沉淀中说明形成包涵体，不容易纯化。

（17）考马斯亮蓝染色

（18）电泳的同时 混匀glutathione sepharose beads（4B）（mixed slurry），取200μl加入15ml离心管中（2份） （19）加入10ml PBS，混匀，3000rpm，离心3min，弃上清 （20）加入超声后上清液，4°C轻柔摇荡60分钟（或过夜）（横放） （21）4°C，3000rpm，离心3min （22）10ml GST裂解缓冲液洗涤2次（冰上）GST裂解液加PMSF，ＤＴＴ，蛋白酶抑制剂。每次4℃摇床7分钟，3000rpm离心5分钟。 （23）10ml TBS（含5mM MgCl2、1mM DTT）洗涤2次（冰上） （24）弃上清，加入1倍柱床体积的TBS（含5mM MgCl2、1mM DTT、50%甘油），混匀 （25）取悬液测定蛋白浓度或SDS-PAGE(煮蛋白的时候，蛋白就会从GST珠子上掉下来离心上样时吸取上清) （26）-20°C保存beads

（如果就是纯化蛋白不做下面的pull down就用GSH洗珠子，让其竞争性结合珠子，摇床离心取上清，蛋白要-80℃取上清，最后将上清，珠子都取出一些做考马斯亮蓝染色看看有没有将珠子从GST上洗脱下来） [附录]

GST裂解缓冲液（前四个组分配好之后4°C保存，DTT和蛋白酶抑制剂现用现加）

配方一 150mM NaCl 20mM HEPES pH7.5 5mM MgCl2 1% TritonX-100 1mM DTT 1mM PMSF inhibitor cocktail 配方二 200mM NaCl 25mM HEPES pH7.5 2mM DTT 1mM PMSF inhibitor cocktail 500ml贮存液 10ml工作液 10ml贮存液 20μl 1M DTT 10μl 1M PMSF 10μl inhibitor cocktail 500ml贮存液 15 ml 5M NaCl 20ml 0.5M Hepes pH7.5 10ml 1M MgCl2 5ml 100% Triton-X 100 10μl 1M DTT 34μl 0.3M PMSF 10μl inhibitor cocktail 10ml贮存液 10ml工作液

TBS（含5mM MgCl2、1mM DTT） 150mM NaCl 20mM Tris pH7.6 5mM MgCl2 1mM DTT 500ml 贮存液 15ml 5M NaCl 10ml 1M Tris pH7.6 0.5M MgCl2 1M DTT